平成31年 2月
三島睦夫 学位論文審査要旨
主 査 難 波 栄 二 副主査 谷 口 晋 一 同 久 留 一 郎
主論文
Effects of uric acid on the NO production of HUVECs and its restoration by urate lowering agents
（尿酸のヒト臍帯静脈内皮細胞のNO産生に及ぼす影響と尿酸降下薬による回復）
（著者：三島睦夫、濵田紀宏、Maharani Nani、池田信人、大野原岳史、野津智美、
二宮治明、宮崎聡、水田栄之助、杉原志伸、加藤雅彦、荻野和秀、桑原政成、
廣田裕、吉田明雄、大谷直由、安西尚彦、久留一郎）
平成28年 Drug Research 66巻 270頁～274頁
参考論文
1. A vasodilating β1 blocker celiprolol inhibits muscular release of uric acid precursor in patients with essential hypertension
（血管拡張性β1遮断薬セリプロロールは本態性高血圧患者の骨格筋由来尿酸前駆物質 の放出を抑制する）
（著者：水田栄之助、Sulistiyati Bayu Utami、太田原顕、遠藤哲、三島睦夫、
長谷川輝、山田健作、加藤雅彦、山本一博、荻野和秀、二宮治明、宮崎聡、
濵田紀宏、谷口晋一、程継東、久留一郎）
平成25年 Hormone and Metabolic Research 45巻 69頁～73頁
2. Effects of cilnidipine on serum uric acid level and urinary nitrogen monoxide excretion in patients with hypertension
（高血圧患者における血清尿酸値と尿中一酸化窒素排泄に関するシルニジピンの作用）
（著者：濵田紀宏、山田健作、水田栄之助、渡邊ありさ、尾崎知博、石田勝則、
長谷川輝、坂田晋史、三島睦夫、荻野和秀、野坂美仁、宮崎聡、太田原顕、
二宮治明、加藤雅彦、吉田明雄、谷口晋一、山本一博、久留一郎）
平成24年 Clinical and Experimental Hypertension 34巻 470頁～473頁
3. Protective effects of topiroxostat on an ischemia-reperfusion model of rat hearts
（ラット心臓の虚血再灌流モデルに対するトピロキソスタットの保護効果）
（著者：丹野翔伍、山本堅志郎、倉田康孝、足立真彩、井上裕美子、大谷直由、
三島睦夫、山本康孝、桑原政成、荻野和秀、三明淳一朗、二宮治明、白吉安昭、
岡田太、山本一博、久留一郎）
平成30年 Circulation Journal 82巻 1101頁～1111頁
学 位 論 文 要 旨
Effects of uric acid on the NO production of HUVECs and its restoration by urate lowering agents
（尿酸のヒト臍帯静脈内皮細胞のNO産生に及ぼす影響と尿酸降下薬による回復）
高 尿 酸 血 症 は 血 管 内 皮 機 能 障 害 の 危 険 因 子 と 成 り 得 る 。 そ の 機 序 と し て 尿 酸 が 血 管 内 皮 細 胞 の N O 産 生 を 減 少 さ せ る こ と が 推 定 さ れ て い る が 、 そ の 詳 細 は 不 明 で あ る 。 最 近 、 可 溶 性 尿 酸 が 尿 酸 輸 送 体 （ UATs） を 介 し て 細 胞 内 に 蓄 積 し 血 管 炎 症 を 惹 起 し 、 尿 酸 輸 送 体 の 阻 害 薬 で あ る プ ロ ベ ネ シ ド が 、 こ れ を 減 弱 し 得 る と の 報 告 が あ る 。 本 研 究 で は 、 ヒ ト 臍 帯 静 脈 内 皮 細 胞 （ HUVECs） を 用 い 、 尿 酸 が UATsの 活 性 化 を 介 し て 細 胞 内 で NO 産 生 を 障 害 す る と い う 仮 定 を 立 て て 、 UATs阻 害 薬 で あ る べ ン ズ ブ ロ マ ロ ン 、 ロ サ ル タ ン 、 イ ル ベ サ ル タ ン の 存 在 と 非 存 在 下 で の 尿 酸 に よ る HUVECsの NO 産 生 と 内 皮 型 NO合 成 酵 素 （ eNOS） タ ン パ ク 質 の 発 現 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 分 子 生 物 学 的 、 生 化 学 分 析 を 用 い て 検 証 し た 。
方 法
培 養 HUVECsを 用 い て RNAを 抽 出 し 、UATsの mRNA発 現 を RT-PCRを 用 い て 検 討 し た 。 ベ ン ズ ブ ロ マ ロ ン 、 ロ サ ル タ ン 、 イ ル ベ サ ル タ ン の 存 在 下 並 び に 非 存 在 下 で HUVECsを 24時 間 尿 酸 7 mg/dlに 暴 露 し た 後 に 、 培 養 液 中 で の NO産 生 と HUVECsの eNOS蛋 白 発 現 を 検 討 し た 。N O 産 生 は N O 特 異 的 色 素 を 用 い て 、そ の 蛍 光 を マ イ ク ロ プ レ ー ト 蛍 光 リ ー ダ ー に よ り 測 定 し た 。 HUVECsの eNOSお よ び リ ン 酸 化 eNOSの 蛋 白 発 現 は そ れ ぞ れ の 特 異 的 抗 体 を 用 い て ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り 検 出 し 、 そ の 信 号 を NIH image J Softwareを 用 い て 定 量 化 し た 。 統 計 解 析 は 、 分 散 分 析 （ ANOVA） と 5%有 意 水 準 で の チ ュ ー キ ー 法 を 用 い て 多 群 間 で 比 較 し た 。
結 果
HUVECsに は URATv1、 ABCG2、 MRP4、 MCT9と い う 4種 類 の UATsmRNAが 発 現 し て い た 。 そ こ で 、 尿 酸 へ の 暴 露 が 尿 酸 取 り 込 み 型 輸 送 体 URATv1の 阻 害 薬 で あ る ベ ン ズ ブ ロ マ ロ ン 、 ロ サ ル タ ン 、 イ ル ベ サ ル タ ン の 存 在 下 並 び に 非 存 在 下 で
HUVECsの NO産 生 能 に 及 ぼ す 効 果 を 検 討 し た 。 尿 酸 へ の 暴 露 は コ ン ト ロ ー ル に 比 較 し て HUVECsで の NO産 生 を 有 意 に 低 下 さ せ た が 、 ベ ン ズ ブ ロ マ ロ ン 、 ロ サ ル タ ン 、 イ ル ベ サ ル タ ン 存 在 下 で は 尿 酸 へ の 暴 露 は HUVECsで の NO産 生 を 抑 制 し な か っ た 。 次 に HUVECsの eNOS発 現 と そ の リ ン 酸 化 に 及 ぼ す 尿 酸 暴 露 の 効 果 を 検 討 し た 。 尿 酸 へ の 暴 露 は コ ン ト ロ ー ル に 比 較 し て 有 意 に リ ン 酸 化 eNOSの 発 現 を 低 下 さ せ た が 、 total eNOS発 現 に は 影 響 し な か っ た 。 ベ ン ズ ブ ロ マ ロ ン 、 ロ サ ル タ ン 、 イ ル ベ サ ル タ ン 存 在 下 で は 、 尿 酸 へ の 暴 露 は HUVECsの リ ン 酸 化 eNOSの 発 現 を 有 意 に 回 復 さ せ た 。
考 察
HUVECsに は 4種 類 の 尿 酸 取 り 込 み 型 輸 送 体 と 排 出 型 輸 送 体 が 発 現 し 、高 尿 酸 血 症 条 件 下 で は eNOSの リ ン 酸 化 が 抑 制 さ れ 、 NO産 生 が 阻 害 さ れ る こ と が 判 明 し た 。 さ ら に URATv1阻 害 薬 で あ る ベ ン ズ ブ ロ マ ロ ン 、 ロ サ ル タ ン 、 イ ル ベ サ ル タ ン は 尿 酸 に よ り 誘 導 さ れ る HUVECsの eNOSリ ン 酸 化 障 害 と NO産 生 障 害 の 両 方 を 有 意 に 回 復 す る こ と が で き た こ と か ら 、 細 胞 内 の 尿 酸 レ ベ ル が 主 に URATv1に よ っ て 調 節 さ れ 、 高 尿 酸 濃 度 条 件 下 で URATv1を 介 し て 細 胞 内 に 流 入 し た 可 溶 性 尿 酸 に よ り 血 管 内 皮 機 能 障 害 が 生 じ る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。
以 上 の 事 実 は 尿 酸 輸 送 体 URATv1の 阻 害 薬 で あ る ベ ン ズ ブ ロ マ ロ ン 、 ロ サ ル タ ン 、 イ ル ベ サ ル タ ン に よ り 、 高 尿 酸 血 症 に 合 併 す る 内 皮 機 能 障 害 が 改 善 す る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
結 論
尿 酸 は URATv1を 介 し て HUVECsで の eNOSの リ ン 酸 化 と NO産 生 の 障 害 を 惹 起 す る が 、 URATv1阻 害 薬 の 前 投 与 は こ れ ら を 回 復 さ せ た 。
