新技術説明会　様式例

難治性がんオルガノイドを用いたスクリーニング技術

による新規抗腫瘍薬の開発

慶應義塾大学 薬学部 薬物治療学講座

准教授 齋藤 義正

2019年9月3日 1

胆道がんについて

 肝内胆管から十二指腸乳頭に至る胆道に発生する悪性腫瘍。  日本人に多く、増加傾向にある（日本人がん死亡数の第6位）。  早期発見が難しく、5年生存率は約20%と予後も極めて不良である。  Gemcitabineによる化学療法が胆道がんの標準治療となっているが、多くの症 例が治療抵抗性を示し、化学療法による根治はほとんど望めない。 2

• オルガノイドは生体内の組織と高い類似性を示しており、従来の血清を含む培 地で2次元培養を行う細胞株よりも薬剤感受性スクリーニングなどに適している。 • この培養技術を用いてマウス正常腸管上皮およびApcmin_{マウス由来の腸管腫} 瘍から採取した幹細胞がオルガノイド（組織構造体）を形成することを確認した。 Apcmin_{マウスの腸管腫瘍から} の幹細胞の分離・培養 マウス腸管上皮幹細胞の オルガノイド培養

オルガノイド培養

幹細胞マーカーであるLGR5に着目し、R-spondin1などの幹細胞維持に必須な 増殖因子のみを加えた無血清培地を用いてマトリゲル（基底膜マトリックス）中 で行う幹細胞の3次元培養。 3

胆道・膵臓がん組織からのオルガノイドの樹立

膵臓がん 肝外胆管がん 肝内胆管がん 胆嚢がん 4

長期継代培養（1年以上）が可能となった胆道・膵臓がん オルガノイドの臨床情報およびドライバー遺伝子変異 1. 肝内胆管がん（70歳女性） 2. 膵臓がん（46歳女性） 3. 肝内胆管がん（80歳男性） 4. 胆嚢がん（41歳女性） 5. 肝内胆管がん（46歳男性） 6. ファーター乳頭部神経内分泌がん（74歳男性）

TP53 KRAS TGFBR2 CDKN2A IDH1 CTNNB1 APC SMAD4

1 314 70 F IHCC, adeno, mod R175H G12V 125 FS

2 2T 46 F PDA, poorly H140Y G12D 529FS

3 9T 80 M IHCC, adeno, poor to mod 302 FS R132L

4 21T 41 F GBC, adeno, well G245S G12S S45F

5 26T 46 M IHCC, adeno, mod C242F W15*

6 44T 74 M NEC, poorly Q61R R232*

IHCC, intrahepatic cholangiocarcinoma; adeno, adenocarcinoma; well, well differentiated; mod, moderately differentiated; poor, poorly differentiated; GBC, GB cancer; NEC, neuroendocrine carcinoma; PDA, pancreatic ductal adenocarcinoma; FS, frameshift; *, stop colon

Patient Information and Driver Gene Mutations

Age Sex Diagnosis

Driver gene mutation (amino acid chage) No.

肝内胆管がん組織からのオルガノイドの樹立

9T IHCC P-M/D 24T IHCC M/D 1T IHCC M/D A

B Primary tissue (HE) Organoid (HE) Organoid (Bright field)

C CK7 MUC1 PAS HE Primary tissue CK7 MUC1 PAS HE Organoid

Surgically resected IHCC tissue specimen

Scale bars: 100µm (HE), 1000µm (BF)

Moderately differentiated adenocarcinoma Moderately differentiated adenocarcinoma Poorly differentiated adenocarcinoma

Organoid Primary tissue H&E CK19

肝内胆管がん組織と樹立したオルガノイドの

組織学的類似性

中分化型腺がん 低分化型腺がん Scale bars: 100mm

CK7 MUC1 PAS HE CK7 MUC1 PAS HE

肝内胆管がん組織と樹立したオルガノイドの

類似性（免疫染色）

Primary tissue Organoid

胆嚢がん由来オルガノイドの形態と免疫染色

Scale bars: 100µm CK7 PAS HE CK7 PAS HE

Primary tissue Organoid

Scale bars: 1000µm

Surgically resected GBC tissue specimen

ファーター乳頭部神経内分泌がん由来 オルガノイドの形態と免疫染色 Scale bars: 100µm Synaptophysin HE Chromogranin A Synaptophysin HE Chromogranin A

Primary tissue Organoid

Surgically resected tissue specimen of neuroendocrine carcinoma (NEC) of the ampulla of Vater

Organoid culture

胆道がんオルガノイドを用いた遺伝子発現解析

Non-cancer organoids Cancer organoids

PLA2G4A CRYM SNX10 HOXB7 HOXA10-AS SKAP2 SOX2 PIR CCND1 BAG1 ONECUT2 MMP1 SLC9B2 ARMCX2 AKR7A3 TUBB6 SLC15A1 SLC28A3 VCAN CD24 SPRR3 DUOXA1 DUOX1 SPINK4 THFSF15 9 T -T i 1 T -X e 1 T P 7 1 T P 3 2 1 T P 5 8 1 T P 1 7 7 C C 1 9 T 3 6 T 1 9 T 2 4 T 3 T 2 8T 2 2 T 2 9 L 3 0 T 3 2 T 3 5 L 3 7 L 3 4 N 3 0 N 3 2 N 2 6 T 2 6 N 3 3 N 2 5 T 0 500 1000 1500 2000 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 SOX2 low SOX2 high p=0.00025 (log-rank test) (TCGA-CHOL) P ro b a b ili ty o f s u rv iv a l

Time since diagnosis (days)

胆道がんオルガノイドを用いた

既存薬ライブラリーによるスクリーニング

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 Control A B C D E F G H 18-5 Control D E F 12

Day 0 4 10 Compounds (0.1 mM) Plating organoids (1.2 x 103 / well) WST assay 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Control a b c d e f g h Control d e f F ra c ti o n v ia b ili ty o f c o n tr o l

Drug screening with clinically used drugs

339 compounds

(clinically used drugs)

22 compounds that suppress organoids (fraction viability of control < 0.5)

Cabazitaxel, Docetaxel, Epothilone B, Vindesine, Vinorelbine

Afratinib, Dasatinib, Lapatinib

Clofarabine, Gemcitabine, Pralatrexate Everolimus, Rapamycin Bortezomib, Carfilzomib Aclarubicin Mitomycin C 5-Aza-2'-deoxycytidine Amorolfine, Fenticonazole Cerivastatin Talipexole Anticancer agent Other Antimicrotubule agent Tyrosine kinase inhibitor Antimetabolite agent mTOR inhibitor

Proteasome inhibitor Topoisomerase inhibitor Antitumor antibiotic

DNA methylation inhibitor

Antifungal agent

HMG-CoA reductase inhibitor Dopamine D2 receptor agonist

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0.0 0.1 1.0 10 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0.0 0.1 1.0 10 F ra c ti o n v ia b ili ty o f c o n tr o l F ra c ti o n v ia b ili ty o f c o n tr o l 1T (IHCC) 19T (GBC) 9T (IHCC) 3T (PDA) 36T (NEC) 24T (IHCC) (mM) (mM) Amorolfine Fenticonazole

Drug repositioning strategy using cancer organoids

Control Amorolfine Fenticonazole

これらの既存薬は既に安全性が確認されているため、胆道がんや膵臓がんを最小 限の副作用で効率的に抑制する新規予防・治療薬となることが期待される。

Saito Y et al. Cell Rep. 27, 1265, 2019.

腫瘍オルガノイドバンクの構築による個別化治療の開発 遺伝子発現解析 ゲノム・エピゲノム解析 薬剤スクリーニング  新たなバイオマーカーおよび治療薬の開発  最適な治療薬を用いた個別化治療の確立 オルガノイド培養による腫瘍 のin vitroモデルの構築 外科手術や内視鏡下生検 などによる腫瘍組織の採取 凍結保存による ストック作製 15

従来技術とその問題点

• 現在、胆道・膵臓がんに対する化学療法には、主にゲムシ タビンが用いられているが、その効果は限定的であり、5 年生存率も極めて不良である。 • 従来の創薬スクリーニングには、血清含有培地で培養を行 う2次元の細胞株が用いられてきたが、生体内の腫瘍を再 現しているとは言い難い。 • 従来の創薬スクリーニングではヒットしなかった化合物も 本技術によりヒット化合物となる可能性がある。 18

新技術の特徴・従来技術との比較

• 本技術では、オルガノイド培養により胆道・膵臓がんを生体 に近い状態で3次元培養し、スクリーニングを行うことで、難 治性がんに対する革新的な創薬が可能になる。 • オルガノイド培養により胆道・膵臓がんを生体に近い状態で 培養し、創薬スクリーニングに応用することに成功した。 • 本技術により抗真菌薬が胆道・膵臓がんの新たな治療薬とな る可能性を見出している。 • 本技術によりスクリーニングや薬剤感受性試験を行うことで、 難治性がんに対する革新的な治療薬が開発されることが期待 される。 19

想定される用途

• 胆道・膵臓がんに対する創薬スクリーニング • 特に、既存薬ライブラリーを用いたスクリーニングを行う ことで、ドラッグ・リポジショニングが可能になる。 • 新規化合物の胆道・膵臓がんに対する薬剤感受性試験 • 薬剤投与前後の遺伝子発現などを解析することで、胆道・ 膵臓がんの新規バイオマーカーの探索などが可能になる。 20

実用化に向けた課題

• 現在、東京大学創薬機構から供与された既存薬ライブラ リーを用いた胆道がんオルガノイドのスクリーニングが進 行中。今年中に全ての化合物が終了する予定。 • ヒット化合物の合成・展開 • ヒット化合物のin vivoでの薬効評価 • 非臨床POCの取得、治験への移行を目指す。 21

企業への期待

• 胆道・膵臓がんに対する新薬を開発中の企業、創薬への展開 を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。 • 企業が開発した新規化合物の胆道・膵臓がんオルガノイドに 対する薬効評価 • 企業が所有している化合物ライブラリーを用いた胆道・膵臓 がんオルガノイドに対するスクリーニング • ヒット化合物のin vivoでの薬効評価、非臨床POC取得など に関する共同研究 22

本技術に関する知的財産権

出願番号：特願2018-186915（出願中） 発明者：齋藤 義正、齋藤 英胤、杉山 優子、村松 俊英 発明の名称：癌治療用医薬組成物 出願人：学校法人慶應義塾 出願日：2018年10月01日 出願番号：特願2018-052795（出願中） 発明者：齋藤 義正、金井 弥栄、村松 俊英 発明の名称：胆道癌オルガノイド又は膵臓癌オルガノイドの培養 用培地 出願人：学校法人慶應義塾 出願日：2018年3月20日 23

お問い合わせ先

慶應義塾大学 研究連携推進本部 高橋 勇美 ＴＥＬ 03－5315 － 4368 ＦＡＸ 03－5315 － 4369 e-mail isami.takahashi＠adst.keio.ac.jp 24