レクチ ン親 和 電気泳 動 を用 いた肝癌細胞 株培養 液
上 清 中の糖蛋 白糖鎖 変異 に関す る研究
岡 山大学 医学部 公衆 衛生 学教 室(主 任:武 田和 久教授)
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(平成10年3月30日 受理)
Key words: Glycoprotein, lectin affinity electrophoresis, cultured hepatoma cell line
緒 言 肝 細 胞 癌 は わ が 国 の 男 性 で 死 因 の 第3位 を 占 め,発 生 頻 度 が 増 加 しつ つ あ り,早 期 発 見 に よ り効 果 的 な 治 療 を行 う こ とが 重 要 で あ る.肝 細 胞 癌 の 腫 瘍 マ ー カ ー と し て は α-fetoprotein (AFP)が 従 来 か ら重 要 な役 割 を果 た して き た が,血 清AFPレ ベ ル は 肝 炎,肝 硬 変 で も上 昇 し,画 像 診 断 の 発 達 した 現 時 点 で は肝 細 胞 癌 の 質 的 診 断 の た め の マ ー カー とは な り得 ない.AFP は1分 子 当 た り1本 の ア スパ ラ ギ ン結 合 型 の2 本 鎖 複 合 型 糖 鎖 を有 し て お り, Taketaら1)は, 肝 細 胞 癌 に 特 異 的 なAFP糖 鎖 の グ ラ イ コ フ ォ ー ム の 変 化 を レ ク チ ン親 和 電 気 泳 動 と抗 体 親 和 転 写 法 を用 い て検 出 す る方 法 を 開 発 し,レ ン ズ マ メ レ ク チ ン(LCA)に 親 和 性 を有 す るAFP-L3お よび 赤 血 球 凝 集 性 イ ン ゲ ン豆 レ クチ ン(E4 -PHA)に 親 和 性 を 有 す るAFP-P4の 測 定 が 肝 細 胞 癌 の 早 期 診 断 に 有 用 な こ と を 明 ら か に し た.し か し,肝 細 胞 癌 でAFPが 上 昇 す る 例 は 限 られ て お り,肝 細 胞 癌 の32.3%はAFPが20 ng/ml以 下 で あ る2).こ れ らのAFP非 産 生 性 と 呼 ば れ る肝 細 胞 癌 で は 早 期 に 陽 性 化 す る マ ー カ ー が な い た め 診 断 は 画 像 に の み 頼 ら ざ る を得 な い現 状 で あ る.AFP糖 鎖 の 肝 細 胞 癌 の 発 生 に 伴 う変 化 はAFP以 外 の 糖 蛋 白 の 糖 鎖 に つ い て も み られ る可 能 性 が あ り,以 下 の よ う に種 々 の 血 清 糖 蛋 白 の 肝 細 胞 の 癌 化 に 伴 う糖 鎖 変 異 が 検 討 さ れ て い る. AFP以 外 の 糖 蛋 白 と し て はAFPと 類 似 して 肝 細 胞 癌 で 血 中 レベ ル が 上 昇 す るα1-antitrypsin (AAT)3),お よ び 肝 疾 患 で の 糖 鎖 の 変 異 が 検 知 さ れ て い るtransferrin (Tf)4)が 検 討 の 対 象 とな っ て い るが,材 料 と して 肝 細 胞 癌 患 者 の 血 清 を 用 い て お り,担 癌 肝 の 非 癌 肝 細 胞 か ら合 成 さ れ た 糖 蛋 白 も含 ん で い る た め,明 らか な 結 論 に達 して い な い.本 研 究 に お い て は こ の よ うな 問 題 点 を さ け る た め,肝 癌 細 胞 株 を 用 い,培 養 液 上 清 中のAATお よびTfに つい て糖 鎖 変 異 をAFP の そ れ と比 較 検 討 した.方 法 と し て は レ ク チ ン 親 和 電 気 泳 動5),6)と,分 離 さ れ た糖 蛋 白 を 特 異 的 に検 出 し得 る抗 体 親 和 転 写 法1)を 組 み合 わせ て行 っ た. 材 料 と 方 法 肝 癌 細 胞 株 の培 養 液 上 清 と して,肝 癌 細 胞 株 HuH-77), huH-18), Hep-G29), KIM-110 ),お よびHUH-6 Cl-511)の 培 養 液 上 清 を用 いた.
KIM-1は5%胎 児 牛 血 清 を含 むRoswell Park Memorial Institute Medium1640で2な い し3 日培 養 後 培 養 液 を無 血 清 と し2日 間 培 養 した も の で,そ の 他 の 細 胞 は 無 血 清 培 養5)し た.こ れ ら の 上 清 はMicro-ProDiCon Model MPDC-15 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)と Micro-ProDiConTM Membrane MWCO : 10,000 (Spectrum, Houston, Texas)を 用 い て
100倍 に 濃 縮 し,培 養 液 上 清 のAFP濃 度 は Human AFP-Japanese Standard (日本 バ イ オ テ ス ト研 究 所,東 京,日 本)を 標 準AFPと し て 用 い て 抗 体 親 和 転 写 法1)に よ り,AATとTf の 濃 度 は ロケ ッ ト免 疫 電 気 泳 動 に よ り測 定 した. 抗 体 と して はRabbit antihuman AAT
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body (DAKO, Copenhagen, Denmark)とGoat anti-human Tf antibody (1.0mg/ml) (Caltag Laboratories Inc., San Francisco, CA)を150
倍 に,そ れ ぞ れ ベ ロ ナ ー ル 緩 衝 液(pH 8.6, μ= 0.025)で 希 釈 し た も の を 含 む1%の ア ガ ロ ー ス
ゲ ル(ア ガ ロ ー スM, Phamacia Biotech, Upp sala, Sweden)平 板 を 用 い た.ゲ ル 平 板 の 原 点
の 直 径2.5mm,深 さ1mmの 穴 に4μlず つ 塗 布 し, 電 極 の 緩 衝 液 は ベ ロ ナ ー ル 緩 衝 液(pH 8.6, μ= 0.05)を 用 い,電 圧 は3V/cm,泳 動 温 度 は10℃, 泳 動 時 間 は16時 間 と し た. Human serum pro tein high control (DAKO, Copenhagen, Den mark)を 標 準 糖 蛋 白 と し て 用 い た.
AFPの 濃 度 はHuH-7が105ng/ml, huH-1 が103ng/ml, Hep G 2が105ng/ml, KIM-1が 104ng/mlで, AATは い ず れ も0.10mg/ml, Tfは HuH-7とHep G 2が0.15mg/ml, huH-1が 0.20mg/ml, KIM-1は30μg/mlで あ っ た. AFP は100ng/ml, AATは2.0μg/ml, Tfは5.0μg/ mlと な る よ う に ベ ロ ナ ー ル 緩 衝 液(pH 8.6, μ= 0.025)で 希 釈 し て レ ク チ ン 親 和 電 気 泳 動 に 使 用 し た. レ ク チ ン 親 和 電 気 泳 動 は, Taketaら1)の 方 法 に 順 じ て 行 っ た.す な わ ち1%の ア ガ ロ ー スM を 含 む ベ ロ ナ ー ル 緩 衝 液(pH 8.6, μ=0.025) で ゲ ル 板(80mm×75mm×1mm)を 作 成 し,レ ク チ ン は 最 終 濃 度 で,コ ン カ ナ バ リ ンA(Con A)
(Phamacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) が1.0mg/ml, LCA(生 化 学 工 業,東 京,日 本) は0.2mg/ml, E4-PHAは0.3mg/ml(生 化 学 工 業, 東 京,日 本)と な る よ う に 加 え て 用 い た.検 体 は,ゲ ル 板 の 原 点 の 溝(0.8mm×5mm×1mm)に 4μlず つ 塗 布 し た.電 圧 は20V/cm,温 度 は 10℃,泳 動 時 間 はTfに つ い て は 遊 離 ブ ロ モ フ ェ ノ ー ル ブ ル ー が 原 点 か ら9cm,そ の 他 は5.5cm 陽 極 側 に 移 動 す る ま で と し た. 分 離 し た 糖 蛋 白 の 検 出 に は7.5×4.5cmの ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜(Schleicher and Schuell, Dassel, Germany)にAFPで はMouse anti-human AFP antibody (NB 011,日 本 バ イ オ テ ス ト研
究 所,東 京,日 本)を 最 終 濃 度 が50μg/mlと な る よ う に, AATとTfで はGoat anti-human AAT antibody (1.0mg/ml) (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA)お よ びGoat anti-human Tf
antibody (Caltag Laboratories Inc., San Fran cisco, CA)を そ れ ぞ れ200倍 に 希 釈 し て 結 合 さ せ グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド蒸 気 で 固 定1)し て 用 い た. 一 次 抗 体 はRabbit anti -human AAT antibody
(DAKO, Copenhagen, Denmark), Rabbit Anti-human Tf antibody (Inter-Cell Technol
ogies Inc., Hopewell, NJ)を,二 次 抗 体 はGoat anti-rabbit IgG (H＋L)-horseradish perox idase conjugate (Bio-Rad laboratories, Rich mond, CA)を 用 い, POD Immunostein Set(和 光 純 薬 工 業,大 阪,日 本)で ホ ル マ ザ ン 染 色 し
た12).
画 像 解 析 プ ロ グ ラ ム で あ る NIHImage 1.55 (National Institute of Health, Bethesda, Maryland)を 用 い て ス キ ャ ン し,そ の 面 積 比 か ら 各 バ ン ドの 濃 度 の 割 合 を 求 め 百 分 率 で 表 し た. 各 バ ン ド は 最 も バ ン ド数 が 多 い も の を 基 本 に 陽 極 側 か ら 順 に, Con Aを 用 い た 電 気 泳 動 で はC 1, C2お よ びC3, LCAで はL1, L2, L 3お よ びL4, E4-PHAで はP1, P2, P3, 図1 レ クチ ン親 和 電 気泳 動 に よ って分 離 され る各 糖 蛋 白の代 表 的パ ター ンを示 す例 にお けるバ ン ドの命 名(UM, IKは 症 例 の イニ シ ャ ル を表 す.)
P4お よ びP5と し た(図1) .各 糖 蛋 白に お け る こ れ ら の バ ン ドを代 表 的 なバ ン ドパ タ ー ン を 有 す る培 養 株 細 胞 に つ い て 示 し た. HUH-6Cl -5はAFP以 外 の 糖 蛋 白 の 検 討 は行っ て い な い が, AFPで は他 に 見 られ な いバ ン ドが あ る の で 本 培 養 株 細 胞 を用 い た. 結 果 Con Aを 用 い て 行 っ た親 和 電 気 泳 動 で は(図 2, 表1),肝 癌 細 胞 株 の 産 生 す るAFPは2つ の バ ン ドに 分 か れ,い ず れ も肝 硬 変(LC),肝 細 胞 癌(HCC)の 各1例 の 血 清 の パ ター ン に 比 し, AFP-C1の 明 ら か な 増 加 が み られ た. AATはCon Aに よ っ て3つ の バ ン ドに分 解 され, AAT-C 1はLC, HCCの 各1例 に 比 し て い ず れ の 培 養 株 細 胞 で も増 加 した. AAT全 体 に 対 す る割 合 は18%以 下 で, AFPに お け るAFP -C1と ほ ぼ 同 程 度 で あ っ た.た だ し そ の 中 で は KIM-1はHuH-7, huH-1お よ びHep G 2
な どの 肝 癌 細 胞 株 に 比 し て,4%と 特 に低 値 で あ っ た.培 養 株 細 胞 で は 全 体 にCon Aに 弱 結 合 性 のAAT-C2が 増 加 して い た が, KIM-1で は こ の ピ ー ク もや は り低 か っ た. AAT-C2は HuH-7, huH-1お よ びHep G 2で は 一 様 に 増 加 が み られ た. AAT-C 1の 割 合 が 多 い例 で, AAT-C 2も 多 いか 否 か につ い て は,そ の 傾 向 は 見 ら れ たが,全 て の 培 養 株 細 胞 に つ い て そ れ が い え る ほ どAAT-C2の 分 離 は 明 瞭 で は な か っ た. Tfで は 数 本 の 細 い 泳 動 バ ン ドに わか れ て い る が, Con Aに よ っ て大 き く分 け て 少 な く と も2 本 のバ ン ドに分 か れ た ためCon A非 結 合 性 のTf -C1と 結 合 性 のTf-C 2と し た.ま たHuH-7で は 強 結 合 性 のTf-C3が 認 め られ た が, Tf -C1は い ず れの 培 養 株 細 胞 にお い て もLC , HCC の 各1例 に 比 し て 明 らか に そ の割 合 が 増 加 した. KIM-1で はhuH-1お よ びHep G 2に 比 し て
Tf-C1の 増 加 の 程 度 は わ ず か で あ り, HuH-7 図2 Con Aに よ る各 糖 蛋 白の親 和 電 気泳 動 像 のデ ン シ トグ ラム (UM, IKは 症 例 の イニ シ ャル を表 す.) 表1 Con Aを 用 い た レ クチ ン親 和電 気 泳 動 の各 バ ン ドの割 合(%) * Tf-C3が45%に 認 め ら れ た . 図3 LCAに よる各 糖 蛋 白の親 和 電 気泳 動 像 のデ ン シ トグ ラム (UM, IKは 症 例 の イニ シ ャル を 表 す.) 表2 LCAを 用 いた レクチ ン親 和 電 気泳 動 の各 バ ン ドの 割合(%) * AAT-L4がHuH-7で28%, KIM-1で24%に 認 め ら れ た .
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の 方 が20%と さ ら に低 値 で, AFPに お け る非 結 合 性 バ ン ドの 増 加 と異 な る結 果 で あ っ た.す な わ ち 培 養 株 細 胞 で は共 通 し てC1お よ びC2分 画 が 増 加 し 非 結 合 性 の 割 合 が 増 加 し た が そ の 増 加 の程 度 は 各 糖 蛋 白 お よ び 各 培 養 株 細 胞 で 異 な っ た. LCAに お い て(図3, 表2), AFPの 分 画 で は い ず れ も著 明 にAFP-L3が 増 加 し,そ の 割 合 は ほ ぼ 同 じ程 度 で あ っ た. AATは 非 結 合 性 の AAT-L1お よび 弱 結 合 性 のAAT-L3さ ら に 一 部 の 培 養 株 細 胞 で は 強 結 合 性 のAAT-L4が わ ず かの 割 合 で はあ るが 認 め られた.便 宜 上AAT -L3とAAT-L4を 結 合 性 バ ン ドとす る とこれ ら の バ ン ド全 体 に 対 す る割 合 は い ず れ の 培 養 株 細 胞 で も増 加 し て お り,肝 硬 変 例 の 血 清 で は こ れ らの 結 合 性 バ ン ドは ほ とん ど認 め ら れ な い の に 対 し,結 合 性 分 画 が 非 結 合 性 分 画 よ り も 多 か っ た. HuH-7お よ びKIM-1でAAT-L3の 割 合 が 最 も 多 か っ た. Tfで は 数 本 の バ ン ドが み ら れ た が 大 き くTf -L1とTf-L3に 分 解 され た .培 養 株 細胞 では Tf-L3が 明 らか に 増 加 し, HuH-7お よびKIM -1で はAFPお よ びAATと 同 様LCA反 応 性 のTf-L3の 増 加 が 著 明 で あ っ た.従 っ てHCC 患 者 の 血 清 で 増 加 す るAFP-L3はLCA反 応 性 バ ン ドに 関 し て は い ず れ の 培 養 株 細 胞 で も ほ ぼ 同程 度 の 増 加 が み られ,ま た 各 糖 蛋 白 に お い て もそ の 割 合 に 著 明 な 差 は み られ な か っ た. E4-PHAを 用 い た親 和 電 気 泳 動 法 では(図4, 表3),い ず れ の 糖 蛋 白 も4な い し5つ の バ ン ド に 分 画 さ れ た が, P2とP4が 主 バ ン ドで あ っ た. AFPで は ほ とん ど5つ の 分 画 に分 か れ た と い え るが, AATで はP5に 相 当 す るバ ン ドは 認 め られ ず, P2とP3の 分 離 が 明 瞭 で, P4,「 P5の バ ン ドの 分 離 は 不 明 瞭 で あ っ た. Tfで は P3に 相 当 す るバ ン ドが ほ と ん ど認 め ら れ ず, P4が 明 らか に 認 め られ る も の も あ っ た が,多 くの培 養 株 細 胞 でP3, P4お よ びP5の バ ン ドは 融 合 し て い た.い ず れ の 糖 蛋 白 で も培 養 株 細 胞 で は, E4-PHAに 非 結 合 型 のP2の 割 合 が 低 く結 合 型 のP4の 割 合 は 高 か っ た. AFPで は Hep G 2のAFP-P4の 割 合 が 低 く, HuH-7 で はAFP-P4の 割 合 が 低 か っ た が, Tfで はTf -P4は 他 の 培 養 株 細 胞 と 同 様 に 増 加 して い た. huH-1はAFPとAATで はP4の 割 合 が 高 か っ た.す な わ ち, Tfに 関 し て は 培 養 株 細 胞 に お い て 肝 細 胞 癌 に特 異 的 なAFP-P 4に 相 当 す るバ ン ドは 増 加 した が,培 養 株 細 胞 に よ りそ の 程 度 に は 多 少 差 が み ら れ た. 考 察 本 研 究 に お い て は 肝 硬 変 の1例 お よ び 肝 細 胞 癌 症 例 はAFP-L3お よ びAFP-P4の 増 加 が 図4 E4-PHAに よる各 糖 蛋 白 の親 和 電 気 泳 動 像 の デ ン シ トグラ ム (UM, IKは 症 例 の イ ニ シ ャ ル を表 す.) 表3 E4-PHAを 用 いた レ クチ ン親 和 電気 泳 動各 バ ン ドの 割合(%)明 ら か な例 を1例 示 した の み で あ る. AATお よ びTfに 関 して は 肝 細 胞 癌 が 分 泌 した 糖 蛋 白 の 割 合 は 非 癌 部 か ら の そ れ に 比 して 少 な い の で腫 瘍 不 均 一 性 に よ る 影 響 は 少 な い と思 わ れ るが, 血 清 を検 体 と し た場 合 腫 瘍 不 均 一 性13)が 存 在 す るので本 来 は 多数 例 との比 較 が 必 要 であ る. AFP, AATお よ びTfに つ い て 多 数 の 症 例 の 検 討 が な さ れ て い る14),15)ので,そ れ ら の 成 績 と比 較 す る と, AFPに つ い てTaketaら16)の 報 告 で は HCCの 患 者58例 の 平 均 と し てAFP-C 1が8.3 %, AFP-L3が40.4%,お よびAFP-P4が24.6 %で あ っ た と述 べ て お り,本 研 究 で は 培 養 株 細 胞 でAFP-C 1が10%か ら29%, AFP-L3が61 %か ら76%お よ びAFP-P4が17%か ら38%で 著 明 に 増 加 し た.ま たAATに つ い て 小 黒 ら14) は, LCAを 用 い た と き, L2(結 合 分 画)がLC 群 で13.0±5.0%, HCC群 で19.3±6.9%で 有 意 に 上 昇 し て い る と報 告 して い る.そ れ に 比 べ て, 本 研 究 の 培 養 株 細 胞 で は 結 合 分 画(本 研 究 で は AAT-L3+L4に あ た る)が62%か ら87%と 著 明 に 高 か っ た.Tfで は, L2(結 合 分 画)がLC 群 で5.7±2.3%でHCC群 で15.9±6.1%で 有 意 の上 昇 で あ っ た と報 告 して お り,本 研 究 で の 培 養 株 細 胞 で は 結 合分 画(本 研 究 で はTf-L3に あ た る)が49%か ら79%と 高 値 を示 した.以 上 よ り肝 硬 変 例 の 糖 蛋 白お よ び 非 癌 硬 変 肝 に よ り 産 生 さ れ た 糖 蛋 白 が 加 わ っ た 肝 細 胞 癌 の 糖 蛋 白 の パ ター ン に 比 し,培 養 株 細 胞 で は,癌 化 に よ っ て 増 加 す る と さ れ るAFP-C 1, AFP-L3お よ びAFP-P4に 相 当 す るAATお よ びTfの バ ン ドの 割 合 が さ ら に 増 加 し て い る こ とか ら, 肝 細 胞 癌 血 清 で の レ ク チ ン 反 応 性 の 変 化 が 癌 化 に 伴 う も の で あ る こ と を裏 づ け る結 果 とい え, 各 糖 蛋 白や 各 培 養 株 細 胞 で 似 た パ タ ー ン で あ っ た. しか し各 糖 蛋 白や 各 培 養 株 細 胞 につ い て 比 較 す る と結 果 で 述 べ た よ うに 増 加 の 程 度 に は 差 が 認 め ら れ た. LCAを 用 い た と き は 比 較 的 増 加 の 程 度 は 類 似 し て い た が, Con AやE4-PHAで は 増 加 の 程 度 に差 が み ら れ た.特 にCon Aを 用 い た際 に は糖 蛋 白間 で のCon Aへ の親 和 性 の 差 が 大 きか っ た が,こ れ に は3本 鎖,4本 鎖 あ る い はBisecting N-ア セ チ ル グ ル コサ ミン の 存 在 で もCon Aへ の 反 応 性 が な くな る た め,糖 鎖 変 異 の 差 に よ り糖 蛋 白 間 に レ クチ ン に よ る反 応 性 の 差 が 出 る可 能 性 が考 え られ る. ま た,本 研 究 に お い て分 離 さ れ た 糖 蛋 白 の分 離 パ タ ー ン をみ て み る とAFPよ り もTfお よ びAATに お い て バ ン ドの 数 は 増 加 す る傾 向 に あ っ た.結 合 し て い る糖 鎖 の 数 がAFPで は1 分 子 当 た り1本, AATは3本, Tfは2本17)と 蛋 白 ご とに 異 な る ため と考 え られ た.こ の こ と か ら,厳 密 に は 蛋 白 の 違 い に よ る糖 鎖 の 変 化 を み る こ とに は な ら な い の で 各 糖 蛋 白 間 で の レ ク チ ン に よ る 反 応 性 の 差 は そ の た め と も考 え ら れ る.レ クチ ン カ ラ ム を 用 い た 親 和 ク ロマ トグ ラ フ ィ ー で は,1本 の 糖 鎖 で も レ クチ ン に 親 和 性 を 有 す る も の が あ れ ば 結 合 す る とす る考 え も 成 り立 つ が,レ ク チ ン親 和 電 気 泳 動 に よ る糖 蛋 白 の 分 離 で は,親 和 性 の 大 小 に 従 っ て糖 蛋 白 バ ン ドの 移 動 距 離 の 遅 れ が 異 な る と考 え る 方 が 妥 当 で あ る18).この よ う な考 え に 基 づ け ば レ クチ ン親 和 電 気 泳 動 で は1分 子 当 た りの 糖 鎖 の 数 が 多 く な れ ば,変 異 糖 鎖 の 数 の 組 み 合 わ せ に 従 っ て そ れ だ け 多 くの バ ン ドに 分 離 す る こ とに な る.し か し実 際 に は そ れ に 従 っ た バ ン ド数 の 増 加 は み ら れ な い.そ れ は,泳 動 距 離 が 同 じ場 合 に は 一 定 距 離 のバ ン ドの 数 が 増 加 す る の で分 離 が 悪 く な り,バ ン ドの 数 の 増 加 に は 限 度 が あ る た め と 思 わ れ る.た だ しTfで は レ ク チ ン存 在 下 で 培 養 株 細 胞 に 他 の 糖 蛋 白 に み られ る 以 上 の 数 の バ ン ドが 見 られ る こ とか ら レ クチ ン に よ る 反 応 性 と い う よ り もTfに 結 合 す る鉄 原 子 の 数 が0か ら2つ と異 な る こ とに 基 づ く分 離 も重 な っ た も の と思 わ れ る19). 小 黒 ら14)は個 々 の 症 例 で 各 蛋 白 の レ クチ ン結 合 性 に 違 い が あ る こ とか ら癌 化 に よ る糖 鎖 の 変 異 は各 糖 蛋 白 に よ って 独 立 し て い る と述 べ て い る.ま た横 田 ら15)はHCC症 例 の 血 清 か ら得 ら れ たAFPとTfの 糖 鎖 分 析 に よ る フ コ シル 化 率 の 間 に は 相 関 関 係 が な い こ と を示 し,癌 化 に 伴 う糖 鎖 の 変 異 は 蛋 白 に よ り別 々 に お き て い る と述 べ て い る.し か し こ れ らの 報 告 で は,担 癌 肝 の 非 癌 肝 細 胞 か ら合 成 さ れ た糖 蛋 白 も含 ん で い る た め に 癌 化 に よ る糖 鎖 異 常 を十 分 に 反 映 し て い な い 可 能 性 が あ る. Ohnoら20)は 培 養 株 細
58 深 澤 真 子 胞 か ら得 ら れ たAFPの α1-6フ コ シ ル トラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ やN-ア セ チ ル グル コサ ミニ ル トラ ンス フ ェ ラー ゼIIIとVの 活 性 を測 定 しこれ とAFP の 糖 鎖 変 異 とが 関 連 が あ る と述 べ て い る.こ れ らか ら,ま た 本 研 究 か ら も,各 糖 蛋 白 の 糖 鎖 変 異 は 多 少 差 異 は あ っ て も本 質 的 に は 同 様 の 変 異 を示 し,各 糖 蛋 白の 糖 鎖 変 異 は 独 立 し て 起 こ っ て い る とは い え な い と考 え ら れ た. さ ら に 今 後,血 清 のAATやTfの レ ク チ ン 分 画 の パ タ ー ン に よ っ て,こ れ ら の 糖 蛋 白 の glycoformの う ち,肝 細 胞 癌 に よ り特 異 的 な も の を 定 量 す るsystemを 開 発 す る こ と に よ り, AFP非 産 生 性 の 肝 細 胞 癌 に つ い て も早 期 診 断 の マ ー カ ー と な り得 る可 能 性 が 示 唆 さ れ る. 結 論 1. AFP, AATお よ びTfの3種 類 の糖 蛋 白 の 糖 鎖 変 異 をHuH-7, huH-1, Hep-G 2 お よ びKIM-1の 肝 癌 細 胞 株 培 養 液 上 清 を 用 い て レ クチ ン親 和 電 気 泳 動 に よ り比 較 検 討 し た. 2. 糖 鎖 の 数 が 増 加 す る と分 離 し た バ ン ドの 数 も増 加 す る傾 向 が み られ,バ ン ドの 分 離 自体 は 不 明 瞭 と な っ た が,1分 子 当 た り1本 の糖 鎖 を 有 す るAFPの グ ラ イ コ フ ォー ム と ほ ぼ 類 似 し た パ タ ー ン を得 た. 3. 肝 癌 細 胞 株 培 養 液 に お い て も癌 化 に よ っ て 増 加 す る こ とが知 られ て い る, AFP-C1, AFP -L3お よびAFP-P4に 相 当 す るTfお よ び AATの バ ン ドの 割 合 が 増 加 し,各 培 養 株 細 胞 ご とに そ の 程 度 に差 は み ら れ た が,ど の 糖 蛋 白糖 鎖 に も類 似 の 変 化 が 起 こ っ て い る事 が 示 され た.た だ しCon Aの 反 応 性 に 関 し て は 糖 蛋 白 間 で 若 干 の 差 が み られ た. 4. 血 清 のAATやTfの レ クチ ン 分 画 の パ タ ー ン を分 析 す る こ とに よ っ て, AFP非 産 生 性 の 肝 細 胞 癌 につ い て も早 期 診 断 の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た. 稿 を終 え るに あ た り,御 指 導 を賜 っ た 岡 山大 学 医 学部 公 衆衛 生学 教 室 武 田和 久 教 授,肝 癌 細 胞株 培 養 に あ た り御協 力戴 いた 北 海道 大 学 生化 学 第 一教 室 中 林 秀 和 先 生 に深 謝 いた します.
文
献
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60
深
澤
真
子
Sugar
chain
alterations
of glycoproteins
in spent
culture
media
of
human
hepatocellular
carcinoma
cell lines
analyzed
by
lectin-affinity
electrophoresis
Masako
FUKAZAWA
Department
of Public Health
Okayama
University
Medical School
Okayama
700-8558, Japan
(Director:
Prof. K. Taketa)
Sugar chain alterations of ƒ¿-fetoprotein (AFP), ƒ¿1-Antitrypsin (AAT) and transferrin (Tf) in spent culture media of human hepatoma cell lines, HuH-7, huH-1, Hep-G2 and KIM-1, were
analyzed by lectin-affinity electrophoresis with Concanavalin A (Con A), Lens culinaris agglutinin (LCA) and Phaseolus vulgaris lectin (E4-PHA) and antibody-affinity blotting. Their glycoforms demonstrated lectin-dependent characteristic patterns similar to the glycoforms of AFP in hepatocellular carcinomas, although their separation became less chear as the number of sugar chains per molecule increased. The proportions of band intensities of the glycoform of AAT and Tf corresponding to AFP-C1, AFP-L3 and AFP-P4 increased consistently in all cell lines. However, the extent of the increases in the glycoforms differed from one cell line to another, reflecting tumor heterogenity. On the other hand, the sugar chain alterations of glycoproteins were similar in each cell line, although the glycoforms separated with Con A showed slightly different patterns from those separated with LCA. Accordingly, hepatocelluler carcinoma may be detected at an early stage by analyzing the glycoforms of serum AAT and Tf by lectin-affinity electrophoresis for cases with negative AFP.
