Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/
Title
№２：ヒト歯髄細胞をlipopolysaccharide にて刺激した
際のtoll like
receptor４，interleukin１β，interleukin６の変化
Author(s)
杉内, 亜紀奈; 村松, 敬; 小林, 史枝; 関谷, 紗世; 佐
野, 陽祐; 佐古, 亮; 月野和, 隆; 間, 奈津子; 末原,
正崇; 古澤, 成博
Journal
歯科学報, 114(3): 283-283
URL
http://hdl.handle.net/10130/3346
Right
目的：間葉系幹細胞は多くは骨髄に存在するが，歯 髄においても間葉系幹細胞の存在が報告されてい る。象牙芽細胞や歯髄細胞が傷害性刺激を受けた際 の再生についても歯髄に存在する間葉系幹細胞が関 与していると考えられる。しかしながら歯髄組織中 のどの部位に間葉系幹細胞が存在しているのかは明 らかとなっていない。今回，我々はラット歯髄にお いて間葉系幹細胞の表面抗原マーカーである CD ９０，CD７３に着目し，これらに陽性を示す細胞の局 在を免疫組織化学的に検討した。 方法：実 験 に は２５０−３００g の Wister 系 ラ ッ ト６匹 を用いた。ペントバルビタール（ソムノペンチル， 共立製薬）の腹腔内投与後，大動脈から４％パラホ ルムアルデヒド溶液の灌流固定を行い，１０％EDTA にて脱灰後，通法にしたがいパラフィン切片（４ μm）を作製した。切片は１０％ヤギ血清でブロッキ ング後，一次抗体に間葉系幹細胞のマーカーである CD９０（eBioscience，１：１００），CD７３（BD Pharm-ingen，１：２５）を４℃，overnight で反応させ，洗 浄後，peroxidase 標識二次抗体（ヒストファイン シンプルステインラット，ニチレイバイオサイエン ス）を室温で１時間，反応させた。発色は０．０２％ジ アミノベンチジン（DAB）にて発色を行い，万能 写 真 顕 微 鏡（UPM Axiophot２）に て 観 察 を 行 っ た。 結果および考察：CD９０については象牙芽細胞層か ら象牙芽細胞層の直下層（subodontoblastic layer） 及び血管内皮細胞に染色性が確認された。特に歯冠 部では象牙芽細胞層の直下層に強い染色性が認めら れたが，歯根部では明確な染色性は認められず，根 尖部でも染色性は認められなかった。一方，CD７３ に関しては歯冠部，歯根部のいずれにも陽性を示す 細胞が認められなかった。歯冠部で染色性が強く認 められたことから，歯髄から間葉系幹細胞を分離す る際には冠部歯髄から採取し分離することが有効で あると考えられた。また歯髄が傷害を受けた際には 象牙芽細胞下層に存在する未分化間葉細胞や歯髄細 胞が象牙芽細胞に分化することが以前より報告され ているが，これらの細胞が CD９０に陽性を示す間葉 系幹細胞であった可能性が考えられた。一方，CD ７３においては今回の結果では陽性を示す細胞が認め られず，他の検索方法を検討していく必要であると 考えられた。 目的：齲蝕や歯髄炎の際には口腔内細菌由来毒素に より歯髄細胞は刺激を受けている。グラム陰性菌の 細胞壁成分である lipopolysaccharide（以下 LPS） は，細胞膜表面の toll like receptor４（TLR４）を 介して細胞内シグナルが活性化し，MAP キナーゼ 経路や NF-κB 活性化を導くことが知られている。 歯髄に存在する象牙芽細胞や歯髄細胞においても経 路が活性化されることが推測されるが，そのメカニ ズムには不明な点が多い。そこで，今回は歯髄細 胞に LPS を添加した際に LPS の受容体である toll like receptor４（TLR４），炎症性サイトカインであ る interleukin１β（IL-１β），interleukin６（IL-６）の 遺伝子の変化を検討した。 方法：本研究ではテロメラーゼを導入して不死化し たヒト歯髄細胞（HDP-TERT，広島大学・高田 隆 教授より供与）を使用した。細胞は D-MEM（１０％ FBS，１％ penicillin-streptomycin 添加）に２×１０５ 個/well の割合になるように，３５mm ディッシュに 播種し，２４時間後，１００ng/ml の E. coli 由来 LPS（Si-gma-Aldrich）を 添 加 し，６時 間 培 養 し た。培 養 後，TRIzol にて RNA を抽出し，定量ならびに逆 転写後，TaqMan Probe を用いた定量的 real-time PCR を行い，TLR４，IL-１β，IL-６の遺伝子発現の変 化について観察した。なお内在性コントロール遺伝 子には１８SrRNA を用い，対照群としては LPS の代 わりに D-MEM を添加し，同様に RNA 抽出を行っ たものを用いた。 成績および考察 ： 定 量 的 real-time PCR の 結 果 ， LPS を添加した群では対照群と比較して TLR４発現 は１．５倍増加した。同様に IL-１β，IL-６においても対 照群と比較して，それぞれ２．３倍，９．５倍，発現の増 加が認められた。本研究の結果からは，歯髄細胞に おいても LPS 刺激に対して TLR４からのシグナル 経路の活性化が起こり，結果として IL-１β，IL-６の 産生が促進されることが示唆された。
口
演
№１：ラット歯髄における間葉系幹細胞マーカーの局在
佐野陽祐，村松 敬，小林史枝，関谷紗世，佐古 亮，杉内亜紀奈，月野和隆，間 奈津子， 末原正崇，古澤成博（東歯大・保存）№２：ヒト歯髄細胞を lipopolysaccharide にて刺激した際のtoll like
receptor４，inter-leukin１
β，interleukin６の変化
杉内亜紀奈，村松 敬，小林史枝，関谷紗世，佐野陽祐，佐古 亮，月野和隆，間 奈津子， 末原正崇，古澤成博（東歯大・保存）
歯科学報 Vol．１１４，No．３（２０１４） ２８３
