骨補填材 の骨 誘導 に
炭 酸 ガ ス レー ザ ー が 及 ぼす 影 響
安 達 仁
Effects of Carbon Dioxide Laser Irradiation on Bone Deposition onto
Bone Replacement Materials
Hitoshi ADAcHI
Application of biomaterials that replace bone tissues is effective in jawbone regen‑
eration. It has been noted thatβ 一tricalcium phosphate(β 一TCP)can be applied in im‑
plant therapy fOr bone regeneration methods such as GBR and GTR. Mean while, it has been reported that carbon dioxide laser could induce bone formation in bone defects and thus could be applicable to bone regeneration therapy. This study investigated the ef‑
fects of laser irradiation on bone deposition onβ 一TCR or more specifically, the effects of laser irradiationβ 一TCP filled bone defects in rat tibiae. H‑E staining and soft x‑ray demonstrated that bone deposition aroundβ 一TCP particles was accelerated by laser irradiation as compared with that in the control on day 10 after treatment. Interest‑
ingly,alarger number of TRAP‑positive cells could be seen around theβ 一TCP particles in laser irradiated bones than to those in the control bones. These findings indicated that laser irradiation stimulated bone deposition onβ 一TCP particles as well as bone resorption. Furthermore, we focused on the function of osteocytes because they may
play important roles in controlling bone metabolism in response to mechanical force.
Alcian blue and Peanut agglutinin(PNA)lectin staining, which detects sugar chains in proteoglycans, demonstrated that osteocytes in cortical bone produced larger amounts of proteoglycans after laser irradiation than in the control. These findings suggested that laser irradiation promoted bone deposition onβ 一TCP via osteocytes irradiated by laser. In conclusion, carbon dioxide laser irradiation stimulated bone deposition onβ 一
TCP in bone defects in rat tibiae, and the combination of laser irradiation andβ 一TCP is available for bone regenerative therapy.
Key words:β 一TCP.CO21aser, rat, lectin
緒 言
近年,歯 科 保存治療 において顎 骨の再生 治療 は
重 要 な課 題 で あ る 。 これ ま で に,骨 欠 損 に対 す る 骨 増 生 の た め に種 々 の 生 体 材 料1)が使 用 され て き た 。 そ の 材 料 の一 つ と して,従 来,歯 科 あ る い は 受 付:平 成23年3月25日,受 理:平 成23年5月9日
奥 羽 人 学 歯 学部 歯 科 保 存学 講 座 保存 修 復 学 分 野 (指導:横 瀬 敏 志 教 授)
Division of Operative Dentistry, Department of Conservative Dentistry, Ohu University school of Dentistry
(Director:Prof:satoshi YokosE)
78 奥 羽 大 歯 学 誌
整 形 外 科 の 領 域 に お い て 自 家 骨 が 多 く 用 い ら れ て き た 。 自 家 骨 を 採 取 す る 場 合,骨 採 取 に よ る 外 科 的 侵 襲 が 大 き く,採 取 量 に も 限 界 が あ り,採 取 部 位 の 二 次 感 染 も 懸 念 さ れ て い る2,3)。人 工 骨 代 替 材 料 は こ れ ら の 問 題 点 を 解 決 で き る も の で あ り,骨 補 填 材 の 研 究 開 発 が 活 発 に な さ れ ハ イ ド ロ キ シ ア パ タ イ ト以 外 に も,移 植 後 に 骨 に 完 全 に 置 換 す る と さ れ る生 体 吸 収 性 の 人 工 骨 β 一 リ ン酸 三 カ ル シ ウ ム(β 一Tricalcium phosphate;以 下,β 一TCP) が 開 発 さ れ,注 目 さ れ て い る4)。Gaasbeekら5)は 人 の 脛 骨 骨 切 り 術 に β 一TCPを 用 い て 完 全 に 骨 に 置 換 す る 事 を 報 告 し て い る 。
一 方,現 在 歯 科 治 療 に お い て 日 々 新 し い 治 療 法 や 治 療 器 具 の 開 発 が 進 ん で お り,様 々 な 種 類 の レ ー ザ ー が 広 く応 用 さ れ て い る 。 一 般 に レ ー ザ ー は 高 出 力 レ ー ザ ー と低 出 力 レ ー ザ ー が あ り,高 出 力 レ ー ザ ー で はYAGレ ー ザ ー,炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー,ア ル ゴ ン レ ー ザ ー が 代 表 的 な レ ー ザ ー と し て 知 ら れ て お り,低 出 力 レ ー ザ ー に お い て は,半 導 体 レ ー ザ ー,ヘ リ ウ ム ネ オ ン レ ー ザ ー な ど が 代 表 的 な レ ー ザ ー と し て 知 ら れ て い る 。 こ れ ら の レ ー ザ ー の 中 で も 高 出 力 レ ー ザ ー に 分 類 され て い る 炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー は,レ ー ザ ー 照 射 時 に 起 こ る 表 面 組 織 の 蒸 散 な ど のHigh reactive‑Level Laser Therapy(以 下, HLLT)作 用 と 照 射 部 位 周 囲 に お け る 細 胞 増 殖,細 胞 の 活 性 化,治 癒 促 進
な ど のLow reactive‑Level Laser Therapy(LLLT) 作 用 を 比 較 的 容 易 に コ ン ト ロ ー ル で き る こ と や6・7), 組 織 表 面 で の 水 分 の 吸 収 性 が 高 く,非 接 触 型 で あ る
た め,感 染 の 危 険 も 少 な く,操 作 性 も 優 れ て い る 等 の 特 徴 を 持 っ て い る 。 塩 崎 ら8,9)は,ラ ッ ト脛 骨 に お け る 炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー 照 射 が 骨 芽 細 胞 の 分 化 を 刺 激 し,骨 形 成 が 顕 著 に 誘 導 さ れ た こ と を 示 し,ま た 田 島 ら10,11)は,ラ ッ ト耳 介 に お け る 炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー 照 射 が,筋 細 胞 に お け るmitogen‑
activated protein kinase(MAPK)で あ る extracellular signal‑regulated kinase 1/2 (ERk1/2)を リ ン 酸 化 し て 活 性 化 す る 事 か ら,細 胞 増 殖 を 誘 導 す る 事 を 報 告 し て い る 。 こ れ ら の 報 告 は,炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー 照 射 のLLLT作 用 を 示 す も の で あ り,組 織 の 治 癒 促 進 や 再 生 療 法 へ の 応 用 の 可 能 性 を 示 唆 す る も の で あ る 。 我 々 は こ れ ま
図1 炭 酸 ガ ス レ ーザ ー 照射
2011
左 側 の 欠 損 部 に10日 間 毎 日,皮 膚 上 か ら炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー を 照 射 し て い る 状 態 を 示 す 。
照 射 条 件 は,出 力0.5W,照 射 距 離10cmで40秒 照 射 (照 射 エ ネ ル ギ ー 密 度20J/cm2)。
で に,外 部 か らの 力 の 加 わ り方 に応 じて 骨 が形 成 さ れ る と い うWolffの 法 則12)に 従 い メ カ ニ カ ル フ ォ ー ス と して 炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー を使 用 し,骨 代 謝 に 及 ぼ す 影 響 を分 子 生 物 学 レベ ル で解 析 して き た13)。そ こ で,本 研 究 で はscaffoldと して骨 再 生 療 法 に 用 い られ て い る β一TCPを 用 い,炭 酸 ガ ス レー ザ ー と併 用 す る こ とで 骨 形 成 作 用 に 対 して ど の よ う な影 響 を与 え るか を調 べ る た め に 形 態 学 的, 細 胞 生 物 学 的 に解 析 し た。
材 料 および方法 1.実 験 動 物 と切 片 作 製
動 物 実 験 は 奥 羽 大 学 動 物 実 験 規 程 に従 って 行 っ た(動 物 実 験 許 可 番 号,平 成21年 度22号)。
7週 齢 の 雌 性sDラ ッ ト(日 本 ク レ ア,東 京) 各 群10匹 を 用 い,エ ー テ ル(和 光 純 薬,東 京) 麻 酔 下 で 無 痛 的 に実 験 を行 っ た 。 左 右 脛 骨 を観 血 的 に 露 出 さ せ,歯 科 用 ラ ウ ン ドバ ー に て 直 径 2.5mmの 骨 欠 損 を 作 製 し た。 そ の 欠 損 部 に5mg の β 一TCP(オ ス フ ェ リオ ン,オ リ ンパ ス 社 製, 東 京 〉 を埋 入 し縫 合 した 。 そ の 後,左 側 の 実 験 部 位 に は10日 間 毎 日,皮 膚 上 か ら炭 酸 ガ ス レ ーザ ー (オ ペ レ ー ザ ーLite:ヨ シ ダ製 作 所,東 京)を 照 射 し た(レ ー ザ ー照 射 群)(図1)。 照 射 条 件 は 出 力0.5W,照 射 距 離10cmで40秒 照 射(照 射 エ ネ
Vol.38 No.2 骨補 填 材 と炭 酸 ガ ス レー ザ ー:安 達 79
図2 軟 エ ック ス線 写 真
左側 は対 照 群,右 側 は レー ザ ー照 射 群 の脛 骨 を示 す 。 a:移 植 後5日 目
b:移 植 後10日 目 矢 印:β 一TCPの 埋 入 部位
ル ギ ー 密 度20J/cm2)を 行 っ た 。 右 側 の 欠 損 部 は 炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー を 照 射 し な い 対 照 群 と し た 。 実 験 開 始 後,5日,10日 目 に エ ー テ ル 麻 酔 を 行 い,局 所 麻 酔 に て 屠 殺 後,脛 骨 を 摘 出 し,5mm
各 の ブ ロ ッ ク に し て,た だ ち に 中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン(和 光 純 薬,東 京)に て4℃ の も と24時 間 固 定 し た 。 そ の 後10%EDTA(0.1M Tris‑HCI buffer, pH7.4,和 光 純 薬,東 京)に て20日 間 脱 灰 し,通 法 に 従 い エ タ ノ ー ル(和 光 純 薬,東 京 〉 に て 脱 水 後,パ ラ フ ィ ン(TissuePrep, Fisher Scientific, usA)に 包 埋 し4μmの 連 続 切 片 を 作 製 し た 。 こ れ ら の 切 片 に 対 し てHematoxylin‑Eosin(以 下,
H‑E)染 色,酒 石 酸 耐 性 酸1生 ホ ス タ フ ァ ー ゼ(以 下,TRAP)染 色, Alcian blue染 色(pH2.5)お
よ び 複 合 糖 質 結 合 蛋 白 質 で あ るLectin(Peanut agglutinin;PNA, Ricinus communis Agglutinin‑1;RCA‑1)染 色 を 行 っ た 。 2.染 色 方 法
一 般 染 色 と し てH‑E染 色,Alcian blue染 色 を, 通 法 に 従 っ て 行 っ た14)。TRAP染 色 はGaasbeek
ら5)の 方 法 に 従 っ て 行 っ た 。Lectin染 色 は,キ シ レ ン(和 光 純 薬,東 京)に て 脱 パ ラ フ ィ ン を 行 い エ タ ノ ー ル 系 列 で 親 水 後 ,内 因 性 ペ ル オ キ シ タ ー ゼ の 活 性 を 阻 害 す る た め に3%H202(和 光 純 薬,
80 奥 羽 大 歯 学 誌 2011
図3 H‑E染 色
a,b:移 植 後5日 目 c,d:移 植 後10日 目 a,c:対 照 群 b,d:レ ー ザ ー 照 射 群 (bar=200μm)
図4 骨 形 態 計 測 を用 い た 骨形 成 幅 a:移 植 後5日 目
b:移 植 後10日 目 *P<0.05
東 京)に5分 間 浸 漬 し た 。 次 い で0.01mol/Lリ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(PBS, pH7.4)に て 洗 浄 後, ペ ル オ キ シ タ ー ゼ 標 識 レ ク チ ン(Peanut
Agglutinin;PNA, Ricinus communis Agglutinin;RCA‑1,生 化 学 工 業,東 京)をPBS に て100倍 希 釈 し た も の を 室 温 に て20分 間 反 応 さ
Vol.38 No.2 骨 補 填材 と炭 酸 ガス レーザ ー:安 達 81
図5 TRAP染 色 a,b:移 植 後5日 目 c,d:移 植 後10日 目 a,c:対 照 群 b,d:レ ー ザ ー 照 射 群 (bar=200μm)
図6 TRAP陽 性 細胞 数
移植 後5日,10日 目の 対 照群 と レー ザ ー照 射 群 のTRAP陽 性 細 胞 数 を示 す 。 *P<0.05
せ た 。 そ の 後PBSで 洗 浄 し,Diaminobenzidine (DAB;ヒ ス ト フ ァ イ ンDAB基 質 キ ッ ト,ニ チ レ イ,東 京)に て 発 色 し た 。
3.エ ッ ク ス 線 分 析
エ ッ ク ス 線 分 析 に は エ ッ ク ス 線 フ ィ ル ム (Kodak社 製,東 京)と 軟 エ ッ ク ス 線 撮 影 装 置
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図7 Alcian blue染 色(pH2.5) a,b:移 植 後5日 目 c,d:移 植 後10日 目 a,c:対 照 群 b,d:レ ー ザ ー 照 射 群 (bar=50μm)
(RO‑M40:ソ フ ロ ン社 製,東 京)を 用 い た 。 撮 影 条 件 は,電 流2mA,管 電 圧40kVと し,照 射 時 間5secに て 撮 影 し た。
4.形 態 計 測
5日 と10日 の レ ー ザ ー 照 射 群 と対 照 群 のH‑E 染 色 した 切 片 の写 真 を撮 影 し画 像 上 で 新 生 骨 形 成 幅 を計 測 し た。 同 様 にTRAP陽 性 細 胞 数 を 計 測
した。
5.統 計 処 理
統 計 学 的 分 析 は,Mann‑Whitney検 定 を使 用 した 。P<0.05で 行 っ た 。
結 果
図2に,移 植 後5日(a),10日 目(b)の 軟 エ ッ ク ス線 写 真 を示 す 。5日 目の 軟 エ ッ ク ス 線 所 見 で は レー ザ ー照 射 群 と対 照 群 に,顕 著 な差 は み られ
な い が,10日 目の 所 見 で は レ ー ザ ー 照 射 群 の 脛 骨 に お い て β一TCPの 穎 粒 像 が禰 慢 性 の 不 透 過 像 と変 化 し,骨 へ の 置 換 が促 進 して い る傾 向 が み ら れ た。 さ ら に これ らの 変 化 を よ り詳 し く調 べ る た め に脱 灰 切 片 を作 製 した。
図3は 移 植 後5日(a),(b),10日 目(c),(d)の H‑E染 色 を示 す 。5日 目の対 照 群(図3‑a)と レー ザ ー 照 射 群(図3‑b)のH‑E染 色 で は,β 一TCP 穎 粒 の周 囲 に は炎 症 性 細 胞 を と も な っ た 結 合 組 織 の 増 殖 が み られ,こ の 段 階 で は 対 照 群,レ ー ザ ー 照 射 群 の骨 欠 損 部 に は,と もに 骨 形 成 は ほ と ん ど み られ ず,組 織 学 的 に は両 者 に 顕 著 な差 は認 め ら れ なか っ た 。10日 目 の対 照 群(図3‑c)と レ ー ザ ー 照 射 群(図3‑d)のH‑E染 色 で は,β 一TCP穎 粒 の 周 囲 に 骨 形 成 が 認 め られ,骨 へ 置 換 して い る 像 が 認 め られ た。 対 照 群 と レー ザ ー照 射 群 を比 較
Vol.38 No.2 骨 補填 材 と炭 酸 ガス レーザ ー:安 達 83
図8 PNA染 色
a,b:移 植 後5日 目 c,d:移 植 後10日 目 a,c:対 照 群 b,d:レ ー ザ ー 照 射 群 (bar=50μm)
して み る と,レ ー ザ ー照 射 群 の ほ うが 骨 へ の 置 換 が 尤 進 し て い る の が 観 察 され た(図3‑d)。 さ ら に これ らの所 見 を半 定 量 化 す る た め に,対 照 群 と レ ー ザ ー 照 射 群 で の β 一TCP周 囲 に で きた 新 生 骨 の 骨 形 成 幅 を骨 形 態 計 測 し,比 較 した 。 移 植 後5 日 目で は 対 照 群 と レー ザ ー照 射 群 の 間 の 骨 形 成 幅 に(図4‑a)有 意 差 は認 め られ な か っ た が,10日 目で は レー ザ ー照 射 群 の 骨 形 成 幅 が 有 意 に 高 い値 を 示 し,β 一TCPが よ り骨 へ 置 換 して い る事 が 分 か っ た(図4‑b)。
次 に β一TCPの 骨 置 換 に 伴 っ て み られ る 吸収 系 に 対 す る レ ー ザ ー 照 射 の 影 響 を 調 べ る た め に, TRAP染 色 を行 っ た。
図5に は,TRAP染 色 の所 見 を示 す 。 赤 色 に 染 色 さ れ たTRAP陽 性 細 胞 は,β 一TCP穎 粒 の 周
囲 に 存 在 し て お り,そ の 数 は 移 植 後5日 目 で は レ ー ザ ー 照 射 群 に 比 較 して 対 照 群 の方 が 多 くみ ら れ た(図5‑a,b)。 と こ ろが 移 植 後10日 目 に な る と, 逆 転 して レ ー ザ ー 照 射 群 に み られ るTRAP陽 性 細 胞 数 が 対 照 群 の もの に比 較 して 多 くな る事 が分 か っ た(図5‑c,d)。 さ ら に こ れ らの 結 果 を 明 確 に す る 為 に,図6にTRAP陽 性 細 胞 数 を 計 測 し た 結 果 を示 す 。 図6か ら分 か る よ う に,移 植 後5
日 目 の段 階 で は,TRAP陽 性 細 胞 数 は対 照 群 に比 較 して レ ー ザ ー 照 射 で は 有 意 に 減 少 し,10日 目 で は,レ ー ザ ー 照 射 に よ っ てTRAP陽 性 細 胞 数 が 対 照 群 に比 較 して 有 意 に増 加 した 。 以 上 の 事 か ら レ ー ザ ー 照 射 をす る事 に よ っ て 骨 形 成 を 尤 進 す る と同 時 に骨 吸 収 系 に も影 響 を 及 ぼ す こ とが 明 ら か に な っ た 。
84 奥 羽 大 歯 学 誌 2011
図9 RCA‑1染 色 a,b:移 植 後5日 目 c,d:移 植 後10日 目 a,c:対 照 群 b,d:レ ー ザ ー 照 射 群 (bar=50μm)
これ まで に骨 組織 は,外 部 か らの物 理 的 な刺 激 に対 して 骨 代 謝 が 調 節 され る こ と が 知 られ て い る が15),近 年,こ の 刺 激 を認 識 す る メ カ ニ ズ ム と し て 骨 細 胞 が注 目 され て い る。 本 研 究 に お い て も炭 酸 ガ ス レ ー ザ ーの 刺 激 に よ っ て骨 細 胞 の 機 能 が 変 化 す る か を,複 合 糖 質 の 糖 鎖 を 指 標 に 検 討 した 。 図7に は移 植 後,5日,10日 目のAlcian blue染 色 を示 す 。 レー ザ ー照 射 群(図7‑b)の 皮 質 骨 で は, 骨 細 胞 にAlcian blue染 色 性 を認 め た が,対 照 群 の 皮 質 骨 で の 骨 細 胞 に は,Alcian blueの 染 色 性 で 陽 性 反 応 が み られ な か っ た 。 移 植 後10日 目 の Alcian blue染 色 結 果 は,5日 目 と 同様 に レ ー ザ ー 照 射 群(図7‑d)の 皮 質 骨 で の 骨 細 胞 にAlcian blueの 染 色 性 を認 め,対 照 群 の 皮 質 骨 の 骨 細 胞
に は 陽性 反応 は み られ な か っ た 。 これ らの 所 見 は,
炭 酸 ガ ス レー ザ ー照 射 に よ り,皮 質 骨 欠 損 部 付 近 の骨 細 胞 で の 複 合 糖 質 の 合 成 に 変 化 が 生 じて い る こ と を示 す もの で あ る。 さ らに これ らの 変 化 を よ り詳 し く調 べ る た め に,糖 鎖 認 識 タ ンパ ク質 で あ る レ ク チ ン染 色 を 行 っ た。 図8は,ム チ ン型 糖 鎖 (0‑Link型)を 認 識 す るPNA染 色 結 果 を示 す 。 興 味 あ る こ と に レー ザ ー照 射 群 の 骨 欠 損 部 皮 質 骨 に み られ る骨 細 胞 で は,PNAの 局 在 が み られ た が,対 照 群 の骨 細 胞 で は,PNAの 局 在 は み られ な か っ た。 こ れ らの 結 果 はAlcian blue染 色 同様,
5日 目 と10日 目 と も に 同 じで あ っ た 。 図9に は, ア ス パ ラ ギ ン 型 糖 鎖(N‑Link型)を 認 識 す る RCA‑1の 染 色 結 果 を示 す 。 レ ー ザ ー 照 射 群 の5
日 と10日 目 の 皮 質 骨 の 骨 欠 損 部 付 近 の 骨 細 胞 に は,RCA‑1の 染 色 性 が み ら れ,対 照 群 に も同 様
VOl.38 No.2 骨補 填 材 と炭 酸 ガス レー ザ ー:安 達 85
の 染 色 性 が み られ た 。 そ して,そ の染 色 性 に は 違 い はみ られ な か っ た 。
考 察
骨 の 再 生 療 法 に お い て,骨 補 填 材 の応 用 は,重 要 な 役 割 を 占 め る。 こ れ まで に,ハ イ ドロ キ シ ア パ タ イ トやBMP等 の骨 補 填 材 を使 用 した 研 究 報 告 が な さ れ1,16),その 結 果 骨 補 填 材 と して の 具 備 す る 条 件 と して,組 織 親 和 性 が 良 好 で あ る こ と, 骨 組 織 の 修 復 過 程 を阻 害 しな い こ とな どが あ げ ら れ て い る。 こ れ らの 条 件 を満 た す 材 料 と して,近 年 リ ン酸 カ ル シ ウ ム 系 に属 す る β一TCPが 注 目 さ れ,整 形 外 科 や歯 科 領 域 に 多 く用 い られ る よ うに な り,こ れ に伴 い 多 くの 形 態 学 的 な基 礎 研 究 が 行 わ れ,組 織 親 和 性 を 含 め,そ の 有 用 性 が確 認 され て い る17〜32)。ま た,β 一TCPにBMP等 の 骨 形 成 因子 複 合 体 を応 用 す る こ と に よ り骨 形 成 能 を促 進 させ る な ど の 報 告 も あ り3),β 一TCPと 増 殖 因 子 や サ イ トカ イ ンの 併 用 が骨 形 成 促 進 に 有 用 で あ る こ とが 示 され て い る。 しか し,こ れ らの 方 法 は 臨 床 応 用 に お い て は二 次 感 染 や,予 期 で き な い 副 作 用 の懸 念 もあ り多 くの 問 題 を か か えて い る。 これ らの点 を配 慮 した 場 合,炭 酸 ガ ス レ ーザ ー は 骨 再 生 治 療 に有 用 で あ る事 が報 告9,11,13)され て い る こ と か ら β一TCPと の 併 用 の 有 用 性 が 期 待 で き る。 軟 エ ッ ク ス線 写 真 の 結 果 か ら β一TCP移 植 後5日 目 で の 対 照 群 と レ ー ザ ー 照 射 群 の 骨 形 成 量 に は変 化
が認 め られ な か っ た が,10日 目 に お い て は,レ ー ザ ー 照 射 群 の 方 が対 照 群 と比 較 して 骨 の 形 成 が促 進 され て い る こ とが 分 か っ た 。 これ は,炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー照 射 が β 一TCPの 骨 へ の置 換 を促 進 して い る こ と を 示 す も の で あ る。 こ れ ら の 所 見 は, H‑E染 色 に お い て も確 認 され,移 植 後5日 目 の β一TCP穎 粒 は,対 照 群 も レ ー ザ ー 照 射 群 も未 だ 骨 へ 置 換 され て い な い が,10日 目に な る と,レ ー ザ ー照 射 群 の β一TCP穎 粒 が 骨 基 質 に置 換 され て い る所 見 が み られ,レ ー ザ ー 照 射 に よ っ て 骨 へ の 置 換 が 促 進 して い る こ と が 推 測 さ れ る。 一 般 に β一TCPが 骨 に置 換 す る 過 程 は 坂 田 のが 報 告 して い る よ うに,β 一TCP穎 粒 の 周 囲 に 線 維 性 結 合 組 織 が 出 現 し,そ の 後 顯 粒 が 骨 基 質 に完 全 に 置 換 さ れ る。 これ らの 骨 置 換 過 程 は,ハ イ ドロキ シ アパ
タ イ トと異 な る と こ ろ で あ り,本 実 験 も同 じ メ カ ニ ズ ム に よ っ て 骨 置 換 が お きて い る も の と思 わ れ る。 さ ら に,レ ーザ ー 照 射 に よ る骨 置 換 量 を定 量 す る た め に形 態 計 測 を行 っ た 結 果,移 植 後5日 目 で は 著 明 な 変 化 は な か っ た も の の,10日 目 に お い て,レ ー ザ ー 照 射 群 は 対 照 群 と 比 較 し て, β 一TCP穎 粒 の 骨 置 換 幅 が 約2倍 に促 進 して い た。
こ れ らの 所 見 は,炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー 照 射 の刺 激 に よ って 骨 形 成 が 促 進 して い る こ と を示 して お り, 炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー 照 射 の刺 激 が 骨 芽 細 胞 の機 能 を 元 進 させ 骨 形 成 を促 進 させ る と い う塩 崎 ら9)の報 告 と同 じ結 果 に な っ た。
Gaasbeekら5)の 報 告 に よ る と,炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー は 骨 代 謝 に 対 して 骨 芽 細 胞 だ け で な く破 骨 細 胞 に も重 要 な影 響 を果 た して い る とい う。 そ こで 骨 吸 収 系 に 対 す る影 響 を 調 べ る た め にTRAP染 色 を 行 っ た。 対 照 群 で は β一TCP穎 粒 の 周 囲 に 破 骨 細 胞 が 認 め ら れ 経 時 的 にTRAP陽 性 細 胞 数 が 増 加 して い た。 しか し興 味 あ る こ と に,移 植 後5 日 目の 対 照 群 と レー ザ ー照 射 群 を比 較 す る と レー ザ ー 照 射 群 の 方 が 有 意 にTRAP陽 性 細 胞 数 が 抑 制 され て お り,10日 目で は逆 転 して レ ー ザ ー 照 射 群 の ほ うが 有 意 に 高 い 値 を しめ した 。 これ らの 結 果 は レー ザ ー照 射 に よ り初 期 段 階 で は 吸 収 系 を 抑 制 し,骨 形 成 を優 位 に させ る よ うに働 き,後 期 で は 吸 収 系 も形 成 系 も と もに 尤 進 す るHigh turn overを 誘 導 す る こ と が 示 唆 され た 。 こ れ らの 現 象 が,β 一TCPの 骨 置 換 を早 め る一 つ の メ カ ニ ズ ム に な っ て い る こ とは 十 分 に考 え られ る が,詳 細 な メ カニ ズ ム に つ い て は さ らな る実 験 が 必 要 で あ る。
次 に,炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー照 射 の刺 激 が どの よ う に骨 代 謝 に影 響 して い る か を考 え る 必 要 が あ る。
近 年,Bonewaldら33)は,骨 に か か る メ カ ニ カ ル フ ォ ー ス は,骨 細 胞 が 認 識 し,dendritic process を通 じて 骨 芽 細 胞 や,さ ら に は破 骨 細 胞 に影 響 を 与 え る と報 告 して い る。 さ ら に,力 を う け た骨 組 織 の 骨 細 胞 に はMEPE(Matrix extracellular phosphoglycoprotein)と い う糖 タ ンパ ク が 発 現 す る こ と がGluhak‑Heinrichら34)に よ っ て 報 告 さ れ て い る。 そ こで 本 研 究 に お い て も炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー 照 射 が骨 細 胞 の 機 能 に 影 響 す るか を調 べ
86 奥 羽 大 歯 学 誌
るた め に,プ ロ テ オ グ リカ ンに 注 目 した 。Cheng ら35)は力 を与 え た 骨 組 織 の骨 細 胞 で プ ロテ オ グ リ カ ンの 一 つ で あ る コ ン ドロ イチ ン硫 酸 の 合 成 に変 化 が み られ る こ と を報 告 して い る。 本 実 験 で み ら れ た 炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー 照 射 の 作 用 も メ カ ニ カ ル
フ ォ ー ス と考 え た場 合,骨 細 胞 が骨 代 謝 に影 響 し て い る 可 能 性 は十 分 に 考 え られ る。
Alcian blue染 色 を 行 っ た 結 果,レ ー ザ ー照 射 群 の 骨 細 胞 で の みAlcian blueの 反 応 が 認 め られ た 。 これ は,酸 性 ム コ 多糖 で あ る フ゜ロ テ オ グ リカ ンの 合 成 が 認 め られ る こ と を示 して い る。 さ ら に よ り糖 鎖 を確 認 す る為 に糖 鎖 結 合 タ ンパ ク質 で あ るLectin染 色 で は,0‑Link型 糖 鎖 に 結 合 す る PNAが レ ー ザ ー 照 射 群 の 骨 細 胞 に の み 局 在 して い た 。 一 方,N‑Link型 糖 鎖 に 結 合 す るRCA‑1 で は 対 照 群 と レ ー ザ ー 照 射 群 の 両 方 の 骨 細 胞 に局 在 を認 め,両 者 の 染 色 性 に は変 化 が み られ な か っ た 。PNAが 結 合 す る ガ ラ ク トー ス, N一 ア セ チ ル ガ ラ ク トサ ミン糖 鎖 は0‑Link型 糖 鎖 に 含 ま れ, ム チ ン型 糖 蛋 白 質 や プ ロ テ オ グ リカ ンで あ る コ ン
ドロ イ チ ン硫 酸 や デ ル マ タ ン硫 酸 に 含 ま れ る。
Takagiら36)は,ラ ッ ト脛 骨 の 骨 細 胞 に お い て コ ン ドロ イ チ ン硫 酸,デ ル マ タ ン硫 酸 が合 成 され る こ とを報 告 して い る。 した が って 本 研 究 に お い て も炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー が 骨 細 胞 に 作 用 し,そ の機 能 変 化 の 一 部 と して プ ロ テ オ グ リカ ン合 成 が充 進 し た もの と考 え る。 そ して骨 細 胞 が,骨 芽 細 胞 や 破 骨 細 胞 の 機 能 を コ ン ト ロ ー ル し,そ の 結 果 β一TCPの 骨 置 換 の尤 進 が誘 導 され て い る こ と は 十 分 に 考 え られ る。 しか しな が ら,骨 細 胞 が 具 体 的 に どの よ うな シ グ ナ ル を伝 達 して い るか は,本 実験 で は不 明 で あ る。 今 後,更 な る研 究 に お い て, 糖 タ ンパ ク や プ ロ テ オ グ リカ ンの 発現 が 骨 細 胞 の 骨 代 謝 調 節 因 子 と して 重 要 な 鍵 と な っ て い る事 を 解 明 す る 。
結 論
本 研 究 か ら,炭 酸 ガ ス レ ー ザ ー 照 射 の 刺 激 は, 骨 補 填 材 の 骨 誘 導 を促 進 させ る こ とが 明 ら か に な った 。 又,こ の メ カ ニ ズ ム に は骨 細 胞 が 関 与 す る こ とが 示 唆 され た 。
謝 辞
2011
稿 を終 え るに 当 た って,終 始 御 懇 篤 な る御 指導,御 校 閲 を賜 りま した奥 羽 大学 歯 学 部歯 科 保 存 学 講座 横 瀬 敏 志 教授 に心 か らの謝 意 を表 します 。 また,本 研 究 を遂 行 す るに あ た り,御 協 力 を い ただ い た教 室 員 各位 に感 謝 い た します 。
本 論 文 の 要 旨 は,第48回 奥 羽 大 学歯 学 会(平 成21年11 月14日 郡 山 市)に おい て 発表 した。
文 献
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著 者 へ の 連 絡 先:安 達 仁,(〒963‑8611)郡 山 市 富 田 町
字 三 角 堂31‑1 奥 羽 大 学 歯 学 部 歯 科 保 存 学 講 座
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