変異個体スクリーニング法の確立

熊本大学学位論文

Platinum TALEN による遺伝子破壊マウスの作製と

変異個体スクリーニング法の確立

2014

中川 佳子

本論文は学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである。

Screening methods to identify TALEN-mediated knockout mice

Yoshiko Nakagawa, Takashi Yamamoto, Ken-Ichi Suzuki, Kimi Araki, Naoki Takeda, Masaki Ohmuraya, Tetsushi Sakuma.

Exp. Anim., 63, 79-84 (2014).

Application of Oocyte Cryopreservation Technology in TALEN-Mediated Mouse Genome Editing

Yoshiko Nakagawa, Tetsushi Sakuma, Naomi Nakagata, Sho Yamasaki, Naoki Takeda, Masaki Ohmuraya, Takashi Yamamoto.

Exp. Anim., 63, 349-355 (2014).

Birth of mice from vitrified/warmed 2-cell embryos transported at a cold temperature

Toru Takeo, Takehito Kaneko, Yukie Haruguchi, Kiyoko Fukumoto, Hiromi Machida, Mik

a Koga, Yoshiko Nakagawa, Yumi Takeshita, Toyokazu Matsuguma, Shuuji Tsuchiyama, Norihiko Shimizu, Takanori Hasegawa, Motohito Goto, Hitoshi Miyachi, Masayuki Anzai, Ena Nakatsukasa, Koji Nomaru, Naomi Nakagata.

Cryobiology, 58, 196-202 (2009).

Short-term storage and transport at cold temperatures of 2-cell mouse embryos produced by cryopreserved sperm

Toru Takeo, Tomoko Kondo, Yukie Haruguchi, Kiyoko Fukumoto, Yoshiko Nakagawa, Yumi Takeshita, Yuko Nakamuta, Shuuji Tsuchiyama, Norihiko Shimizu, Takanori Hasegawa, Motohito Goto, Hitoshi Miyachi, Masayuki Anzai, Rie Fujikawa, Koji Nomaru, Takehito Kaneko, Yoshiaki Itagaki, Naomi Nakagata.

J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci., 49, 415-419 (2010).

その他の論文

Fertilization of C57BL/6 mouse sperm collected from cauda epididymides after preservation or transportation at 4 degrees C using laser-microdissected oocytes

Takehito Kaneko, Kiyoko Fukumoto, Yukie Haruguchi, Tomoko Kondo, Hiromi Machida, Mika Koga, Yoshiko Nakagawa, Shuuji Tsuchiyama, Kiyora Saiki, Shiho Noshiba, Naomi Nakagata.

Cryobiology, 59, 59-62 (2009).

目次

要旨・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

1

第1章 序論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 3 第2章 実験材料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10

2-1） Platinum TALEN

2-2） SSA

2-3） TALEN mRNA

2-4） 受精卵の準備および TALEN mRNA

2-5） GFP

2-6） HMA 2-7） RFLP

2-8） DNA

2-9） 精子の凍結融解および体外受精

2-10）

第3章 実験方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・15

3-1） 新鮮受精卵を用いた Platinum TALEN

変異個体スクリーニング法の検討

3-1-1） Platinum TALEN

3-1-2） TALEN

SSA

3-1-3） TALEN mRNA

3-1-4） pCAG-eGFP

3-1-5） TALEN mRNA

3-1-6） 胎仔あるいは産仔の蛍光観察

3-1-7） HMA

PCR

3-1-8） RFLP

3-1-9） PCR

3-2） 凍結融解受精卵を用いた Platinum TALEN

3-2-1） Platinum TALEN

SSA

3-2-2） Ayu8104

A）交配による受精卵の作製

B）体外受精による受精卵の作製

3-2-3） C57BL/6N

3-2-4） 変異個体スクリーニングのための解析

第4章 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 36

4-1)

Platinum TALEN

変異個体スクリーニング法の検討

4-1-1) TALEN mRNA

4-1-2) 細胞質へのインジェクション

4-1-3) 変異個体スクリーニングのための解析

4-2)

Platinum TALEN

4-2-1) Ayu8104

4-2-2) C57BL/6N

第5章 結論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 43

5-1)

Platinum TALEN

5-2)

5-3)

Platinum TALEN

第6章 図表・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 48 第7章 参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 69

謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 72

1

論文要旨

Platinum TALEN

中川 佳子

ジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease; ZFN) や

TALE

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic

repeats; CRISPR)

伝子改変法の新たなスタンダードとなりつつある。これらの技術をノックア ウトマウスの作製に適用するためには、人工ヌクレアーゼのインジェクショ ンによって得られた産仔の単純かつ容易なジェノタイピングの手法が広く求 められている。しかしながら、人工ヌクレアーゼを導入した個体群から目的 のミュータントマウスをスクリーニングする手法について、詳細に比較検討 した報告はこれまでなされていない。そこで、本研究において、

enhanced green fluorescent protein (eGFP)

Platinum TALEN

た

Platinum TALEN

SSA

るいはラットの受精卵へのインジェクションにおいて、従来の

TALEN

高効率な遺伝子破壊が可能であることが報告されていたが、マウスでの使用 実績がなかったため、Platinum TALENを用いて、ノックアウトマウスを作製 するための詳細な条件検討を行った。その結果、

F0

eGFP

2

解析、および

DNA

また、体外受精や胚凍結、精子凍結などの生殖工学技術は、遺伝子改変マ ウスの保存、個体化、輸送に不可欠な技術であるが、これらの技術が

TALEN

究では、

Platinum TALEN

mRNA

変マウスを作製する際、凍結融解受精卵を用いて外来遺伝子あるいは内在遺 伝子のターゲティングが可能か検討した。外来遺伝子の破壊においては、交 配後に採卵した凍結受精卵だけでなく、新鮮精子あるいは凍結精子を用いた 体外受精後の凍結受精卵も作製し、それぞれを融解後、インジェクションを 行った。内在遺伝子の破壊においては、

5

8

～12週齢雌マウスを交配に使用し、これらの凍結受精卵を融解してインジェ クションを行った。全ての実験区から得られた産仔について、

TALEN

TALEN

本研究において使用した変異個体スクリーニング法は、特別な設備や特に 高価な試薬類、あるいは洗練されたプロトコールを必要とする実験ではなく、

様々な生物においてゲノム編集技術の導入を試みる幅広い研究者に対して、

本研究は大いに役立つものと考える。さらに、体外受精や受精卵の凍結融解 などの生殖工学技術を活かすことにより、マウスの飼育費や作業者の負担が 軽減され、次世代型の遺伝子改変技術であるゲノム編集法を用いたノックア ウト／ノックインマウス作製の利便性が大いに高まると期待される。

3

第

1

これまでのノックアウトマウス作製では、ターゲティングベクターとゲノ ム

DNA

ES

ES

（zinc-finger nuclease; ZFN）や

TALE

effector nuclease; TALEN）などの部位特異的ヌクレアーゼや CRISPR/Cas

（clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPR）システムを 利用したゲノム編集が可能となり、ZFN、TALEN ではこれらの

mRNA

CRISPR/Cas

Cas9

RNA

DNA

（RNA-guided nuclease; RGN）の

mRNA

RNA（guide RNA）を目

Panda et al. 2013; Qiu et al. 2013; Sung et al. 2013; Wefers et al. 2013; Wu et al.

2013; Aida et al. 2014）

4

報 告 は これ ま でな され て い ない 。 そこ で、 本 研 究で は

enhanced green fluorescent protein; eGFP

TALEN

Platinum TALEN（広島大学山本研

single-strand annealing assay

やカエル、ラット受精卵へのインジェクションにおいて、従来の

TALEN

TALEN mRNA

Platinum

TALEN

が最良であった実験区の産仔を用いて、

eGFP

TALEN

Platinum TALEN

TALEN

FokI

DNA

モナス属から分泌される

TALE

DNA

TALE

34

12,13

variable di-residue; RVD）が標的 DNA

1

DNA

FokI

DNA

TALEN

二組の

TALEN

DNA

5

量体を形成し、スペーサー配列に

DNA

を引き起こす。

DSB

広島大学山本研究室では

ZFN

TALEN

TALEN

10

Golden Gate

TALEN

2013 a）、高速かつ簡便に、高活性な TALEN

Platinum TALEN

TALEN

mRNA

CMV

T7

destination vector

6

4

TALE

N

TALE

4

32

ずに

TALEN

様々な動物受精卵への

TALEN

TALEN

DNA

mRNA

DNA

DNA

6

でき（トランスジェニック個体にならずに）、かつ、迅速に

TALEN

目的とする培養細胞や生物個体に

TALEN

Surveyor

T7

I

DNA

PCR

et al. 2012）、

pBluescript II

PCR

lacZα遺伝子に挿入で

blue/white selection

lacZα遺伝子破壊測定法

（LacZ assay）（Hisano et al. 2013）、標的配列を含む

PCR

（heteroduplex mobility assay; HMA）（Ota et al. 2013）、スペーサー配列内の塩 基配列を特異的に認識切断する制限酵素を利用した制限酵素断片長多型解 析（restriction fragment length polymorphism; RFLP analysis）（Ochiai et al. 2010;

Ansai et al. 2013; Suzuki et al. 2013）

PCR

DNA

得られたキメラマウスの毛色により解析が容易な

ES

TALEN

明らかな表現型が出ない限り、ファウンダーマウス（

F0

7

同定法のうち、感度や再現性に問題がなく、特別な機器や高価な試薬、洗練 されたプロトコールを必要としない

HMA、RFLP

eGFP

TALEN

eGFP

また、熊本大学生命資源研究・支援センター中潟研究室では、マウス胚・

精子の凍結バンク業務を行うと共に、新たなマウス生殖工学技術の開発、改 良、確立を目的として研究を行っており、中潟研究室にて確立された生殖工 学技術の多くは世界的にも注目されている（Guan et al. 2012）。精子の凍結 保存と融解法の開発、C57BL/6 マウスの凍結融解精子を用いた体外受精や

129、 BALB/c、ICR

躍的に向上させたこと、冷蔵保存あるいは冷蔵輸送されたマウス精巣上体尾 部を用いた効率的な体外受精法の開発、

2

2

2

2

保冷剤とともに発砲スチロール容器に梱包後、一般的な宅配便で送る簡便な ものであり、ドライシッパーは必要ない。また、輸送先では

2

受精卵へのインジェクションによるゲノム編集技術を用いてノックアウ

8

トマウスやノックインマウスを作製している施設では、一般的に、過排卵処 理をした雌マウスを個別飼育した雄マウスと交配させ、膣栓が確認された雌 マウスから受精卵を採卵し、インジェクションに使用している（Davies et al.

2013; Ma et al. 2013; Panda et al. 2013; Qiu et al. 2013; Sung et al. 2013; Wefers et al. 2013; Wu et al. 2013; Aida et al. 2014）

体外受精や精子および受精卵の凍結融解などの生殖工学技術がトランス ジェニックマウスの作製に応用可能であることは、これまでの研究により明 らかとなっていたが（Nakagata N. 1996）、TALENなどの部位特異的ヌク レアーゼを用いたゲノム編集による遺伝子改変マウス作製にも応用可能か 否かは、これまで明らかにされていない。そのため、本研究では、交配によ り得られた受精卵、新鮮精子あるいは凍結融解精子を用いた体外受精により 得られた受精卵を凍結融解し、

TALEN

TALEN

をコードする 1 コピーの外来遺伝子をもつ

Ayu8104

Imaizumi

et al. 1999）、bL

9

の採取には、様々な施設において、幼若雌マウスと性成熟後の雌マウスのど ちらも使用されている。そのため、

5

8-12

C57BL/6

C

の

TALEN mRNA

ウスの週齢に左右されることなく、内在遺伝子の破壊が可能か否かを調べた。

bL

10

第2章 実験材料

ここでは、実験を進める上で重要な試薬やキット、機器について記載する。

DNA

2-1）Platinum TALEN

・Platinum Gate TALEN Kit (Addgene cat.#1000000043)

Kit

P1-4HD, p1-4NG, p1-4NI,p1-4NN

16

Module plasmids

pFUS2_a1a, a2a, a2b, a3a, a3b, a4a, a4b, b1, b2, b3, b4

11

1

4

Intermediate array plasmids（スペクチノ

ptCMV-136/63-VR-HD, NG, NI, NN

ptCMV-153/47-VR-HD, NG, NI, NN

8

Destination vectors（アンピシリン耐性）

・BsaI-HF (NEB cat.#R3535S)

・Esp3I (Thermo Scientific cat.#ER0452)

・

Quick Ligation Kit (NEB cat.#M2200S)

ChargeSwitch-Pro Plasmid Mini Kit (Life Technologies cat.#CS30250)

11

・PCRプライマー

pCR8 F1: 5′- TTGATGCCTGGCAGTTCCCT-3′

pCR8 R1: 5′- CGAACCGAACAGGCTTATGT-3′

TALE-F: 5′-GAGCACCCCTCAACCTGACCCCAG-3′

TALE-R: 5′- CTCGAAAGCTGGGCCACGATTG-3′

2-2）SSA

・pGL4-SSA vector (Addgene cat.#42962)

・ChargeSwitch-Pro Plasmid Mini Kit (Life Technologies cat.#CS30250)

・KpnI (NEB cat.#R0142S)

・HEK293T細胞

・Lipofectamine LTX (invitrogen cat#15338-100)

・Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega cat#E2920)

・TriStar LB 941 plate reader (Berthold Technologies)

2-3）TALEN mRNA

・SmaI (TAKARA cat.#1085A)

・QIAquick PCR purification kit (Qiagen cat.#28104)

・mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit (Life technologies cat.#AM1345)

・RNeasy Mini kit (Qiagen cat.#74104)

2-4）受精卵の準備および TALEN mRNA

・

pregnant mare serum gonadotropin (PMSG; Serotropin; Aska Pharmaceutical)

・human chorionic gonadotropin (hCG; Veterinary Puberogen; Novartis Animal

12

Health)

・Hyaluronidase (SIGMA cat.#H-3506)

・potassium simplex optimized medium with amino acids (KSOM-AA; 自家作製）

・流動パラフィン（ナカライテスクcat.#26137-85）

・流動パラフィン軽質（ナカライテスクcat.#26144-85）

・10×RNase-free PBS (Life technologies cat.#AM9624)

・pCAG-eGFPホモマウス（B6;D2-Tg (CAGEGFP)49SImeg; CARD ID: 267;

http://cardb.cc.kumamoto-u.ac.jp/transgenic/strainsDetailAction.do?strainId=26 7）

・採卵用雌マウス（pCAG-eGFPマウス用）

C57BL/6NCrlCrlj (Charles river Japan)

・Ayu 8104ホモマウス（Imaizumi et al. 1999）

・採卵用雌マウス（Ayu 8104マウス用）

Jcl: ICR (CLEA Japan)

C57BL/6NCrlCrlj (Charles river Japan)

・偽妊娠雌マウス

Jcl: ICR (CLEA Japan)

・実体顕微鏡

・倒立顕微鏡

・マイクロマニピュレーター一式（ナリシゲ）

2-5

GFP

・蛍光顕微鏡

・

UV-LED

13

2-6）HMA

・DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen cat.#69504)

・LA Taq DNA polymerase (TAKARA cat.#RR002A)

・PCRプライマー

eGFP-F: 5′- CCTCGTGACCACCCTGACCTAC-3′

eGFP-R: 5′-CTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGC-3′

bL-F: 5′-GTATTCAACATTTCCGTGTCGCC-3′

bL-R: 5′-GATAATACCGCGCCACATAGCAG-3′

Clec4b1-F: 5′-GGCTATCTCTGTGGTATTTAGCTC-3′

Clec4b1-R: 5′-CCACTTGTCTGCATGGTTAC-3′

2-7）RFLP

・Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega cat.#A9281)

・AccII (TAKARA cat.#1002A)

・HphI (New England Biolabs cat.#R0158S)

・Hpy188III (New England Biolabs cat.#R0622S)

2-8）DNA

・pGEM -T Easy Vector Systems (Promega cat.#A1360)

・Mini plus Plasmid DNA Extraction system (VIOGENE cat.#GF2002) ・

EcoRI (NIPPON GENE cat.#314-00112)

・

SP6 primer (5′-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3′)

・BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v1.1 (Life Technologies

14

cat.#4337450)

・ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies)

2-9）精子の凍結融解および体外受精

・pregnant mare serum gonadotropin (PMSG; Serotropin; Aska Pharmaceutical)

・human chorionic gonadotropin (hCG; Veterinary Puberogen; Novartis Animal

Health)

・CARD MEDIUM体外受精用培地（九動）

・FERTIUPマウス精子前培養培地（九動）

・FERTIUPマウス精子凍結保存液（九動）

・0.25ml Plastic straw （IMV）

・Human tubal fluid (HTF) 培地（自家作製）

・流動パラフィン（ナカライテスク

cat.#26137-85）

2-10）受精卵の凍結融解

・1M DMSO 溶液（1 M dimethyl sulfoxide in PB1; 自家作製）

・DAP213 溶液

(2 M DMSO, 1 M acetamide, 3 M propylene glycol in PB1; 自家作製)

・0.25M sucrose 溶液 (0.25M sucrose in PB1; 自家作製)

・KSOM-AA

・流動パラフィン（ナカライテスク

cat.#26137-85）

15

第3章 実験方法

3-1）

Platinum TALEN

3-1-1）Platinum TALEN

Platinum TALEN

Platinum TALEN

TALEN

SSA

SSA

addgene

（Platinum TALENの構築法

https://www.addgene.org/TALEN/PlatinumGate/）

（SSA アッセイ

http://www.addgene.org/TALEN/Yamamotolab/）

addgene

1.

TALEN Targeter

eGFP TALEN

eGFP Platinum TALEN

1

2.

RVD

HD、A

NI、T

NG、G

NN（NG）を使用する。ラス

destination vector

Left TALEN (20

pFUS2 a4a a4b a4c a4d b3

HD NG NG HD / NI NI NN NN / NI HD NN NI / HD NN NN HD / NI NI HD

16

Right TALEN (18

pFUS2 a4a a4b a4c a4d b1 HD NN HD HD / HD NG HD NN / NI NI HD NG / NG HD NI HD / HD

3.

Golden Gate

混合し、制限酵素による切断とライゲースによる連結反応を繰り返す ことにより、モジュールを順番通りに連結し、ベクターに組み込むこ とができる画期的な方法である。この

Golden Gate

Left TALEN

pFU2a

4

pFU2b

3

Right TALEN

pFU2a

4

pFU2b

1

1 module 3 modules 4 modules 25ng/µl pFU2 vector 0.3µl

50ng/µl module

0.3µl×1 0.3µl×3 0.3µl×4 10×T4 DNA ligase buffer 0.2µl

Quick ligase 0.1µl BsaI-HF 0.1µl

SDW 1µl 0.4µl (0.1µl) Total 2µl

37℃ 5

1

3

4℃

にて反応を終了した。

さらに、10×NEBuffer 4 0.25µl, 10×BSA 0.25µl, BsaI-HF 0.1µlを 加え

50

30

80

5

4

17

4.

0.5µl

XL1-Blue

10µl

LB

X-gal

IPTG

5.

PCR

10×buffer for Hybripol 0.8µl 100mM dNTP mix 0.64µl 10µM primer (pCR8 F1) 0.16µl 10µM primer (pCR8 R1) 0.16µl 50mM MgCl

0.24µl Hybripol DNA polymerase (BIOLINE) 0.04µl SDW 5.96µl Total 8µl

95℃ 30s

↓ 95℃ 15s

55℃ 15s 27cycles 72℃ 15s

↓ 72℃ 15s

↓ 4℃ ∞

各コロニーのレプリカプレートを作製した。

PCR

3

1

350bp

1

100bp

1

18

に約

100bp

モジュールの連結ができたクローンと判定し、このクローンの大腸菌 を

100µg/ml Spectinomycin

LB

2ml

37℃、一晩培養

ChargeSwitch-Pro Plasmid Mini Kit

濃度を測定後

50ng/µl

6.

2

各々連結されたモジュール（a4a-a4dと

b3

b1）

Golden Gate

50ng/µl pFUS2 a 0.6µl×4 50ng/µl pFUS2 b 0.6µl 50ng/µl ptCMV vector 0.3µl 10×T4 DNA ligase buffer 0.4µl Esp3I 0.2µl Quick ligase 0.2µl Total 4µl

37℃ 5

1

6

4℃

にて反応を終了した。

さらに、10×Tango buffer 0.5 µl, 10mM DTT 0.5 µl, Esp3I 0.2 µlを加え

37℃で 60

5

7.

2µl

XL1-Blue

20µl

LB

X-gal

IPTG

37

19

8.

PCR

10×buffer for Hybripol 0.8µl 100mM dNTP mix 0.64µl 10µM primer (TALE-F) 0.16µl 10µM primer (TALE-R) 0.16µl 50mM MgCl

0.24µl Hybripol DNA polymerase (BIOLINE) 0.04µl SDW 5.96µl Total 8µl

95℃ 30s

↓ 95℃ 15s

66℃ 15s 27cycles 72℃ 50s

↓ 72℃ 50s

↓ 4℃ ∞

各コロニーのレプリカプレートを作製した。

反応液を

1％アガロースゲルで電気泳動した。

第

1

1

100bp

100µg/ml Ampicillin

LB

2ml

20

ChargeSwitch-Pro Plasmid Mini Kit

定量後

200ng/µl

3-1-2） TALEN

SSA

作製した

TALEN

SSA

et al. 2010）

ヌクレオチドを作製し、アニールさせた

2

TALEN

HEK293T

酵素活性をもとに

TALEN

SSA

pGL4-SSA vector

TALEN

BsaI BsaI

5’-CTAGGGTCTCT/GTCGTGCCCGGGTACTGATGT/ACCGTGAGACCTAGGA-3’

3’-GATCCCAGAGACAGC/ACGGGCCCATGACTACATGGC/ACTCTGGATCCT-5’

1. pGL4-SSA vector

BsaI

にて保存した。（BsaI 処理の後、ベクターの脱リン酸化は行わない。）

BsaI

4

2.

Sense

Antisense

21

アニール後、網掛けにした

4

黒字はそれぞれが相補的な配列となっている。

3.

10×buffer 1µl 50µM Sense oligonucleotides 1µl 50µM Antiense oligonucleotides 1µl SDW 7µl Total 10µl

10×buffer

400mM Tris-HCl (pH 8), 200mM MgCl2, 500mM NaCl

0.2ml

95℃で 5

90

25℃まで徐々に温度を下げる。

4. 1

pGL4-SSA vector

3

2

2µl

XL1-Blue

20µl

LB

5.

37℃一晩培養後、

ChargeSwitch-Pro Plasmid Mini Kit

150ng/µl

6.

1

KpnI

このプラスミドを

KpnI

2

22

3,800bp

1,800bp

DNA

KpnI

7. Lipofectamine LTX

HEK293T

・10cm dishに

70-80% confluent

HEK293T

・以下の混合液を作製し、6µlを

DNA

200ng/µl left TALEN expression vector 1.5 µl 200ng/µl right TALEN expression vector 1.5 µl 150ng/µl SSA reporter vector 1 µl 30ng/µl pRL-CMV 1 µl Nuclease-free water 4 µl

・DNA希釈用と

Lipofectamine LTX

DMEM

25µl×

サンプル数量準備する。

・96wellプレートの

1well

DNA

DMEM

25µl

DNA

6µl

・Lipofectamine LTX希釈用の無血清

DMEM

1well

0.7µl

LTX

LTX

5

1well

25µl

・HEK293T 細胞を培養している

10cm dish

15% FBS-DMEM

細胞数を計測し、

6×10

cells/ml

・LTXを

96well

30

を

1well

100µl

37

5% CO

23

・トランスフェクションの

24

8. Dual-Glo Luciferase Assay System

TriStar LB 941 plate reader

3-1-3）TALEN mRNA

1. SSA

TALEN

SmaI

2. QIAquick PCR purification kit

RNase-free water

3.

TALEN

T7 RNA polymerase promoter

T7 2×NTP/ARCA 10μl 10×T7 Reaction Buffer 2μl DNA template (0.1μg) 6μl T7 Enzyme mix 2μl Total 20μl

混合液を

37℃で 2

5’末端にキャ

mRNA

反応後、

TURBO DNase

1μl

37℃で 15

DNA

4. mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit

Poly (A)

24 上記反応液

20μl

Nuclease-free water 36μl 5×E-PAP buffer 20 μl 25mM MnCl

10μl ATP solution 10μl Total 96μl

上記の溶液を混合した後、E-PAP を

4μl

45

5. RNeasy Mini kit

mRNA

mRNA

1μg

3-1-4）pCAG-eGFP

TALEN

eGFP

2

1.

10

Jcl: ICR

翌日、膣栓が確認できた雌マウスを偽妊娠雌マウスとして

TALEN mRNA

2. 6cm dish (IWAKI cat.#1010-060)

1mg/ml

KSOM-AA

500μl

1

KSOM-AA

100μl

3

37℃、5% CO

3. TALEN mRNA

pCAG-eGFP

PMSGとhCGを48時間間隔で

25

各

5単位ずつ腹腔内投与することにより、過排卵処理した5週齢の

C57BL/6NCrlCrlj

4.

卵巣をとりだした。3で準備した6cm dishのヒアルロニダーゼを含む

KSOM-AAドロップへ、卵管膨大部から卵子塊を導入した。卵丘細胞

5.

TALEN mRNAのイ

3-1-5）TALEN mRNA

1. 9cm

IWAKI）にフェノールレッドを含まない

KSOM-AA

5% CO

2.

100、 150ng/µl

TALEN mRNAをインジェクションした（図 3）

3.

37℃、5% CO

26

て

1

4.

偽妊娠1日目ICR雌マウスの卵管へ移植した。

3-1-6）胎仔あるいは産仔の蛍光観察

12.5

翌日に

UV-LED

3-1-7）HMA

PCR

1.

1

Blood & Tissue Kit

DNA

DNA

2. eGFP TALEN

DNA

PCR

Genomic DNA (250-500ng) 5µl

10× buffer for La Taq 5µl

dNTP mix (2.5mM each)

7.5µl

10µM primer (eGFP –F) 2.5µl

10µM primer (eGFP –R) 2.5µl

25mM MgCl

5µl

LA Taq DNA polymerase 0.5µl

SDW 22µl

Total 50µl

27

94℃ 2m

↓ 94℃ 30s

64℃ 30s 38cycles 72℃ 20s

↓ 72℃ 5m

↓ 4℃ ∞

3. PCR

3µl

3%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマ

イドにより染色した。UVを照射し、ゲルを撮影した。残りの

PCR

RFLP

3-1-8）RFLP

1.

PCR

Wizard SV Gel and PCR Clean-up System

AccII

PCR

Purified PCR product 3µl 10×M buffer 1µl AccII 0.15µl SDW 5.85µl Total 10µl

上記の反応液を

37℃で一晩インキュベートした。

2. 3%アガロースゲルで全量を電気泳動し、エチジウムブロマイドにより

染色した。

UV

28

3-1-9）PCR

1.

PCR

pGEM -T Easy vector

2×Rapid Ligation buffer 2.5µl pGEM -T Easy vector 0.1µl PCR product 0.17µl T4 DNA Ligase 0.5µl SDW 1.73µl Total 5µl

上記の反応液を

16℃で 1

2.

1.25µl

XL-1 Blue

10µl

3.

LB-Amp

4. Mini plus Plasmid DNA Extraction system

5.

DNA

EcoRI

Plasmid 5µl

10×H buffer 1µl

EcoRI 0.3µl

SDW 3.7µl

Total 10µl

29

37℃で 30

6. 2%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドにより染色し

た。UVを照射し、ゲルを撮影した。

7.

DNA

BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit

Ready Reaction Premix 2µl 5×BigDye Sequencing buffer 4µl T7 or SP6 primer (1.6pmol) 1.6µl Plasmid (80-150ng) 1µl SDW 11.4µl Total 20µl

96℃ 1m

↓ 96℃ 10s

50℃ 5s 25cycles 60℃ 2m

↓ 4℃ ∞

8.

100%エタノール 50µl

3M

5

15

70%

200µl

5

Hi-Di Formamide

95℃

で

2

ABI

PRISM 3130 Genetic Analyzer

30

3-2）凍結融解受精卵を用いた Platinum TALEN

製

基本的に、前述の

eGFP

3-2-1）Platinum TALEN

SSA

eGFP Platinum TALEN

bL

Clec4b1

Platinum TALEN

destination vector

ptCMV-153/47-VR

bL

Clec4b1 Platinum TALEN

10

SSA

Clec4b1 TALEN

2

pGL4-SSA vector

TALEN

んだ。

HEK293T

セイは、前述と同様の方法で行った。

3-2-2）Ayu8104

Ayu8104

bL

（Imaizumi

et al. 1999）

1

ICR

Ayu8104

TALEN

bL