学 位 論 文 内 容 の 要 旨
博 士 の 専 攻 分 野 の 名 称 博 士 （ 医 学 ） 氏 名 大 西 礼 造
学 位 論 文 題 名
ラ ッ ト
dextran sulfate sodium
誘 発 腸 炎 モ デ ル に 対 す る
ヒ ト 羊 膜 由 来 間 葉 系 幹 細 胞 投 与 の 効 果
(Human Amnion-Derived Mesenchymal Stem Cell Transplantation
Ameliorates Dextran Sulfate Sodium-Induced Severe Colitis in Rats)
【 背 景 】
近 年 、 様 々 な 疾 患 領 域 に お い て 細 胞 を 用 い た 再 生 医 療 研 究 が す す め ら れ て お り 、 骨 髄 、 脂 肪 な ど に 存 在 す る 間 葉 系 幹 細 胞(MSC)も 細 胞 ソ ー ス の 一 つ と し て 期 待 さ れ て い る 。
MSCは 中 胚 葉 由 来 の 体 性 幹 細 胞 で あ り 、自 己 複 製 能 を 有 し 、脂 肪 細 胞 、骨 細 胞 、軟 骨 細
胞 な ど 様 々 な 細 胞 へ 分 化 す る こ と が で き る 。 ま た 免 疫 調 整 作 用 を 有 し て い る こ と も 最 近 明 ら か と な り 、 組 織 再 生 療 法 だ け で は な く 、 炎 症 性 疾 患 や 自 己 免 疫 疾 患 な ど へ の 有 効 な 治 療 法 の 一 つ と し て 国 内 外 で 臨 床 試 験 が 進 め ら れ て い る 。 再 生 医 療 材 料 と し て 最 も 多 く 用 い ら れ て い る MSC は 、 骨 髄 由 来 の も の で あ る 。 し か し 、 骨 髄 か ら 採 取 す る 場 合 、 身 体 へ の 侵 襲 を 伴 い 、 一 度 の 採 取 で 得 ら れ る 細 胞 数 は ご く わ ず か で あ る こ と か ら 、 移 植 に 必 要 な 細 胞 数 を 確 保 す る に は 長 期 の 培 養 期 間 を 要 す る 。 さ ら に MSC の 増 殖 能 は 加 齢 に 伴 い 低 下 す る こ と が 報 告 さ れ て お り 、 ド ナ ー が 高 齢 で あ っ た 場 合 や 、 疾 患 を 持 っ た 患 者 か ら 採 取 す る 場 合 な ど は 、 治 療 に 必 要 な 量 の 質 の 高 い 細 胞 を 獲 得 す る こ と は 困 難 で あ る こ と が 予 想 さ れ 、 細 胞 治 療 に お け る 大 き な 障 害 と な る 。 こ れ ら の 問 題 点 は 脂 肪 組 織 由 来 の MSC も 同 様 で あ る 。
そ こ で 新 た な 細 胞 ソ ー ス と し て 羊 膜 に 注 目 し た 。 ヒ ト 羊 膜 に は 豊 富 に MSC が 含 ま れ て い る こ と が 知 ら れ て お り 、 よ り 若 い 細 胞 を 大 量 に 獲 得 で き る と い う 利 点 を 持 っ て い る 。 ま た 羊 膜 を 含 む 卵 膜 そ の も の は 医 療 廃 棄 物 と し て 出 産 後 に 廃 棄 さ れ て し ま う こ と か ら 、 倫 理 的 問 題 を 軽 減 で き る と 考 え ら れ る 。よ っ て 羊 膜 由 来MSC (AMSC)は 新 た な 再 生 医 療 材 料 と し て 期 待 で き る 。
今 回 想 定 し た 治 療 対 象 疾 患 で あ る ク ロ ー ン 病 は 、 口 腔 か ら 肛 門 に い た る ま で の 消 化 管 の ど の 部 位 に も 炎 症 や 潰 瘍 を 引 き 起 こ し 、 腹 痛 や 下 痢 、 血 便 、 体 重 減 少 な ど を 生 じ さ せ る 疾 患 で あ る 。 こ れ ま で ク ロ ー ン 病 発 症 に は 常 在 菌 に 対 す る 自 然 免 疫 の 制 御 機 構 の 破 綻 が 関 わ っ て い る と 想 定 さ れ 、 腸 内 細 菌 抗 原 に よ る 慢 性 的 な 刺 激 や 、 免 疫 担 当 細 胞 の 過 剰 誘 導 な ど が 原 因 の 一 つ と 考 え ら れ て い る 。 若 年 層 で の 発 症 が 顕 著 で 、 本 邦 に お い て は 患 者 数 は 増 加 の 一 途 を た ど っ て い る 。TNF- 阻 害 薬 な ど の 新 規 治 療 薬 が 開 発 さ れ 、 良 好 な 治 療 効 果 が 報 告 さ れ て い る も の の 、 既 存 の 治 療 が 奏 功 し な い 重 症 例 で は 、 腸 管 切 除 や 腸 瘻 増 設 術 と い っ た 外 科 的 治 療 を 必 要 と す る 場 合 も 少 な く な い 。
各 種 疾 患 動 物 モ デ ル に 対 す るMSC投 与 の 効 果 は 報 告 さ れ て い る が 、MSCの 抗 炎 症 効 果 の メ カ ニ ズ ム に 関 し て の 報 告 は 多 く は な い 。 前 述 し た ク ロ ー ン 病 発 症 の 要 因 と し て 、 常 在 菌 に 対 す る 自 然 免 疫 の 制 御 機 構 の 破 綻 に つ い て 述 べ た が 、 細 菌 抗 原 に よ る 刺 激 は 下 流 の
NF- B signaling pathwayを 活 性 化 す る 。つ ま り 炎 症 性 腸 疾 患 に お け る 腸 管 粘 膜 の 炎 症 に は
NF- Bが 深 く 関 与 し て い る 。NF- Bは 阻 害 蛋 白 質 inhibitor Bと 結 合 す る こ と で 不 活 性 な
状 態 で 細 胞 質 に 存 在 し て い る 。 そ こ へ 細 胞 表 面 受 容 体 に 抗 原 刺 激 が 加 わ る こ と で 酵 素 複 合 体 で あ るinhibitor B kinaseが 活 性 化 さ れ 、inhibitor Bが 分 解 さ れ る と 、NF- Bが 表 在 化 し 核 内 に 移 行 す る こ と で 目 的 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 が 起 こ る と さ れ て い る 。
【 目 的 】
【 材 料 と 方 法 】
倫 理 委 員 会 の 承 認 後 、 帝 王 切 開 に よ る 胎 児 娩 出 後 の 卵 膜 を 母 親 の 同 意 を 得 て 採 取 し 、 用 手 的 に 卵 膜 を 羊 膜 と 絨 毛 膜 に 剥 離 し た 。 羊 膜 を 細 切 後 、 コ ラ ゲ ナ ー ゼ 処 理 し 、10%胎 仔 ウ シ 血 清 を 用 い て 培 養 し た 。8週 齢 の 雄 性SDラ ッ ト に 対 し て 、DSSを ミ ネ ラ ル ウ ォ ー タ ー に 溶 解 し8%濃 度 に し たDSS溶 解 液 を 自 由 飲 水 さ せ る 形 で5日 間 経 口 投 与 し 、持 続 す る 非 常 に 強 い 腸 炎 を 発 症 さ せ た 。AMSC は 、DSS 溶 解 液 投 与 開 始 2日 目 に 1 10
6
個 を200 μl の 生 理 食 塩 水 に 浮 遊 さ せ 陰 茎 静 脈 よ り 投 与 し た 。細 胞 投 与 後4日 間 の 体 重 の 変 化 お よ び 臨 床 的 重 症 度 を 評 価 し た 後 、屠 殺 し て 大 腸 の 長 さ を 計 測 し 、DSSに よ る 腸 管 粘 膜 障 害 の 強 い 直 腸 の 病 理 ス コ ア 評 価 を 行 っ た 。ま た 、同 部 位 か らmRNAを 抽 出 し 、炎 症 性 サ イ ト カ イ ン・ ケ モ カ イ ン の 発 現 を 定 量 的RT-PCR法 で 測 定 し た 。ラ ッ ト 血 清 を 用 い て 、ELISA法 で 血 中
MCP-1濃 度 を 測 定 し た 。 直 腸 標 本 をmyeloperoxidase染 色 や 抗 CD68抗 体 、 抗CD163抗
体 、 抗CD3抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 を 行 い 評 価 し た 。
マ ウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ 細 胞(RAW264.7)と AMSC を 共 培 養 も し く は AMSC の 培 養 上 清
(CM)を 添 加 し 、LPS刺 激 を 行 っ て24時 間 後 に 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 発 現 を 定 量 的RT-PCR
法 お よ びELISA法 で 測 定 し た 。NF- B結 合 配 列 を 付 加 し た luciferase plasmid DNAを 導 入 し た HEK293 細 胞 を 、AMSC と 共 培 養 ま た は CM で 培 養 さ せ た 後 に 、TNF- ま た は LPS で 6 時 間 刺 激 し ル シ フ ェ ラ ー ゼ ・ ア ッ セ イ に て 測 定 し た 。RAW264.7 を CM と の
pre-incubation後 に 60 分 間 LPS で 刺 激 し 、NF- B の 核 内 へ の 移 行 を 蛍 光 免 疫 染 色 で 評 価
し た 。 そ の 後Western Blot法 を 用 い てI Bの リ ン 酸 化 を 評 価 し た 。 【 結 果 】
AMSC投 与 群 は 、DSS誘 発 腸 炎 群 と 比 較 し て 、体 重 減 少 、臨 床 的 重 症 度 の 悪 化 、炎 症 に
よ る 大 腸 の 短 縮 が 有 意 に 抑 制 さ れ 、 病 理 ス コ ア が 有 意 に 改 善 し て い た 。 直 腸 に お け る
TNF- 、IL-1 な ど の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 発 現 が 有 意 に 減 少 し て お り 、 血 中 MCP-1 濃 度
は 有 意 に 低 下 し た 。さ ら に 直 腸 の 免 疫 組 織 染 色 で は 、単 球/マ ク ロ フ ァ ー ジ の マ ー カ ー で あ るCD68陽 性 細 胞 の 浸 潤 が 有 意 に 抑 制 さ れ て い た 。
AMSC と の 共 培 養 ま た は AMSC の CM 添 加 に よ っ て 、RAW264.7 に お け る TNF-α や
MCP-1の 発 現 、 産 生 が 抑 制 さ れ た 。AMSCと の 共 培 養 ま た は CM添 加 に よ っ て 、HEK293
細 胞 に お け る NF- B の 活 性 化 は 抑 制 さ れ 、CM 添 加 に よ っ て NF- B の 核 内 へ の 移 行 が
RAW264.7に お い て 抑 制 さ れ て い た 。 し か し な が ら 、HEK293に お け る I Bの リ ン 酸 化 は
CMの 添 加 で は 抑 制 さ れ な か っ た 。
【 考 察 】
本 研 究 で は 、以 下4つ の 結 果 が 得 ら れ た 。(1)AMSCの 投 与 が 、体 重 低 下 の 抑 制 、臨 床 的 重 症 度 の 低 下 、腸 管 の 短 縮 抑 制 に 寄 与 し た 。(2)AMSC の 投 与 が 病 理 ス コ ア を 改 善 し 、腸 管 で の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 発 現 を 抑 制 し た 。(3)AMSCと の 共 培 養 、も し く は 培 養 上 清 は マ ク ロ フ ァ ー ジ の 炎 症 反 応 を 抑 制 し た 。(4)AMSCの 培 養 上 清 はNF- Bの 核 移 行 を 抑 制 し た 。
既 報 よ り も よ り 重 篤 な 腸 炎 モ デ ル を 作 製 す る た め 、8%と い う 非 常 に 高 濃 度 の DSSを 用 い て 検 討 を 行 い 、 各 パ ラ メ ー タ か ら 非 常 に 重 症 な 腸 炎 が 惹 起 さ れ が 、AMSCを 投 与 す る こ と で 、 病 態 を 改 善 さ せ る 結 果 と な っ た 。 腸 管 粘 膜 に 浸 潤 し た 炎 症 細 胞 は マ ク ロ フ ァ ー ジ や 好 中 球 が 主 体 で あ り 、こ の モ デ ル で は マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 がAMSC 投 与 に よ っ て 著 明 に 抑 制 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。
AMSC投 与 は ラ ッ ト 直 腸 中 のTNF-α、IL-1β、MIFと い っ た 炎 症 メ デ ィ エ ー タ ー を 抑 制 し 、
血 清 中MCP-1値 を 抑 制 す る こ と が 示 さ れ た が 、MIFやMCP-1 は マ ク ロ フ ァ ー ジ を 活 性 化 さ せ る サ イ ト カ イ ン と し て 知 ら れ て い る こ と か ら 、AMSCは 免 疫 担 当 細 胞 の 中 で も よ り マ ク ロ フ ァ ー ジ に 対 す る 抑 制 効 果 を 発 揮 す る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
AMSCと の 共 培 養 、CM添 加 はRAW264.7細 胞 に お け る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 発 現 を 有
意 に 抑 制 す る こ と が 示 さ れ た が 、CM が NF- B 転 写 活 性 を 抑 制 し た こ と 、 そ し て TNF-α ま た はLPSに よ るI Bの リ ン 酸 化 が 抑 制 さ れ な か っ た こ と か ら 、CMはNF- Bの 核 移 行 を 抑 制 す る こ と で 抗 炎 症 効 果 を 発 揮 す る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
【 結 論 】
ヒ トAMSCの 投 与 は 、DSSに よ る 強 い 腸 管 粘 膜 障 害 を 抑 制 し 、そ の 効 果 の 一 因 と し て 、
AMSCに よ る マ ク ロ フ ァ ー ジ に 対 す る 活 性 化 抑 制 が 関 与 し て い る こ と が 示 さ れ た 。さ ら に
AMSCの 抗 炎 症 効 果 はNF- Bの 核 移 行 を 抑 制 す る こ と で 発 揮 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。羊
