博 士（ 医 学） 長島朋 美
学 位 論 文 題 名
細菌性スーパー抗原に反応するT 細胞亜群の解析 学位論文内容の要旨
はじめに
ス ー バ ー抗 原 は 多数のT細 胞クロー ンを活 性化し、 感染免疫 におい て重要な 役割を 果たす。 ス ー パー 抗 原 は通 常 の蛋 白抗原 とは異な る様式 で、T細胞を刺 激する ことが知 られて いるが、 これ ら に よ っ て 刺 激 さ れ るT細 胞 亜 群 に つ い て は、T細 胞 レセ プ タ ー(TCR)レ バ ート リ ー を除 い て は、不明な点が多い。
本研究では、carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)でラベルしたりンバ球を反 応 細胞 と し て用 い る 新し ぃ 方 法を 導 入 す るこ とに より、細 菌性ス ーバー抗 原であ るSEB反 応性T 細 胞亜 群 に つい て 解 析し 、 反 応細 胞 のTCRと 細胞 膜表現形 、活性 化T細 胞の産生 するサ イトカイ ン 、 さ らにSEBを 提 示 する 主 要 組織 適 合 複合(MHC)分 子 等に つ い て、 若 干 の知 見 を 得た の で 報 告する。
方法 と結果
SEB最 適 濃 度を 調 ぺ た後 、 反 応T細 胞 サ プセ ッ ト を解 析 す るた め 、 種々 の 濃 度のCFSEで ラ ベ ル した 脾 細 胞を 用 い 、SEBに 対す る 増 殖反 応 を フ口 ー サ イト メ ト リー で 観 察した 。CFSEラベル T細 胞 は 培養 後1日目 よ り 分裂 を 開 始し てCFSElawと な り 、こ れ らCFSElawポ ピュ レ ー シ ョン は そ の後 経 時 的に 増 加 した 。 培 養4日 目 の 脾細 胞 のCFSE強度 を ヒ スト グ ラ ムで 観察す ると、分 裂 ご と に1/2と な り、 最 大 で5回 分 裂し た 細 胞 が最 大 ポ ピュ レ ー ショ ン で ある こ と が判 明 し た。
次 に 、 精 製CD4゛ ま た はCD8゛T細 胞 亜 群 に よ る 抗SEB反 応 を 調 べ る た め 、 脾 細 胞 をMACS を 用 い て 分 画 し 、CFSEで ラ ベ ル 後 、SEBで刺 激 し た。CD8‑分 画(CD4゛） 、CD4‑分 画(CD8゛）
いずれ も増殖 を示し、CD8゛ 分画と比 べCD4゛ 分画で 有意に多 い細胞 数が認め られた 。従って、精 製T細 胞 亜群 を り スポ ン ダ ーと し て も、CD8゛T細 胞 、CD4゛T細 胞 いず れ も 単独 でSEBに 反 応 す る こと が 明 らか に な った。 しかし、SEB反 応性のVp8゛T細胞中 の分裂細 胞数で は、CD8゛T細 胞の 方 がCD4゛T細 胞 より 高 値 を 示し た 。 従っ て 、VB鎖 に よっ て ，CD4゛ とCD8゛T細胞の 反応性が 異 なる可 能性が 示唆され た。
マ ウ ス で はSEB反 応 性T細 胞 は 、Vp7，8を 発 現 し 、SEBと 主 と し てMHCク ラ ス1｜ 分 子 で あ るH‑2Eとの 複 合 分子 に 結 合 して 反 応 する 。 そ こでSEBと 脾 細 胞を 培 養 後、 増 殖してい る細胞が 実 際ど の よ うなTCRp鎖 を 発 現し て い るか 、 経 時的 に 観 察し た 。 回収 脾 生 細胞 全体にお けるVp6 又 はV[38陽 性 細胞 の 割 合は 培 養1日 目 で は ほぼ 同 じ であ っ た が、2日 目以 降Vp8゛T細胞 は 増 加 を 始め 、4日目 に は 回収 生細胞の20％を超 えた。一 方、Vp6゛T細胞の割 合には ほとんど 変化が認 め られ な か った 。Vp8゛T細 胞中 のCFSE10w分 裂 細胞の割 合は、 培養3日目で80％を超え た。一 方 ―22―
vp6゛T細胞のうち 少数残存のものは分裂し、Vp6゛生細胞中の60％となってプラトーを示した。CD4゛ とCD8゛T細 胞亜 群に おい ても 、vp8゛細 胞の 分裂 細胞 の割 合がvp6゛ 細胞 のも のよ り高 かっ た。
スーバー抗原に 反応後、T細胞はactivation induced cell death（AICD）によって死滅するので、
脾 細 胞 をSEBで刺 激後 経時 的（1‑7日） に 、vp6゛ ，vp8゛亜 群中 のア ポト ーシ ス細 胞をAnnexinV 染色によって解析 した。アポトーシス細胞を比較すると、培養3日目ではvp6゛T細胞の53％，V[38゛T 細 胞 の22％ がAnnexinV陽 性 で あ っ た 。AnnexinV陽 性vp8゛T細 胞 は 、 培 養5日 以 降 増 加 し たの に 対し 、V{36゛T細胞 は2日目 以降 高 値を 持続 した 。よ って 、SEBで直 接刺激されな いvp6゛T細胞 の 多く のも のが 、培 養開 始後 早期 に 死滅 する のに 対し 、SEB反 応 性vp8゛T細胞は一 度活性化し、
増 殖 反 応 を 示 し た 後 、 AICDに よ っ て ア ポ 卜 ー シ ス と な る こ と が 判 明 し た 。 次 にCD4゛ ，CD8゛T細 胞 が 拘 束 さ れ るMHC分 子 が 、 実 際l‑Eか ど う か を 確 認 す る た めSEBと 培養開始時に抗l‑E抗体を加え、培養後解析した。抗l‑E抗体無添加では、CD4゛V[38゛，CD8゛V[38゛T 細 胞 い ず れ も4日 目 に 増 加 を 示 し たが 、 抗l‑E抗 体添 加に よっ て、4日目 にお けるvp8゛T細 胞の 割 合が 減少 した 。抗l‑E抗体 によるvp8゛細胞の割合の減 少は、CD4゛，CD8゛T細胞い ずれにおいて も 著明 に認 めら れ、vp6゛細 胞では減少は見られなかった。培養2日目におけるCD4゛vp6゛，CD4゛ vp8゛ ，CD8゛vp6゛、 また はCD8゛vp8゛ 各T細 胞亜 群中 の分 裂細 胞の 割合 を比較すると、抗l‑E抗 体 によ って 、CD4゛vp8゛ とCD8゛vp8゛T細胞 ポピ ュレ ーシ ョン に おけ る分裂増殖は 、ほぼ完全に 抑 制さ れた が、V{36゛T細 胞に 対し ては 抗l‑E抗体添加は影響を与えなかった。NK‑T細胞について も 分裂 を解 析し たが 、vp6゛ ，vp8゛いずれにおいても、 抗l‑E抗体の有意の影響は認 められなかっ た 。 従 って これ らの 細胞 の中 で分 裂し て いる もの は、SEB刺激 では な くbystander効果 によ ると 考えられた。
最 後 にSEB刺 激 培 養 系 に お け る サイ ト カイ ン産 生を 解析 した 。脾 細胞 をSEB (2.5yg/ml)で刺 激開始後、経時的 に上清中のサイトカインを定量した。IL‑2，｜L‑4産生は培養2日目でピークを示 し たが 、IL‑10，IFN‑yは3日目 にピ ーク が認 めら れた 。特 にIFN‑yの 産生 量は4日目 でも高値を維 持 し 、 逆 にIL‑4値 が 急 速 に 低 下 し た 。 以 上 の 結 果 は 、SEB刺 激に よ ってThl，Th2いず れのT細 胞 ポピ ュレ ーシ ョン も活 性化 され る 、ま たはTh0ポピ ュレ ーシ ョ ンが 活性化される ことを示唆し た。
考察
今 回 、CFSE染 色 を 用 い る 新 た な 方 法 で 、SEB反 応 性T細 胞 亜 群 を 解 析 し た と こ ろ ， 培養4日 目で5回分 裂細 胞が 最大 ポピ ュレ ーシ ョ ンを 形成 する こと 、CD8゛T細胞 、CD4゛T細胞いずれも単 独 でSEBに 反 応 す る 知 見 を 得 た 。SEBに 直 接 反 応 し な いvp6゛T細 胞 、NK‑T細 胞 も 、 一 部 は bystander効果 によ り、SEB刺 激培 養系 で分 裂を 示し た。 しか し、SEBで 直接刺激されないvp6゛T 細胞 の大 部 分は 、培 養開 始後 早期 に死 滅す るの に対 し、SEB反 応性vp8゛T細胞はCD4，．8分子の 発 現 に 関 わ ら ず 、SEB+I‑Eに 反 応し て一 度活 性化 し、 増殖 した 後にAICDに よル アポ 卜ー シス と な っ た 。 ま たSEB刺 激 に よ り 、T細 胞 で はThl｜Th2い ず れ の型 のサ イ トカ イン も産 生し た。 以 上 よりCFSEラ ベル 反応 細胞 を用 いる こと によ り、 分裂 やア ポト ーシ ス 細胞 亜群 の同 定が 容易 に 出来 るこ と が判 明し た。 この 方法 は生 体内 でも応用可能なので、免疫 反応細胞の詳細な解析には 有用 と考 え られ る。
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学位論文審査の要旨 主査 教授 小野江和則 副査 教授 大野重昭 副査 教授 上出利光
学位 論文題名
細菌性スーパー抗原に反応する T 細胞亜群の解析
ス ーパ ー抗原は感染免 疫において重要な役割を果たし、通常の蛋白抗原とは異 なる様式で T細胞を刺激する。 本研究では、carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)で ラベ ルし たり ンパ 球を 反応 細胞 とし て用いる新しい 方法により、細菌性スーパー抗原のSEB 反 応 性T細 胞 亜 群 、 産 生 サ イ ト カ イ ン 、 さ ら にSEBを 提 示す る主 要 組織 適合 複合 体(MHC) 分子等にっいて解析した。
CFSEラ ベ ルT細 胞 は 培 養 後2日 目 よ り 分 裂 を 開 始 し てCFSElowと な り 、 こ れ らCFSElow ポ ピ ュ レ ー シ ョ ン は そ の 後 経 時 的 に 増 加 し た 。 培 養4日 目のCFSE強度 をヒ スト グラ ムで 観 察 す る と 、 分 裂 ご と にCFSE強 度は1/2と なり 、5回 分裂 した 細胞 が最 大ポ ピュ レー ショ ンであった。
次 に 、MACSを 用 い て 分 画 し たCD8‑分 画 、CD4‑分 画 のSEB反 応性 を調 べた 。そ の結 果、
CD8゛T細 胞 、CD4゛T細 胞 い ず れ も 単 独 でSEBに 反 応 す る が、CD4゛T細 胞数 がCD8゛T細胞 数よ り多 数 回収 され た。 しか し、SEB反 応性 のvp8゛T細胞 中の 分裂 細胞 数は 、CD8゛T細胞 の 方 がCD4゛T細 胞 よ り 高 値 を 示 し た 。 従 っ て 、vp鎖 に よっ てCD4゛とCD8゛T細 胞の 反応 性が異なる可能性が示唆された。
次 に 、SEBと 脾 細 胞 を 培 養 後 、 増 殖 細 胞 のTCRp鎖 発 現 を経 時的 に観 察し た。 回収 脾生 細 胞 に お け るvp6又 はvp8陽 性 細 胞 の 割 合 は 、 培 養1日 目 で は ほ ぼ 同 一 で あ っ た が 、2日 目以 降vp8゛T細 胞は 増加 を始 め、4日 目 には 回収 細胞 の20％を 超え た。 一方 、vp6゛T細胞 の割 合に はほ とん ど変 化が 認め られ なかった。vp8゛T細胞中の分裂細胞の割合は、培養3日 目 で80％ を 超 え た 。 一 方 少 数 残 存 のvp6゛T細 胞 の60％ が 分 裂 を 示 し た 。 T細胞のactivatioo induced cell death（AICD）を解析するため、SEBと 反応後、経時的に vp6゛，vp8゛亜群中のア ポトーシス細胞をAnnexinV染色で観察した。培養3日目ではV[36゛T
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細胞の53％，vp8゛T細胞の22％がAnnexinV陽性であった。AnnexinV陽性V[38゛T細胞は、
培養5日以降増加したのに対し、V[36゛T細胞は2日目以降高値を持続した。よって、V[36゛T 細胞の多くのものが培養開始後早期に死滅し、V[38゛T細胞は増殖反応を示した後、AICDに よってアポトーシスとなることが判明した。
SEBと培養開始時に抗l‑E抗体を加えると、CD4゛，CD8゛T細胞いずれにおいてもvp8゛細 胞の割合が減少したが、vp6゛細胞では減少は見られなかった。培養2日目における分裂細胞 の割合を比較すると、抗l‑E抗体によって、V[38゛T細胞の分裂はほぽ完全に抑制され、vp6゛T 細胞には影響はみられなかった。NK‑T細胞も分裂を示したが、抗l‑E抗体の影響を受けな かった。従ってこれらの細胞の分裂は、SEBとl‑E分子による刺激ではなく、bystander効 果によると考えられた。
最後に脾細胞をSEBで刺激後、上清中のサイトカインを定量した。IL‑2，IL‑4産生は培養 2日目で、IL‑10，IFN‑yは3日目にピークを示した。IFN‑y産生量は4日目でも高値を維持し、
逆にIL‑4値が急速に低下した。
今回、CFSE染色を用いる方法で、SEB反応性T細胞の分裂回数を定量できること、CD8゛、
CD4゛T細胞いずれも単独でSEBに反応することを明らかにした。またSEB刺激により、Thl, Th2型のサイトカインが産生されることが判明した。
発表後、副査の上出教授からスーパー抗原に対するT細胞反応と、通常の抗原での反応に おけるサイトカインパターン等の差について、SEBとMHCとの結合部位について、副査の 大野教 授から、CFSEの特徴と 、使用の 利点につい て、CD4陽性 またはCD8陽性vp8陽性 T細胞の増殖とサイトカインパターンの関係について、抗l‑E抗体添加培養におけるNK‑T 細胞反応の評価について、臨床応用への可能性について、最後に主査の小野江教授からSEB をin vivoで投与後の病態についての質問があった。申請者は大概妥当な解答をなし得た。
この論文は、スーパー抗原による病態修飾の基盤を明らかにした点で高く評価される。ま た今回用いた方法は生体内でも応用可能なので、今後、免疫反応細胞の詳細な解析には有用 と考えられた。審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研讃や、取 得単位なども併せ、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判 定した。
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