マウス脳出血モデルに対するSOD1 過剰発現神経幹細胞移植治療の神経保護効果
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(2) 図１. に，抗酸化特性を強化した神経幹細胞による移植治療. A. の効果について検討を行ってきたので紹介する．. ヘモグロビンによる 培養神経幹細胞に対する酸化障害. HEt intensity (ratio). 脳循環代謝 第 26 巻 第 2 号. 20. る鉄イオンによる酸化傷害がこの組織傷害の中心的役 割を果たすとされており，Trolox （6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-carboxylic acid）などのフリーラジカ ルスカベンジャーや鉄キレート剤が，培養神経細胞に 対するヘモグロビンの細胞傷害を軽減することが報告 されている12, 13）．また，動物モデルにおいても，内因 性の細胞内活性酸素分解酵素である copper/zinc-superoxide dismutase（SOD1）遺伝子過剰発現ラットでは，脳 出血周囲の組織傷害が軽減することが報告されてい る14）．そこで，我々は脳出血後に移植された神経幹細 胞の生着障害においても，これによる酸化傷害が関与 すると考え，神経幹細胞へのヘモグロビンの直接暴露 の効果と，その傷害機序を検討した．. Dead/Total cells (%). B. き起こす．とくにヘモグロビンおよびその分解物であ. WT SOD1Tg. 10 5 0. 脳出血後には，血腫周囲の浮腫，炎症反応または血 腫分解物の細胞毒性などが周囲組織に二次性傷害を引. *. 15. 50 40 30 20 10 0. PBS. Hb *. PBS. WT SOD1Tg. Hb. 図 1． A：ヘモグロビンの神経幹細胞に対する酸化傷害の検討 （hydroethidine 法）． ヘ モ グ ロ ビ ン（Hb）に よ る 酸 化 傷 害 は，SOD1 Tg 神経幹細胞で WT 神経幹細胞に比較して有 意に抑制された（＊ P<0.001）． B：LIVE/DEAD アッセイによるヘモグロビン暴露後の神 経幹細胞死の検討．SOD1 Tg 神経幹細胞では WT 神経幹 細胞に比較して細胞死が有意に抑制された（＊ P<0.001）． （文献 14 より改変引用）. 神経幹細胞は，生後 1 日の野生型（WT）マウスおよ び SOD1 過発現（SOD1 Tg）マウスの subventricular zone. 胞を血腫近傍の 2 カ所に定位的に移植した．コント. より採取し，培養した．これらを 5 から 9 継代後に，. ロール群では phosphate buffered saline （PBS）を注入し. マウス由来ヘモグロビンへ直接暴露し，これによる活. た．2,4-dinitrophenylhydrazone, and 2,4-dinitrophenyl. 性酸素産生と幹細胞傷害を，それぞれ hydroethidine 法. （DNP）染色を用い，移植後神経幹細胞におけるカルボ. と細胞生存率アッセイで測定した．WT 神経幹細胞で. ニル化タンパク発現を測定し，酸化傷害を検討した．. は，ヘモグロビン暴露後 4 時間で活性酸素の著明な産. 移植後 2 日では，WT 神経幹細胞でのカルボニル化タ. 生亢進を認めたが，SOD1 Tg 神経幹細胞ではこれは有. ンパクの著明な発現上昇を認めたが，SOD1 Tg 神経幹. 意に抑制されていた（n=5, ＊; p<0.001） （図 1A）．ヘモグ. 細胞では，これが有意に減少した（n=5, ＊; p<0.01） （図. ロビン曝露後 12 時間には，WT 神経幹細胞の 33% が. 2B）．また脳出血後 14 および 35 日（移植後 11 および. 細胞死に至ったが，SOD1 Tg 神経幹細胞ではこの細胞. 32 日）での生存移植幹細胞数は，WT 神経幹細胞に比. 死が有意に減少した（n=5, ; p<0.001） （図 1B）．これら. 較 し SOD1 Tg 神 経 幹 細 胞 で 有 意 に 増 加 し た（n=9,. の結果より，ヘモグロビンは神経幹細胞に対して酸化. ＊. ＊. ; p<0.05, ＊＊; p<0.01） （図 2C）．. ストレスを介した細胞毒性を示し，脳出血後に移植さ. マウス脳出血モデルに対する 神経幹細胞移植の神経保護効果. れた神経幹細胞の生着を妨げている一因となっている 可能性が示唆された．. 上記マウス脳出血モデルを用い，SOD1 Tg 神経幹細. マウス脳出血モデルでの 移植神経幹細胞における酸化傷害. 胞移植の神経保護作用について検討した．はじめに， 移植部周囲における VEGF および glial cell derived neu-. マウス脳出血モデルを用い，in vivo での移植神経幹. rotrophic factor（GDNF）の発現量を ELISA 法で測定し. 細胞の酸化傷害を検討した．雄性 C57BL/6 マウスの尾. た．移植後 2 日では，WT と SOD1 Tg のどちらの神経. 静脈から採取した自己血 20 μl を右線条体に定位的に. 幹細胞移植群においても両栄養因子の発現が，コン. 注 入 し， 脳 出 血 を 作 成 し た（図 2A）． 作 成 後 3 日 に. トール群（PBS 注入）に比較し有意に上昇したが，移植. 1×10 個の WT 神経幹細胞もしくは SOD1 Tg 神経幹細. 後 11 日には SOD1 Tg 群でのみ有意な発現上昇を認め. 5. ─ 240 ─.
(3) 脳出血に対する神経幹細胞移植における酸化傷害. 図２ A. Fluorescence intensity. B. SOD1Tg. WT. 10 8 6 4 2 0. GFP. DNP Number of GFP positive cells. DAPI. C. WT. SOD1Tg. 2500 2000. Merged *. WT SOD1Tg *. ICH(-). ICH(+). WT SOD1Tg. 1500. **. 1000 500 0. 14 d. 35 d. 図 2． A：自己血注入による脳出血モデル． B：2,4-dinitrophenylhydrazone, and 2,4-dinitrophenyl（DNP）免疫染色による移植神経幹細胞における酸化傷害の検討．出血後 3 日に SOD1 Tg 神経幹細胞または WT 神経幹細胞神経幹細胞の脳実質内移植を行った．移植神経幹細胞への酸化傷害は， SOD1 Tg 神経幹細胞で WT 神経幹細胞に比較して有意に抑制された（＊ P<0.01）スケールバー 50 μm． C：移植神経幹細胞の生存率の検討．生存細胞は green fluorescent protein transgenic（GFP）で標識した．SOD1 Tg 神経幹細胞 では WT 神経幹細胞に比較して出血後 14 日および 35 日の細胞生存数が有意に増加した（＊ P<0.05，＊＊ p<0.01）．スケール バー 200 μm．（文献 14 より改変引用）. A. VEGF 発現 **. *. 1.2. 0.8. VEGF (ratio). VEGF (ratio). 1.2. 0.4 0. ICH(-) PBS WT. 移植後2日 GDNF 発現. GDNF (ratio). 1.6. **. **. 1.2 0.8. 0.4 0. ICH(-) PBS WT. 0.4. ICH(-) PBS WT Tg. 図 3．神経幹細胞移植周囲での神経栄養因子の発現 A： 移 植 後 2 日 の VEGF 発 現 は，WT お よ び SOD1 Tg 神 経 幹 細 胞 移植ではコントロール（PBS）に比較し有意に増加した（＊ P<0.05， ＊＊ p<0.01）．移植後 11 日の VEGF の発現量は SOD1 Tg 神経幹細胞 ** ではコントロールと WT 神経幹細胞に比較し有意に増加したが， * 1.2 WT 神 経 幹 細 胞 は コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し 増 加 は 認 め な か っ た （＊ P<0.05，＊＊ p<0.01）． 0.8 B： 移 植 後 2 日 の GDNF 発 現 は，WT お よ び SOD1Tg 神 経 幹 細 胞 移 植 で は コ ン ト ロ ー ル に 比 較 し 有 意 に 増 加 し た（＊ P<0.05， 0.4 ＊＊ p<0.01）．移植後 11 日の GDNF の発現量は SOD1Tg 神経幹細胞 ではコントロールと WT 神経幹細胞に比較し有意に増加したが， 0 ICH(-) PBS WT Tg WT 神 経 幹 細 胞 は コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し 増 加 は 認 め な か っ た 移植後11日 （＊ P<0.05，＊＊ p<0.01）．（文献 14 より改変引用）. 移植後11日. GDNF (ratio). B. 0.8. 0. Tg. ** *. Tg. 移植後2日. ─ 241 ─.
(4) % of surviving neurons /contra lateral. 脳循環代謝 第 26 巻 第 2 号. 図４ A. PBS. SOD1Tg. WT. WT. SOD1Tg 左線条体 右線条体. Forelimb use asymmetry. C. 90 85 80 75. 70 65. **. *. 80 60. 40 20 0 Contra PBS WT Tg. *** *. PBS WT. Tg. PBS WT SOD1Tg. 1.2 1.0 0.8 0.6. *. *** *** * **. 0.4 0.2 0. % of striatum size /contra lateral. B. 120 100. * ICH(-) 1d. 3d 7d 14d 21d 28d 35d Cylinder test. 図 4． A：NeuN 免疫染色により生存神経細胞を検出した．出血周囲線条体における神経細胞の生存率を反対側（contralateral: contra）の神経細胞数との比で評価した．SOD1 Tg 神経幹細胞移植群ではコントロール（PBS）群に比べ有意にホスト組織の生存 率が増加したが WT 神経幹細胞移植群では有意差を認めなかった（＊ p<0.05）スケールバー 50 μm． B：クレシルバイオレット染色による線条体の萎縮の評価．出血後 35 日の患側線条体（右）の面積を測定し，健側の線条体 （左）と比較した．WT および SOD1 Tg 神経幹細胞はコントロールに比較し有意に萎縮を抑制し，さらに SOD1 Tg 神経幹細 胞は WT 神経幹細胞に比較しても有意な抑制を示した（＊ P<0.05，＊＊ p<0.01，＊＊＊ p<0.001）． C：Cylinder テストによる神経機能評価．WT 神経幹細胞では，出血後 28 日以降よりコントロールに比較し有意な改善を認 めたのに対し，SOD1Tg 神経幹細胞では 21 日から有意な改善を認めた．出血後 35 日には SOD1 Tg 神経幹細胞では WT に 比較し，有意な神経機能の回復が認められた（＊ P<0.05，＊＊ p<0.01，＊＊＊ p<0.001）．（文献 14 より改変引用）. た（n=4, ＊; p<0.05,. ; p<0.01） （図 3A, B）．次に，幹細. 日以降から有意な改善を認めた．さらに SOD1 Tg 群. 胞移植による神経保護作用の評価のため，血腫周囲線. では WT 群に比べ出血後 35 日での神経機能回復を有. 条体の神経細胞を NeuN 免疫染色で標識し，生存神経. 意に促進した（n=9, ＊; p<0.05） （図 4B）．. 細胞数をカウントした．また，線条体の萎縮程度をク. これらの結果から，脳出血後の移植治療において，. レシルバイオレット染色で計測した．出血後 35 日で. 抗酸化特性を増強した神経幹細胞ではヘモグロビンに. の生存神経細胞数は，WT 群ではコントロールに比較. よる酸化傷害が軽減し，生着率が改善することが明ら. し増加しなかったが，SOD1 Tg 群では有意に増加した. かとなった．これに伴い移植周囲の神経栄養因子の発. （n=6, ; p<0.05） （図 4A）．WT および SOD1 Tg の神経. 現量が増加し，神経保護作用が促進され，治療効果が. ＊＊. ＊. 幹細胞移植は，脳出血後の線条体萎縮を軽減したが，. 向上するものと考えられた15）．. SOD1 Tg 群では WT 群に比較してさらに有意な軽減効. おわりに. 果を示した（n=7, ＊; p<0.05, ＊＊; p<0.001） （図 4B）． シリンダーテストによる神経機能評価では，WT 群 ではコントロールと比較し出血後 28 日以降に有意な. 脳出血後に生じるヘモグロビンが惹起する酸化傷害. 改善を認めたのに対し，SOD1 Tg 群はより早期の 21. は移植神経幹細胞の生存を妨げ，移植治療の効果を減. ─ 242 ─.
(5) 脳出血に対する神経幹細胞移植における酸化傷害. 弱させる一因となる．抗酸化特性を強化した神経幹細. cells over-expressing VEGF provide neuroprotection,. 胞の移植は，脳出血に対する新たな治療戦略となりう. angiogenesis and functional recovery in mouse stroke model. PLoS One 2: e156, 2007. る可能性が示唆された．. 8） Sakata H, Niizuma K, Yoshioka H, Kim GS, Jung JE, Katsu M, Narasimhan P, Maier CM, Nishiyama Y, Chan. 文 献. PH: Minocycline-preconditioned neural stem cells enhance. 1） 篠原幸人，小川 彰，鈴木則宏，片山泰朗，木村彰. neuroprotection after ischemic stroke in rats. J Neurosci. 男： 脳 出 血： 脳 卒 中 治 療 ガ イ ド ラ イ ン 2009: 2009,. 32: 3462–3473, 2012. 130–158. 9） Sakata H, Narasimhan P, Niizuma K, Maier CM, Wakai T,. 2） Andres RH, Guzman R, Ducray AD, Mordasini P, Gera A,. Chan PH: Interleukin 6-preconditioned neural stem cells. Barth A, Widmer HR, Steinberg GK: Cell replacement. reduce ischaemic injury in stroke mice. Brain 135: 3298–. therapy for intracerebral hemorrhage. Neurosurg Focus 24: E16, 2008. 3310, 2012 10） Xi G, Keep RF, Hoff JT: Mechanisms of brain injury after. 3） Lee HJ, Park IH, Kim HJ, Kim SU: Human neural stem cells overexpressing glial cell line-derived neurotrophic. intracerebral haemorrhage. Lancet Neurol 5: 53–63, 2006 11） Qureshi AI, Mendelow AD, Hanley DF: Intracerebral. factor in experimental cerebral hemorrhage. Gene Ther 16: 1066–1076, 2009. haemorrhage. Lancet 373: 1632–1644, 2009 12） Rogers B, Yakopson V, Teng ZP, Guo Y, Regan RF:. 4） Lee HJ, Lim IJ, Lee MC, Kim SU: Human neural stem. Heme oxygenase-2 knockout neurons are less vulnerable. cells genetically modified to overexpress brain-derived. to hemoglobin toxicity. Free Radic Biol Med 35: 872–881,. neurotrophic factor promote functional recovery and neuroprotection in a mouse stroke model. J Neurosci Res 88:. 2003 13） Regan RF, Rogers B: Delayed treatment of hemoglobin. 3282–3294, 2010. neurotoxicity. J Neurotrauma 20: 111–120, 2003. 5） Wang Z, Cui C, Li Q, Zhou S, Fu J, Wang X, Zhuge Q:. 14） Katsu M, Niizuma K, Yoshioka H, Okami N, Sakata H,. Intracerebral transplantation of foetal neural stem cells. Chan PH: Hemoglobin-induced oxidative stress contrib-. improves brain dysfunction induced by intracerebral. utes to matrix metalloproteinase activation and blood-. haemorrhage stroke in mice. J Cell Mol Med 15: 2624–. brain barrier dysfunction in vivo. J Cereb Blood Flow. 2633, 2011. Metab 30: 1939–1950, 2010. 6） Lee HJ, Kim MK, Kim HJ, Kim SU: Human neural stem. 15） Wakai T, Sakata H, Narasimhan P, Yoshioka H, Kinouchi. cells genetically modified to overexpress Akt1 provide. H, Chan PH: Transplantation of neural stem cells that. neuroprotection and functional improvement in mouse. overexpress SOD1 enhances amelioration of intracerebral. stroke model. PLoS One 4: e5586, 2009. hemorrhage in mice. J Cereb Blood Flow Metab 34: 441–. 7） Lee HJ, Kim KS, Park IH, Kim SU: Human neural stem. ─ 243 ─. 449, 2014.
(6) 脳循環代謝 第 26 巻 第 2 号. Abstract Transplantation of neural stem cells that overexpress SOD1 enhances amelioration of intracerebral hemorrhage in mice Takuma Wakai1, 2, Hideyuki Yoshioka1, Takashi Yagi1, Kazuya Kanemaru1, Pak H. Chan2, and Hiroyuki Kinouchi1 1Department of Neurosurgery, Interdisciplinary Graduate School of Medicine and Engineering, University of Yamanashi and Department of Neurosurgery, Yamanashi, Japan 2Department of Neurology, Stanford University Previous studies have shown that intraparenchymal transplantation of neural stem cells (NSCs) ameliorates neurological deficits in animals with intracerebral hemorrhage (ICH). However, massive grafted cell death following transplantation, possibly caused by a hostile host brain environment, lessens the effectiveness of this approach. We focused on the effect of oxidative stress induced by hemoglobin against grafted NSCs and showed genetic manipulation to overexpress copper/zinc-superoxide dismutase (SOD1), which is a specific antioxidant enzyme that counteract superoxide anions, enhances survival of grafted NSCs and accelerates amelioration of ICH. Our results suggest that enhanced antioxidative activity in NSCs improves efficacy of stem cell therapy for ICH. Key words: Neural stem cell, intracerebral hemorrhage, hemoglobin, oxidative stress, SOD1. ─ 244 ─.
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