ヒト好中球のPMAおよびOZ刺激スーパーオキシド生成能と修正された無細胞系によるNADPHオキシダーゼ活性の関係

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(1)Title. ヒト好中球のPMAおよびOZ刺激スーパーオキシド生成能と修正された無細胞系によるNADPHオキシダーゼ活性の関係. Author(s). 中村, 寛成; 神林, 勲; 内田, 英二; 武田, 秀勝; 藤井, 博匡. Citation. 北海道教育大学紀要. 自然科学編, 56(1): 55-59. Issue Date. 2005-08. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/615. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) 北海道教育人学紀要（自然科学編）第56巻第1弓 JournalofHokkaidoUniversityofEducation（NaturalSciences）Vol．56，No．1. 平成17年8月 August，2005. ヒト好中球のPMAおよびOZ刺激スーパーオキシド生成能と修正された無細胞系によるNADPHオキシダーゼ活性の関係中村寛成・神林勲＊・内田英二＊＊・武田秀勝＊＊＊・藤井博匡＊＊＊. 北海道教育人学人学院教育学研究科＊北海道教育人学教育学部札幌校保健体育研究室＊＊人正人学人問学部＊＊＊札幌医科人学保健医療学部. RelationbetweenPMA−andOZ−Stimulatedsuperoxide−generatingactivitiesand NADPHoxidaseactivitybymodifiedcell−freesysteminhumanneutrophils NAKAMURATomonari，KAMBAYASHIIsao＊，UCHIDAEiji＊＊ TAKEDAHidekatsu＊＊＊andFUJIIHirotada＊＊＊. GraduateSchoolofEducation，HokkaidoUniversityofEducation，Sapporo OO2−8502. ＊DepartmentofPhysicalEducation，SapporoCampus，HokkaidoUniversityofEducation，Sapporo OO2−8502 ＊＊. FacultyofHumanStudies，TaishoUniversity，Tokyo170−8470. ＊＊＊. schoolofHealthScience，SapporoMedicalUniversity，Sapporo O60−8556. Abstract. Inhumanneutrophilsfromperipheralbloodatrest，relationbetweenphorbol12−myristate13−aCetate （PMA）andopsonizedzymosan（OZ）stimulatedsuperoxide−generatingactivity，andreducednicotina− mideadeninedinucleotidephosphate（NADPH）0Ⅹidaseactivitybymodifiedcellfree−SyStemWaSeX− aminedinthisstudy．NADPHoxidaseactivitywasreconstructedbysuspensionincludingbothmem− braneandcytosoIcompartment．Twohealthymalesubjects（subjectA；20yrandsubjectB；39yr）were recruited．Superoxideproductionwasmeasuredbythecytochromecreductionassay．PMA−andOZ− Stimulatedsuperoxide−generatingactivitiesinsubjectAwerel．8and2．2timeshigherthanthoseofsub− jectB，reSpeCtively．NADPHoxidaseactivitywasalsol．5timeshigherinsubjectAthansubjectB．. TheseresultsindicatethatPMAstimulatedsuperoxide−generatingactivityrelatedtoNADPHoxidase activity，butOZ−Stimulateddoesnotnecessarilyreflecttheenzymeactivity．. Keywords；neutrOphils，SuperOXide，NADPHoxidase，CytOChrormec，PMA，OZ. 55.

(3) 中村寛成・神林. 勲・内田英二・武田秀勝・藤井悼匡. 緒言循環白血球の約半分を占めている好中球は，非特異的異物処理の初期に中心的に活躍する食細胞. B（39歳）を対象にした．. 2．採血および測定概要. 肘静脈よりヘパリンコーティングしたシリンジ. である．好中球は体内に侵入してきた異物や細菌. を用い20mlの採血を約2ケ月の問に行った．採. に対して走化性を示し，それらを食胞してスー. 血の回数は，被検者Aが9回，被検者Bは10回で. パーオキシド（superoxide，以下0｛）などの活. あった．細胞系の測定は採血後直ちに行い，無細. 性酸素種を生成して殺菌する．0昌▼は細胞膜と細. 胞系の測定は各々5回分の試料を1つにまとめて. 胞質に分かれて局在するニコチンアミドアデニン. 分析に供した．. ジヌクレオチド（reducednicotinamideadenine dinucleotidephosphate，以下NADPH）オキシダーゼにより生成される4）． NADPHオキシダーゼの0昌▼生成活性は，無細. 3．好中球浮遊液の調製と好中球数の測定血液は既報2）に従い，直ちに分離された．得られた好中球をリン酸緩衝生理食塩水〔PBS（−）〕. 胞系で定量評価することができる2）．無細胞系で. に撹拝し，1mlの好中球浮遊液を作成した．こ. は，好中球の膜画分とサイトゾル画分を別個に調. の浮遊液中の好中球数は，算定盤により，光学顕. 製し，0昌▼生成活性を再構成する．しかしながら，. 微鏡（BH−2，OLYMPUS社製）を用いて古検的. この方法では膜画分とサイトゾル画分の量的比率. に算定した．. が活性に影響を与える等，測定上の問題点もある．. そこで本研究は，既報2）の無細胞系に若干の修正を施し，NADPHオキシダーゼの0昌▼生成活. 4．細胞系による好中球0妄￣生成能の測定. 既報2）に従い，二波長分光光度計（556型二波. 性を定量評価した．修正を施したのは，膜画分と. 長自記分光光度計，日立製作所製）を用いて，シ. サイトゾル画分の両方を含んだ懸濁液を調製し，. トクロムC還元法により実施した．刺激剤は. その懸濁液を用いてNADPHオキシダーゼ活性. PMAとOZを用いた．PMAは使用直前に，ジ. を誘導した点である．この方法を用いて，ホル. メチルスルフォキシド（和光純薬工業株式会社）. ポールミリステートアセテート（phorbol12−. で25pg／mlに調製した．OZは20mgのZymosan. myristate13−aCetate，以下PMA）による細胞系. （Sigma社製）を先行研究3）の方法に若干の修正. の好中球0昌▼生成能に差がある被検者2名を対象. を加えて調製し，好中球107個当たりOZが500. に，NADPIIオキシダーゼ活性にも同様な違い. 〟gになるようにPBS（−）で懸濁した．好中球. が得られるか否かを検討した．また，オプソニン. 0昌▼生成能は，好中球107個当たりで評価した. 化ザイモザン（opsonizedzymosan，以下OZ）に. （nmol／min／107cells）．. よる好中球0昌▼生成能との関係についても合わせ. 5．無細胞系によるNADPHオキシダーゼ活性. て検討した．. の測定. 細胞系での測定終了後，好中球浮遊液にフルオ方法 1．被検者我々の研究グループでは，これまでに多くの被. ロリン酸ジイソプロピル（diisopropylfluorophos− phate，以下DFP，和光純薬工業株式会社製）を 2〃1加えて，15分間アイスバス内で放置した後，. 検者を対象にPMA刺激好中球0昌▼生成能を測定. 1300rpm，10分間，4℃で遠心分離した．遠心後，. してきた．その中で，安定して高値と低値を示す. 上澄みを取り除き，PBS（−）を500〃1加え撹. 健常な成人男性2名，被検者A（20歳）と被検者. 拝し，分析まで−80℃で凍結保存した．分析時に. 56.

(4) 細胞系と無細胞系による好中球スーパーオキシド生成能. は常温で融解後，100mMフユニルスタンスルホ. を60〟1加えて混和した．これを，キュベットの. ニルフルオリド（和光純薬工業株式会社製）を10. SとR両方に770〟1ずつ入れた．キュベットのS. pl加え，超音波細胞破砕装置（Bioruptor，COS−. とRを一波長ダブルビームモード，波長を550. MO社製）を用いて，4℃以下の冷水内で超音波. nmに設定された分光光度計内に入れ，刺激前の. 処理（1．5秒×10回，インターバルは1秒）を施. ベースラインをペンレコーダー. して好中球を破砕した．その後，2000rpm，10. macia社製）で記録した．SとRの両方のキュベッ. （RlミClOl，Phar−. 分間，0℃で遠心分離した．遠心後，上澄みをマ. トに基質であるNADPH（OrientalYeast社製）. イクロチューブに移し，NADPHオキシダーゼ. を同時に10〃1加えて撹拝し，Cytcと0昌▼の還. 活性用の懸濁液とした．試科内のタンパク質量は，. 元反応を開始させ，分光光度計で吸光度の増加反. SmartSpecTM3000（BIORAD社製）を用いてブ. 応を数分問記録した．測定は，各MAの量につ. ラッドフォード法により測定した．. き3度実施した．NADPHオキシダーゼ活性. 測定の開始前に緩衝液を作成した．最初に，蒸. （nmol／min／mgprotein）は，最も高い増加が得. 留水にリン酸二水素ナトリウムニ水和物とリン酸. られたMA濃度の反応曲線から，最大傾斜線の. 水素ニナトリウム・12水をそれぞれ加えて，200. 傾きを算出し，その平均値をCyt cの吸光度係. mMの溶液AとBを作成した．そして，溶液B. 数21．1で除すことで求めた．. に溶液Aを加えていき，pHメーター（Model TP−95pHMETER，東興化学研究所株式会社製）でpHが7．0になるように溶液Cを作成した．50. 6．統計処理得られたデータは，平均値±標準誤差で表した．. mlの溶液Cに200mMのNaN3，100mMの. 平均値の差の検定には，MannwhitneyのU検. EGTA，100mMのMgC12をそれぞれ2mlずつ. 定を用い，危険率は5％未満とした．. 加え，蒸留水で総量200mlに調製し，それを緩衝液として室温で保持した．NADPHオキシダー結果. ゼを再構築させる物質として，界面活性剤の一種であるミリステン醸ナトリウム（myristicacid，. Tablelに，被検者AとBのPMAおよびOZ. 以下MA，Sigma社製）を使用した．NADPH. 刺激による好中球0昌▼生成能の平均値を示した．. オキシダーゼを再構築させるMAの最適濃度は. 同一刺激剤によるAとBの差は統計的に有意であ. 懸濁液中のタンパク質量に左右されるため，測定. り，PMA刺激による差は約1．8倍，OZ刺激で. 毎に加えるMAの量を変えた．用いたMAの濃. は約2．2倍であった．. 度は5mMであった．. 測定では，キュベットに緩衝液と懸濁液をそれ. どちらの被検者でも，NADPHオキシダーゼ活性は，MAの最終濃度が32〟Mを最高に釣鐘. ぞれ100〟1ずつ入れた．そこにグアノシン3リン. 型の曲線を描いた（Fig．1）．この時のNADPH. 酸を8〟1加え，室温で1分間インキュベーショ. オキシダーゼ活性をTablelに示した．被検者A. ンした．1分後，MAを加え，5分間インキュベー. とBの備には有意差が認められ，その差は約1．5. ションした．その間に，2本のキュベットを用意. 倍であった．. し，一方を懸濁液側（Sample，以卜S），もう一方を対照側（Reference，以下R）とし，Sには緩衝液を10〃1，Rにはスーパーオキシドジスムターゼを10〃1入れた．5分後，キュベットに MA量に対応する緩衝液とシトクロム C （Ferricytochromec，以下Cytc，Sigma社製）. 考察好中球が0昌▼を生成するためには，NADPH オキシダーゼを活性化させる必要があり，その過程には複雑なシグナル伝達機構が関与する．まず，. 57.

(5) 中村寛成・神林勲・内田英二・武田秀勝・藤井悼匡 Tablel Superoxide−generatlngaCtivitiesincellandcell−freesystems．. PMA−Stimulated. OZ−Stimulated. （nmol／min／mgprotein）. （nmol／min／107cells）. SubjectA. l14．9±5．3＊＊. Subject上i. 62．8±2．8. NADPHoxidase. 19．3±2．5＊. 5．30±0．24＊. 8．9±1．2. 3．52±0．30. Valuesaremeanandstandarderrors．＊and＊＊denotesignificantdifference（p＜0．05 andp＜0．01）whencomparedwithSubjectB．. ︵層○ちJd叫百、月︻モ︻○白色hてr苫30功名頂OH九日虻Z. のPMA刺激好中球の0昌▼生成能の差は約1．8倍であり，修正した無細胞系によるNADPHオキシダー. ゼ活性は約1．5倍であった．この差は非常. に小さく，ほぼ同様であると考えられる．. PKCが刺激され，NADPHオキシダーゼが活性化するまでには，タンパク質のリン酸化や構成要素のトランスロケーションが必要である．被検者AとBには，本研究では明らかにすることがで 16いM. 32llM. 4叫M. 64llM. 80llM. MA. Fig．1Effectofmyristicacid（MA）onNADPH. きないこの過程に違いが認められる可能性もある．また，無細胞系における測定上の影響を考慮する必要がある．本研究では，無細胞系の試料作. OXidaseactivlty．Errorbarsindicatestandard. 成時において，好中球の核等を破壊するために. errOrS．. DFPを用いた．DFPは，核等のみならず細胞膜や細胞質にも影響を与える．被検者AとBの好. オプソニン化された異物等が食胞されると，細胞. 巾球浮遊液中の細胞濃度は同一ではなかったた. 膜上にあるオブソニン受容体と結合し，Gタンパ. め，DFPの影響が被検者AとBの浮遊液で異. ク質が作用して膜内のホスホリパーゼCが活性化. なったかもしれない．以上のような理由から，. する．活性化したホスホリパーゼCは，ホスファ. NADPHオキシダーゼ活性の差とPMA刺激好中. チジルーイノシトール4，5一ニリン酸をジアシルグ. 球0昌▼生成能の差は，ほぼ等しいものと考えるこ. リセロールとイノシトール一三リン酸に分解され. とができる．. る．ジアシルグリセロールはPKCを直接活性化. OZは好中球の膜に存在するオプソニン受容体. させ，イノシトール一三リン酸は細胞内のCa2＋. と結合することで，NADPHオキシダーゼを活. 濃度を上昇させることにより，PKCを活性化さ. 性化させる．よって，PMAに比較して，. せる．PKCが活性化することで，細胞内のタン. NADPHオキシダーゼを活性化させるまでのシグ. パク質がリン酸化し，細胞質にあるNADPHオ. ナル伝達機構の関与が大きい．また，オブソニン. キシダーゼの構成要素がトランスロケーションし. 受容体の数も，OZ刺激好中球0昌▼生成能に影響. て股にある構成要素と会合し，活性化する．. を与えるだろう．このようなPMAとの違いが，. PMAはPKC を直接刺激することで，. NADPHオキシダーゼ活性では約1．5倍だった被. NADPHオキシダーゼを活性化させる．このため. 検者AとBの差が，OZ刺激好中球0占▼生成能で. シグナル伝達機構の関与が少なく，PMA刺激に. は約2．2倍に広がった原因と考えられる．. よる好中球0昌▼生成能は，NADPIIオキシダー. ゼ活性を反映しているとされている1）．被検者問. 58. まとめとして，安静時のヒト末梢血の好中球において，PMA刺激好中球0昌▼生成能で認められ.

(6) 細胞系と無細胞系による好中球スーパーオキシド生成能. た差は，既報を修正した無細胞系によるNADPH オキシダーゼ活性でも同様の差として得られた．. 一方，OZ刺激好中球0昌▼生成能の差は，受容体やシグナル伝達機構の関与が大きく，本研究で用いた無細胞系によるNAT）P冒オキシダーゼ活性の差とは一致しなかった．今後は，細胞系と本研究で用いた無細胞系による0昌▼生成の関係が，運. 動などによりどのように変化するか，詳細な検討を実施する予定である．. 参考文献. 1）Alvarez，E．，Rtliz−Gutierrex，Ⅴ．，Sobrino，F．and Santa−Maria，C．（2001）Agerelatedchangesinmem−. branelipidcomposition，fluidityandrespiratoryburst inratperitonealneutrophils．Clin．Exp．Immunol．， 124：95102．. 2）浅田浩二，中野稔，柿沼カツ子（1998）活性酸素測. 定マニュアル．講談社，pp▲3277． 3）Nishida，A．，Kimura，H．，Nakano，M．andGoto，T．（1989）Asensitiveandspecificchemiluminescence. methodforestimatingtheabilityofhumangranu− locytesandmonocytestogenerateO昌．Clin．Chim． Acta，179：177181．. 4）Rossi，F．andZatti，M（1964）Changesinthemeta−. bolicpatternofpolymorphonuclearleukocytesduring phagocytosis．Br．］．Exp．Path．，45：548559．. （中村寛成札幌校・岩見沢校大学院生）（神林勲札幌校助教授）（内田英二大正大学助教授）（武田秀勝札幌医科大学教授）（藤井博匡札幌医科大学教授）. 59.

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