博 士 （ 医 学 ） 鈴 木 晃 子 学 位 論 文 題 名
低 酸 素 ・ 低 栄 養 下 で の
， ● 亅 J ●
matrlXmeta110protemaSe− 9（ MMP― 9） の 産 生 増 強
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
【緒 言】
遠 隔 転 移 は 癌 に お け る 主 要 な 死 亡 要 因 で あ り ， 遠 隔 転 移 を 抑 制 で き れ ば 予 後 の 改 善 も 期 待 で き る と 考 え ら れ て い る ． 最 近 ， 組 織 中 の 酸 素 濃 度 の 低 い癌 の ほう が高 い 癌よ り予 後 不良 であ り ， 遠 隔 転 移 の 多 い こ と が 報 告 さ れ た ． 細 胞 が 低 酸 素 に 曝 さ れ る と ， 低 酸 素 誘 導 転 写 因 子 (hypoxia‑inducible factor‑l，HIF‑1） が 活 性 化 さ れ て ， 低 酸 素 適 応 に 必 要 な 血 管 新 生 因 子 や 嫌 気 性 解 糖 系 酵 素 な ど の 発 現 を 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る ， 著 者 ら は ， 低 酸 素 が 腫 瘍 細 胞 の 浸 潤 転 移 を 促 進 す る 可 台 眦 も あ る の で は な い か と 考 え ， 低 酸 素 下 で 発 現 誘 導 さ れ る 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス 蛋 白 分 解 酵 素(matrix metalloproteinases，MMF瑚 の 同 定 をi式 み た ． 髟 帥 のMMPsの う ちmarkmet刮Ioproteinase＿9（MMP‐9） の プ □ モ → 夕 一 領 域 に ，HtF‐1の 結 合 配 列 を 認 め た た め ， 低 酸 素 ・ 低 栄 養 に よ るMMP‐9の 発 現 匍 脚 に つ い て 検 討 す る こ と と し た ， ま た ，MMP‐9発 現 亢 進 が 浸 潤 能 亢 進 に っ な が る こ と を 検 証 す る た め ， 実 験 的 血 管 基 底 膜 モ デ ル と さ れ る Matrigelへ の浸 潤能 に つい ても 検 討し た．
【材 料と 方 法】
1． プ 口 モ 一 夕 ― 領 域 にHIF1が 結 合 す るMM降 遺 伝 子 の 解 析 ： 当 教 室 の 王 が 作 製 し た コ ン ピ ュ 一 夕 ー プ 口 グ ラ ミ ン グ に よ り ，MMP．9遺 任 汗 の ブ □ モ ― 夕 ― 領 域 にHIF―1縦i合 配 列 が あ る か 否か 検索 し た，
2． 細 皰 株 ： 脾 癌 細 珊 包 株5株 ， 卵 巣 癌 細 職 蛛TTaV， 線 維 肉H重 細 靤 株HT1080など の ヒ卜 癌ネ 田 胞 を 用 い た ， 低 酸 素 下 培 養 は1％ 酸 素 濃 度 下 で 行 っ た ， 低 栄 養 培 養 は ， グ ル コ ― ス 無 添 加DMEM 培養 液に10％R芯 を渤 ロし た 低グ ルコ ー ス培 養液 で 行っ た，
3．DominantnegativeHIF−1a（dnHIF−1啣 導 入 膵 癌 細 胞 株 ： 当 教 室 の 陳 ら が 樹 立 し た2ク □ − ンと べク 夕 一コ ン卜 □ ―ル を用 い た．
4．F汀 ―R淑 お よ びre刮 ‐timePa竃 糸E胞 よ り 抽 出 し たtotaIR丶 強 よ りcDNAを 作製 後，F汀‐R〓R は サ ー マ ル サ イ ク ラ ー に て 増 幅 し た ．Fb刮 −tImeK瀬 はABIP鬥SM7900HTを 用 い て 行 な っ た，
5．We鋭emblot法 ：Lysisbufferで 細 胞 を 溶 解 後 ， 遠 心 し て 上 清 を 回 収 し 蛋 白 抽 出 液 と し た ． サ ン ブ ル を 非 還 元 条 件 下 で12％polyacrylamidegelを 用 い て 電 気 泳 動 後 ， ニ 卜 □ セ ル □ − ス 膜 に転 写し た ．blockingbufferfこ てヨ 斟 寺異的結合をb｜Ock後，1冫 欠抗体で標識した ．洗汚噺麦2；欠
抗体と反応させ，ECL det ection kit にて発色させたI
6 ．浸潤能の検討：t ranswell chamber の膜に40 倍希釈したMarigel をコートし乾燥させた，
使用前に1 時間培養液中に浸し，上室に細胞浮遊液を下室には培養液を入れ，24 時間培養したI 培養後，ギムザ液で染色し t 膜上面に付着している細胞を綿棒にて除去した，その後，膜下面に 付着している細胞数を倒立顕微鏡下で計測した・
【結果】
1 ．低酸素・低栄養下での MMP ‐9mRNA 発現：各種膵癌細胞株において，低酸素下で誘導され るaut 一1m 丶A が誘導され，低酸素に反応していることを確認した．同細胞株において，低酸 素 下で MMP ￣9mRNA 発現 が誘導さ れた． 冫欠に re 刮 ー timePCR によっ て各種癌 細胞株の MMP ―9m 降嶮発現を定量的に比較した．いずれも低グルコース，低酸素十低グルコ―ス下で MMP ー9mR 乢へ発現が有意に増強し，また但識素下では2 種類の細雌！株でMMP ―9m 丶へ発現 が有・意｜こ増強した，
2 ．低酸素・低栄養下でのMMP ‐9 蛋白発現：いずれの細胞株においても低酸素，低グルコ―ス，
低 酸 素 十 低 グ ル コ ― ス で 培 養 す る と ， MMP − 9 蛋 白 発 現 が 明 ら か に 増 強し て い た 3 ．低酸素・低栄養下での浸潤能：低グルコース，低酸素十低グルコース下での浸潤能はコン卜
□ 一 ル に 比 し 有 意 に 増 加 し た ． ま た 低 酸 素 下 で も 浸 潤 能 は 亢 進 傾向 に あ った ． 4 ．dnHIF ‐1Q 導入株におけるMMP ー9mR 乢へ発現：ペクターコン卜□一ルでは，但酒菱素誘導遺 伝子である aut 一1 や刮doIaSeAm 剛A の発現が低酸素で誘導されるが，dnHIF ‐1Q 導入株にお いては発現亢進が認められなかった．ついで MMP −9m 剛 A 発現を re 刮‐ timePCR にて検討し たところ．am ‐1 等と同様にべク夕一コント口一ルでは低酸素下で誘導されるが，dnHIF ‐1Q 導 入株においては発現亢進が認められなかった．
【考案】
本研究で，低酸素誘導転写因子 HIF −1 の結合配列のコンピュ一夕一解析から MMP ―9 を明ら かにした．さらに低酸素・低栄養下でMMP ．9 の発現が増強すること，それによって癌細胞株 の浸潤能が亢進することを明らかにした，MM 円の転移における重要性に関しては，すでに多
＜の論文が発表され周知の事実となっている．本研究は，低酸素や低栄養といった常に腫瘍細 胞が直面する環境そのものが，MM 円産生を増強することをはじめて明らかにした．一般に MM 円の発現は癌細胞からの産生および活r 生から検索することが多い．本研究では，著者らが 注目しているHIF ‐1 の機能からアプ□一チして MMP −9 を同定した．MMP ―9 のプ□モー夕―
領域に HlF ＿1 の結合モチーフが存在すること，およびdnHIF ． 1a 導入株では低酸素による MMP ー9 発現亢進が消失していることは，低酸素によるMMP ー 9 の転写誘導が HIF ‐1 によって調 節され ている 可能性を強く示唆している，次に，低酸素，低栄養下におかれた癌細胞の MatrigeI への浸潤能が亢進することを示した．この現象には，上述したMMP ― 9 の産生増強が 関与することは明らかである．しかし，著者らはすでに，低酸素によって癌細胞の運動能を亢進 させる autocrinemotilnyfactor （AM りの産生亢進を見出しており，MM 隗だけが癌細胞の浸 潤能亢進に関与しているわけではない．低酸素や低栄養によって少な〈とも運動能とMM 降の 産生が亢進するという事実は．低酸素や低栄養という腫瘍環境自身が，癌細胞の転移能亢進を誘 導している可能性を強〈示唆する．そして，転移そのものが癌細胞の低酸素適応応答である可
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能r 生を示唆しており，今後検証すべき課題である．
【結語】
低酸素・低栄養下にある癌細胞の転移能亢進に，HIF‑1 を介したMMP‑9 の関与が推察された，
学位論文審査の要旨 主査 教授 浅 香正博 副査 教授 細川眞澄男 副査 教授 田 中一馬
学 位 論 文 題 名 低酸素・低栄養下での
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matrlXmetanoprotemaSe‐ 9（ MMP― 9） の 産 生 増 強
遠 隔 転 移 は 癌 に お け る 主 要 な 死 亡 要 因 で あ り ， こ れ を 抑 制 で き れ ば 予 後 の 改 善 も 期 待 で き る ． 最 近 ， 癌 組 織 中 の 酸 素 濃 度 カq氏 い ほ う が 予 後 不 良 で ， 遠 隔 転 移 の 多 い こ と が 報 告 さ れ た ． 細 胞 が 低 酸 素 に 曝 さ れ る と 低 酸 素 適 応 に 必 要 な 因 子 の 発 現 を 誘 導 す る ，hypoxia‑inducible factor‑l (HIF‑1） カs:ztlt化 さ れ る ． 本 研 究 で は ， 低 酸 素 カs種 瘍 細 胞 の 浸 潤 転 移 を 促 進 す る 可 能 陸 を 考 え 低 酸 素 下 で 発 現 誘 導 さ れ る 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス 蛋 白 分 解 酵 素 （MMPS)の 同 定 を 試 みた ． 既 知 のMMPSの う ち，mat rix
met alloproteinase‑9（MMP‑9)の ア ロ モ ー タ 一 領 域 にHIF‑1の 結 合 配 列 を 認 め た た め ， 低 酸 素 ・ 低 栄 養 に よ るMMP‑9の 発 現 制 御 に つ い て 検 討 す る こ と と し た ． 実 験 に は ， 膵 癌 細 胞 株 ， 卵 巣 癌 細 胞 株 ， 線 維 肉 腫 細 胞 株 ，dominant negative HIF‑la(dnHIF‑lめ 導 入 株 を 用 い た ， 低 酸 素 下 培 養 は1％ 酸 素 濃 度 下 で 行 い ， 低 栄 養 培 養 は ，DMBVIに 10％FCSを 添 加 し た 低 ク ゛ ル ］ ― ス 培 養 液 で 行 っ た ， R1‑‑PCFj real‑time PCR及 び Western blot法 を 用 い てMMP9の 発 現 を 検 討 し ， ま た 浸 潤 能 の 検 討 も 行 っ た ． ま ず ， 各 種 膵 癌 細 胞 株 に お い て 低 酸 素 下 でMMP‑9 mRNA発 現 が 誘 導 さ れ る こ と を 確 認 し た （F叮 ―KR； 萄 ． 次 にreal−time PCR法 に よ っ てmR丶IA発 現 を 定 量 的 に 比 較 し た ． 低 ク ． ル コIス ， 低 酸 素 十 低 ク ． ル コ ― ス 下 でMMP‑9 mRNA発 現 が 有 意 に 増 強 し ， ま た 低酸 素 下 で は 2種 の 細 胞 株 で MMP‑9 mRNA発 現 が 有 意 に 増 強 し た ， さ ら に ｜ 全 て の 細 胞 株 で 低 酸 素 ， 低 ク ゛ ル コ ー ス ， 低 酸 素 十低 ク ゛ ル ］ ―ス 下 に て ，MMP‑9蛋 白発 現 が 明 ら かに 増 強 し て い た(Western blot法） ． ま た ， 低ク ． ル コ ― スI低 酸 素 十 低 ク゛ル コース 下での 浸潤能 は有 意に亢 進 し ， 低 酸 素 下 で も 亢 進 傾 向 に あ っ た ． 最 後 にdnHIF‑1Q導 入 株 に お け るMMP‑9 mRNA 発 現 を ，real‑time PCR法 に て 検 討 し たGlut‑l mRNA等 と 同 様｜ こ ベ ゥ タ −］ ン ト ロ ー ル では 低 酸 素 下 で 誘 導 さ れ る が ，dnHIF‑1Q導 入 株 で は 発 現 亢 進 が 認 め ら れ な か っ た ．MMP‑9の ァ ロ モ ー タ ― 領 域 にHIF1の 結 合 モ チ ー フ が 存 在 す る こ と お よ びdn HIFla導 入 株 で は 低 酸
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