家 兎 滑 膜 細胞 由来 軟 骨細胞活性化因子 関 す 実験的研究

金沢大 学 十全 医 学会稚 託 第9 6巻 第3 号

⁵

8 7−^{5 9}

⁸

く1 9 8 7J 5 87

家兎滑膜細 胞由来^の軟骨 細 胞 活性 化 因 子^に関する実験 的研 究

金 沢大 学 医 学部整 形外科 学 講 座く主 任

二

野村 進 数按I

渡 辺 省

く昭和

^{6 2}

年

⁵

月

⁶

日受 付ン

家兎 滑 膜細 胞 由 来

^の

軟 骨 細胞 活 性 化 因子 くカ タ ポ リ

^ン

1 の滑 膜細 胞

^に

お け る起 源と軟骨 細 胞への作 用 を生 化学 的

^に

検 索す る と と も

に

，

こ の

因子 を部 分 精製し た． 初 代 培養 家 鬼 滑膜細 胞お よ び樹 立 家弟 滑膜 線推 芽 細胞 くH I G^，8 2 掛 を， 0．1

_J

L

g

l ml の

_p

ho rbol m

y

ris

t

a

t

e a c e

t

a

t

e くP M Al 処理 す る事

に

よ り 順化 培地を作製し た．

こ の

順 化培 地を 4倍 稀 釈し た培 養 液で初 代 培 養家 兎 関節 軟 骨細 胞を培 養す る と， 軟骨細 胞は活 性 化さ れ， そ

の

培 養 液 中

^の

中 性カ ゼ イ ナ ^ー ゼ， 中性ゼ ラ チ ナ^ー ゼ お よ び中性^コラ ゲ ナ ^ーゼ

の

各活 性 と プ^ロ

^ス

タ グ ラ

^ン

ジ

^ン

E² くP G E21 量は著しく 増加し た． そ の増 加は， H I G⁻8 2 株細 胞順 化培 地

^に

よ る刺 激

で

， そ れ ぞ れ^コ

^ン

ト^{ロ ー}

ル の

8 6^．4 倍 く

p く

0^．00 1l， 60^．3倍 く

p く

0^．0

1

l， 5 1^．7 倍 く

p く

0．05l， 21．9倍 く

p く

0．05 1 であり， 初代 滑 膜細 胞 順 化培 地^{に よ る}刺激で， そ れ ぞ れ^コ

^ン

ト^{ロ ー}

ル の

7 5^．2 倍 く

p く

0^．0 01う， 6 5^．6 倍 く

p く

0^．0 11， 5

4

．3 胤 2 3^．1 倍 く

p く

0．0引 で あ^っ た． し か し， 酸性^{カ ゼ イ ナー ゼ}， 酸 性ゼ ラ チ ナ^ー ゼ お よ び月^．グ

^ル

^{クロ ニ}ダ^ーゼ清 性は上 昇し な かった^． P M A 処理 を受け な

^い

場 乱 滑膜 細胞 順 化 培地

^に

は軟骨 細 胞 活性 化 能は全 く 認め ら れ な か^っ た． 次

^に

， H 工G−^{82 株 順化 培 地}

^か

^{ら ア ミコ}

^ン

^社製

^{フ ィ ル}

^ター虐用

^い

^た遠

心法

^に

よ り分 離さ れ た第工I分 画 く分子量

1

0^旬2 5 E Dつも軟 骨細 胞を活性 化し， そ の培 養 液中の中性カ ゼ イ ナ ^ー ゼ， 中性ゼ ラ テ ナ^ー ゼ お よ び中 性コ ラ ゲ ナ ^ー ゼ の各活 性と P G E² 量は， そ れ ぞ れ^コ

^ン

ト^{ロ ー}

ル の

7 0．9 倍 く

p く

0．O ll，

1

5 5^．0倍， 1 0 2^．4 倍， 2 7^．8倍 く

p く

0^．0 0 11

^に

増 加し た． P G E2 uO^−5旬10⁻⁸Mlや P M A く5

へ2 5n

g

ノmlうそ れ自体

^に

は軟 骨 細 胞

^の

活 性 化能は見ら れ な かった． 以上 の結 果か ら， 本 実験で の軟骨 細胞 活性 化 因子 は従 来よ り報 告さ れ て

^い

る カ タ ポ リ

^ン

と考え ら れ た^． ま た^， カ タ ポ リ

ン

は P M A

に

よって刺 激 さ れ た滑 膜線 椎 芽 細胞 は 型細 胞1

^か

ら分泌さ れ る事が明ら か と なった． さ ら に カ タ ポ リ

^ン

は軟 骨細 胞を 活 性 化し， 中性 蛋 白 分解 酵 素を分 泌さ せ，

こ

れ ら

の

酵 素の作用

に

よって軟骨の細胞 間^マト リック

ス

の分 解 が 生ずる も

の

と考え ら れ た^．

K

e

y

^{w o}

^rd

s c

h

o n

d

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y t

^{e a c}

ti

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ti

o n

，

S

y

^{n O V}

i

a

l f

a c

t

o r

く

^{c a}

^t

^a

^b

^o

^li

ⁿ

l，

S

y

^{n O V}

i

a

l fibr

o

bl

a s

t くH I G⁻8 2う，

n e u

t

r a

l _p

r o

t

e

i

n a s e

_，p^r

^{O S}

t

a

gl

a n

d i

ⁿ

E2

慢 性 関 節リ ウマ チ や変 形 性 関 節 症を は じ め と す る 種

々 の

関節 疾患

の

関 節 軟骨 破壊 機 序

^に

関し て は， 滑膜 や軟骨組 織 由 来

の

蛋 白 分解 酵 素， 荷 重

^に

よ る機 械 的負 荷， 加 令

^に

伴う軟 骨 代 謝

^の

低下 な ど が提 唱さ れ

て

き た^{I I．} し

か

し，軟 骨

^の

破 壊は そ

の

細 胞 間^マ ト リック

ス の

分解

^に

よ^っ

^て

進 行す る

^こ

と

^か

ら， 種

^{々 の}

蛋白分 解 酵素 が軟骨 破壊

^に

重要な役 割を果た す と考え ら れ る．

こ

れ

ら

の

蛋白 分解 酵 素

^に

は軟骨 細胞や滑 膜細 胞

^お

よ び滑 膜

に

浸 潤し た炎症 細胞

^に

由 来す る も

の

が あ げ ら れ る．

こ

れ ら

の

う ち軟 骨 細 胞

^に

由 来す る 蛋白 分解 酵 素は， 滑膜 炎

の

強く な

^い

変 形 性 関節症 初 期や慢 性 関節リ ウ^マチ

に お

いて も軟 骨細 胞 周辺部

^で

， 関 節軟 骨破 壊

^に

重要な役 割を果た す と考え ら れ て

^い

る^{り2 1．}

軟 骨細 胞

^に

作用 す る

^こ

と

に

よ^っ

て

軟 骨

^の

プ^ロ テ オ グ

A bbr

e v

i

a

ti

o n s ニ

A P M A ，

a m

i

n o

ph

e n

yl

m e r c u

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t

^e

三D ，d

a

lt

o n

ニE G T A，Eth_yl

e n e

gl_y

c o

l⁻ bi

s

く月⁻

^{a m}

ⁱ

^{n o e}

^thyl

e

th

e r

ト^{N ，N ，N ，N ，一t}

^e

^t

^{r a a C e}

^ti

^{c a c}

^id三I L^，1_，i

n

t

e r

l

e u

ki

n

l ニK D， k il

o

d

a

lt

o

n三 P G A，P

^{r O S}

t

a

gl

^{a n}

^di

ⁿ

^A 妄P G E^l，p

^{r O S}

t

a

gl

^{a n}

^di

ⁿ

^{E l}ニP G E2，p

^{r O S}

t

a

gl

^{a n}

^{din E2}三P M A

，ph

o r

b

o

l12⁻

m

y

^r

i

s

t

a

t

e

1 3⁻

a C e

t

a

t

e

三R I A ，

r a

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o

i

m m

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o a s s a

y ニT I M P，ti

s s u e

i

n

h ibit

o

r

o

f

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t

a

ll

o

p

^{r o}

t

e

i

n a s e

．

リ カ

ン

を分 解さ

^せ

る

^カ

タ ポ リ

^ン

と^いう物 質が知ら れ て

いる． カ タ ポ リ

ン

は． ブ タ滑膜が軟 骨 片

^か

ら プ^ロ

テ

オ グ リ

^{カ ン}

を放 出さ せ る作用 を有す る

こ

と

か

ら，

1

9

7

9 年，D in

_g

le ら^{3 1}

に

よ^っ

^て

名づ け ら れ た因子

^で

あ る．

1

9 8 2 年

に

は，Sak la

t

v ala ら は ブ タ白血球

^に

も同じ作用 を持

つ

因子 が あ る

^こ

と を見出し^{4 1}， 翌 年，

こ の

白血球 由 来

^カ

タ ポ リ

ン

を精 製し

て

いる^封． し

か

し，滑 膜組 織 由 来

^{の カ}

タ ポ リ

^{ン に}

^つ

い て

は， 未だ均 質な物 質

に

ま

で

精 製さ れ

て

いな

い

．

こ

れ ら

の

カ タ ポ リ

ン の

作用 は， 軟 骨 片

^か

ら

の

プ^ロ テ オ グ リ

カ ン の

分解 放 出を

み

る^バイ オ

ア

_ッ

セ

イ

に

よ^って検 討さ れ

て お

り，

カ

タ ポ リ

ン に

よ り 活性 化さ れ た軟 骨細 胞が ど

の

よ う な機 序

^に

よ ^っ

て

そ

の

細胞 間^マ ト リッ

ク ス

を 分解す る

の か に

つ い

て

は， 検 討^{さ れ}

て

い

な^い． ま た， 滑 膜 由来

^{の カ}

タ ポ リ

^ン

が， A 型

の

滑_膜大 食 細 胞と B 型

の

滑 膜 線 維 芽 細 胞

^の

う ち

の

ど ち ら

の

細 胞

^か

ら分泌 さ れ

て い

る

^{の か}

も 明 ら

か に

は さ れ

て

し^ユな

い．

本研 究

^で

は， 初 代 培 養家 兎 滑 膜細 胞と樹立家 兎_滑膜

くb l

家 兎 滑膜 細 胞 由 来

^の

軟 骨細 胞 活性 化因 子

^に

^{つ い}

て

くcう

F i

g

^．

1

． くal Co nflu e n

t

c ul

t

u r e of la

p

in a r

t

icula r cho ndr o c

y t

e s．

X

2 0 0． くbJ Prim a r

y

c ul

t

u r e of la

p

in s

y

n ovi al c ells，Wh ich is showi n

g

he

t

e r o

g

e nie

t y

^．

X 2

0 0^． く^cJ ^Es

^t

ab lished lin e of la

p

in s

y

n o vial fibr obla s

t

く^{H I G−}8 21， Which is Sho w l n

g

ho m o

g

^{e n}ie

t y

^．

X 2 0

0^．

線 維 芽 細 胞 くH I G⁻8 2株l を，

P

ho rbol m

y

^ris

t

a

t

e

a c e

t

a

t

e くP M A l

で

刺 激す る

こ

と

に

よ り得ら れ た順 化

培地 くc o nd i

t

io n ed m ediu ml を初代 培 養 家 兎軟 骨 細胞

に

作用 さ

^せ

， 種

^{々 の}

蛋白分解 酵 素や プロ

ス

タ グ

ラ ン

ジ

ン

E2 くP G E21を測 定す る

こ

と

に

よ り， 軟 骨細 胞

^に

よ る 軟骨基質 分解 吸 収機 構と滑膜

^カ

タ ポ リ

ン の

起 源

に

つ

い て

検討し た． さ ら

に

_，H I G−^{8 2 株}

^の

^{順化 培 地よ り軟 骨 細} 胞活性 化因 子 を部 分精 製し， そ

の

性 状を検 討し た^．

材料

^お

よ び方法

工

． 細胞 培 養法

1

． 初代 培 養 家 兎関 節 軟 骨細 胞 く図

¹

^aう

Gr e e 11

の

方法^{6 I}

^に

準じ， 成熟家兎

^の

肩関節

^お

よ び膝関

節よ り関節 軟骨 を無菌 的

^に

採 取し，

0

．2 ％

^の

ト リ プ

シ ン

くG I B C O Lab．， U．S．

A

．1 処 理 と 0 ^．2 ％

の ク

ロ

ス

ト リ ジ

ウ ム

菌^コ

ラ

ゲ ナ^山 ゼ くG I B C O Lab．，U^．S．A．1 処 理

^に

よ り軟骨細胞を分 離し，

1 く 1

⁵個ノ皿

の

割 合

^で

， 組織 培養 多 皿 プ^{レ ー} トくCo mi n

g

社，U．S．A ．1

で

培 養し た．

こ の

際，

細胞数は， 血球 計 算板

^で

計 測し た．

2 ． 初代 培 養 家兎 滑 膜 細胞 く図

1

bう

軟骨 細胞

^の

場合と同 様

^に

， Gr 肥 1

の

方法

^に

準じ

て

行 な^っ た． 分離し た滑膜 細 胞は，

1

0⁶個

^の

割 合

^で

2

5

c Il 1²

組織培 養

^フ

^ラ

^ス

^コ くCo r nin

g

祉， U ^．S^．A1^．

で

培 養し た．

3 ^． 樹立家兎 滑膜 細 胞 くH I G−^{8 2 株， 図}

¹

^cう

5 8

9

本 棟は，

1

98 2 年

に

，第1 0代培 養 家兎 滑膜細 胞

^の

自発 的形質転 換

^に

よ り確 立さ れ た も

^の

で， 倍加 時 間が約2

4

時間

の

線 推 芽細 胞

^で

^{あ る．} 本 実 験

^に

は， 組 織培 養

^フ

ラ

ス

コ

に

て継 代し た 8 5 か ら

1

0 5 世 代株を使用 し た^．各

々 の

細 胞 数は， 0^．2 5％

^の

ト リ プ

^{シ ン で 1}

5 分間処理 し た 後， 自動血球ア ナ ライ ザ^ー くCo ul

t

e r Ele c

t

r o nic s， U．

S．A．1

^で

測 定し た^．

以 上

の

いず れ

の

細 胞

^{に お い て}

も， 培 養液

^に

は，

1

0％

の

牛 胎児血清，

1

0 0 単 位ノ血

の

ペ ニ

シ

リ

ン

_，

1

0 0

ノ

^ノ

g

ノml

の ス

トレプ トマイ

^{シ ン}

くG I B C O L^ab．，U^．S^．A．1 を含む Ha m ^，sF^．

1

2 くG I B C O Lab^．，U^．S^．A^．1 を 用い， 3

7

⁰C

で

，

5 ％

の

C O2 を含む 空気 中

^で

単 層培 養し た． 軟骨 細 胞^は 8 ^へ

1

0 E 問

^の

培 養

^で

， 滑膜 細胞は 5 ^へ 7 日間

^の

培 養

^で

コ

ン フ

ル エ

ン

ト

に

な^った． 本 実験

^で

は， す^べ

て

コ

ン フ

ル エ

ン

ト

^に

な^った細 胞を使用 し た．

H ． 実験方法

1

． 滑膜 細 胞

の

P M A

に

よ る刺 激

初 代培 養 滑 膜細 胞ま た

は

H I G^．

8

2株

^の

単 層培 養 細 胞 を，Ge

y

^，s平衡塩類 溶 液

^で

洗 浄後，無血清 培養 液

^で

置き 換え た． 最 終 濃 度が

0

．

1 J

^L

g

l ^ml

の

P M A くS i

g

m a

C he m ．Co．，U ．S，A．1 を含む無血清培 養液 中

^{で こ}

^{れ ら}

^の

細胞を 3 日間 培 養し， 得ら れ た滑 膜細 胞 培 養液を滑膜 細胞順化培 地と し た． 同時

^{に こ}

れ ら

の

培 養 液 中

^の

中 性

カ

ゼ イ ナ ^ー ゼ， 中性ゼ ラ ナ ナ ^ーゼ

お

よ び中 性^{コ ラ ゲ}

ナ^ー ゼ活 性と P G E2量を測 定し た．

2 ． 滑膜 細 胞順 化 培地

に

よ る軟 骨 細 胞の活 性 化 滑 膜細 胞 順 化培 地を無 血 清 培養 液

^で

， 2 ， 4， 1 0倍 稀 釈し， 初 代 培 養軟 骨細 胞^を培養し た．

こ の

予備 実験

に お い

て，

4

倍 稀 釈の も の が軟骨 細 胞を最も活 性化し た

の

で，以 下の実 験は

こ

の稀 釈倍 率

^で

行な^った． ま た，

対 照と し て 上述の滑 膜細 胞 順 化培 地

の み

で， 軟 骨細 胞

の

存 在し な

^い

標 本を 並行し

て

作 製し，

こ

れ をn o Cho ndr o c

y t

e c o n

t

r ol と名付け たく図21． 3 日間培 養 後， 各 軟骨 細胞 培 養 液 中の， 中性

^カ

ゼ イ ナ ^ー ゼ， 中性 ゼ ラ テ ナ ^ー ゼ， 中性^コラ ゲ ナ ^ー ゼ， 酸 性^{カ ゼ イ ナ ー ゼ}，

酸 性ゼ ラ テ ナ ^ー ゼ_仁釘グ

^ル

タロ ^ニ ダ^ー ゼ の各 活 性と，

P G E2 量 を測 定し た． 軟 骨細 胞よ り産 生さ れ た

^こ

れ ら

の

酵 素活 性と P G E2 量は， 軟 骨 細 胞 培 養液 中^の活 性^か ら， n O Cho ndr o c

y t

^{e c o n}

t

r ol培 養 液

^の

活性を差し引く

こ

と

^に

よ り算 出した^．

以 上 の実 験 方法を模 式 図

^に

す る と， 図3 の如く と な る．

3 ．

ヒ

ト イ

^ン

タ^{ー ロ}イ キ

^ン

1 く工しい

に

よ る軟 骨 細 胞の括性 化

市 販

の ヒ

ト白血 球工L^．1 く1 0⁻²，1 0^一王，1，1 0，2 5 単位ノ

ml，Cis

t

r o n，U ^．S．A1． を直 接， 初 代 培 養軟 骨 細胞 培 養 液

に

添加し， 3 日後の培 養 液 中

^の

上述

^の

中性プロテ

ィ

ナ ^ーゼ活 性と P G E2量を測定した．

H ． 酵 素活性， P G E2塁

^の

測定 1 ． コラ ゲ ナ ^ー ゼ ア

ッ セ

イ

N a

g

^ai ら⁷¹

の

方 法

^に

準じ る

ミ

クロ

フ ィ

プ リ

^ル

アッ

セ

イ を 用

^い

た． 牛皮^コラ^ー ゲ

ン

を

，^{，G is slo w ら}

81の方法

^に

準じ³H^．a c e

t

ic a nh

_y

dri de くNe w En

g

la nd Nu cle a r，

U ^．S^．A1^．

で

標識し放 射性^コ

^ラ

^ー ゲ

ン

を作製し た．

こ の

放 射 性^コ ラ^ー ゲ

^ン

の 比放 射 活性は非 放 射性^{コ ラー ゲ}

^ン

添 加

に

よ り 1 0 00 c

p

mJ

J

^L

g に

調 節し た．アッ

セ

イ

^に

は，

2 5

パ

1く7 5

月g

うの放射 性コラ ^ー ゲ

ン

を基質と し， 2 0

_メ

^イl の標 本 培 養 液と 3 0

_ノ

バ の緩 衝 液を混 合し， 最 終 濃 度1

匝 ^還

^{． 一}

画 ^{no c}

^h

^on

^d

^{r o c}

^y

^{t e c o ntro}

^l

Fi

_g

^．2^{． 一一}No cho ndr o c

y t

e c o n

t

r ol^，， wh ich c o n

t

ain ed d ilu

t

ed s

y

^{n o v}ial c o ndi

t

io n ed m ed iu m wi

t

ho u

t

Cho ndr o c

y t

e s w a s s e

t

u

p

in

p

^{a r a}llel^． B

_y

s ub⁻

t

r a c

t

in

g t

he e n z

y

mic a c

t

ivi

t

ie s of

t

he ^{L E}N o Cho ndr o c

y t

e c o n

t

r ol^，，fr om

t

ho s e of

t

he s a m

p

le，

t

he e n z

y

^m e s s e c r e

t

ed b

y

cho ndr o c

y t

e s w e r e e s

t

im a

t

ed．

m M

の

a min o

p

he n

y

lm e r c u ric a c e

t

a

t

e くA P M A l

の

存在， 非 存 在 下

^で

，3 7⁰C，

4

時 間反応さ

せ

た． 反応 乳 5 0

J

^Ll

の

E

t

h

y

le n e

g

l

y

c ol b is く月^{−a min o e}

^t

h

y

l e

t

he rl^． N， N ，N_，N ^，−

t

e

t

r a^，a C e

t

ic a ci d くE G T A，S i

g

m a C he m．

Co．，U^．S^．A^．1

^に

て 反応を 止 め，1 2 0 0 0

_g

，1 0 分間遠心 し，

上清5 0

_声

l

の

放射 活 性を液 体

シ ン

チ

^レ

^ー

シ

ョ

ン カ ウ ン

タ ^ー

に

よ り測 定し た．

2 ． 中性ゼ ラ チ ナ ^ーゼ アッ

セ

イ

6 0⁰C，3 0 分 間加温処筆削

^こ

よ り牛 皮^コラ^ー ゲ

ン か

ら ゼ ラ チ

^ン

を作 製し，

3H^．a c e

t

ic a nh

y

dri de で標識し た^． 放 射 性ゼ ラ チ

ン の

比放 射 活性は，

1

0 0 0c

p

ml

J

^L

g に

調節し た^． 2 5

ノ

^ノ1く7 5

_{月 g}

ぅ

^の

放 射 性ゼ ラ チ

ン

を基 質と し

て

用

い， コラ ゲ ナ^ー ゼ アッ

セ

イ と同 様^の方法

^で

， 3 7^DC， 4 時 間反 応さ せ た．未 消 化ゼ

ラ

チ

^ン

を 1 6％ト リ

ク

ロ ^ー

ル

酢 酸で沈 殿さ せ，遠心分離 嵐 上清5 0

_声

1

の

放 射活性を 測 定し た．

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