研究 膜 透過性 関す 抗 癌剤 け 実 験的

金沢 大 学十 全 医学 会 雑誌 第1 0 3巻 第3 号 5 9 9 ⁻6 0 9く1 9 9 41

実験 的 ^ラ ッ ト グ リ オ ^{ー マ} に お け ^る 抗 癌 剤 ^の 膜透 過 性 ^に 関 す ^る研 究

金 沢 大 学 医 学部 脳 神経 外科 学 講 座 く主任^二山下 純 宏 教 軌

中 島 良 夫

5 9 9

悪 性 脳腫 瘍^への抗 癌 剤の到達 性^にほ 血液脳 関 門が大きく関 与し て^いる． 抗 癌 剤を脳 腫 瘍に選 択 的に送 達さ せ る た めに はt 抗 癌 剤^の脳 腫 瘍お よ び脳組 織^へ の移 行 性を 明 ら かにする 必要^がある^． 本 研究^{ではラ ット}脳 内^に 9 L グ リオ ^{ー マ} を移 植^し，

脳 腫 瘍^におけ^る毛細^血管^の構造と機 能^の変 化を脳 内^吸収 指数 くbr ain up takeinde x，B U Il 法^と電子顕微 鏡^によ り検索し た^． そ^の 結 果， 細 胞 外液^の指 標と し て用^いた対 照 薬 剤^{の シ} ュ クロ ^ー ス くs u c r o s el ^は腫 瘍 魁織 内に選 択 的^に移 行し た^． 超 徴 形態 学 的^には 脳腫 瘍 以 外の観 織^の血管^はl 血液脳 関 門^の構 造を保って いた が， 脳腫 瘍^では有窓 形 成や内 皮細 胞^の不連 続 性， 接 合 部^の関大な どが認め ら れ 血液 脳 関 門ほ破綻^{し ていた． アド リア マイシ ソ}くadria mycin， A D MJ， ラ ^ニム ス テ ン く^トく²r^{chlo r o eth}yll−³⁻b ethy，

1a⁻D−^{glu c op yr a n o s−6−yll}−^1−nitr o s o u r e a，M C N Ul^{，5−フ ロ ロウラシル}く⁵−^flu o r o u r a cil，5⁻F Ul， 塩酸^ニムス チソ く1⁻t4⁻a min o−^{2m ethyl}

p yrimid in e⁻5⁻yll−^{m ethyト3}−^く2−^{Ch lo r o ethyll}−³M^nitr o s o u r e a hydr o chlo ride，A C N Ul ^の4 種類^の抗癌 剤^の脳 腫 瘍 阻織^への透 過 性を検 討した結 見 A D M，M C N U，5−^{F U は}脳 腫 瘍 組 織^に選 択 的^に移 行し， こ のう ち 5⁻F U は腫 瘍細 胞 膜^{で の}透 過 性が高 く 腫 瘍細 胞 内

にも 移 行し た． A C N U は 血液 脳 関 門^を透過^し， 脳 腫 瘍 以 外^の阻 織^に移 行して^いた^． 以上の結果ほ， 抗 癌 剤^の脳 腫 瘍^への透 過 性 ほ， 血液 脳 関 門で は なく 腫 瘍細 胞 膜に よ り制 限^されていること を 示 し て^いる． した がって， 本^モデルを用^いた薬 物 動 態学 的研 究^によ り， 抗癌 剤を脳 腫 瘍^に選 択 的^に送 達さ せ る た め に は， 正常^の血液 脳 開 門^は透 過^せず 腫 瘍 細 胞 膜^せ選 択 的^に透 過し得る 5−^{F U のよ う な}性 状^を持^った抗 癌 剤を用^いる^べき^である^こと を 示唆して いる^．

Key ^{w or}ds blo od⁻brain ba r rie r，brain up t^ake inde x_， Che m othe r ap y^，9 L _gli^orn a

近 年， 外 科 的 治療， 放 射 線 療 法， 化 学 療 法な ら び^に免 疫 療 法 な ど を集 学 的^に施 行 する^ことによ り， 悪 性 腫 瘍^の治療 成 績は飛 躍 的^に向上 して いる が， 悪 性 脳腫 瘍^の治 療 成 績ほ期待さ れ た程

には向^{上 して い}な^いり． 化学 療 法^{におい て}は， 感 受 性のある抗 癌剤を殺 細 胞 濃度で腫 瘍 細 胞^に到 達さ せ ること が必 須である が， 脳腫 瘍にお^いて ほ 血液^{か ら}脳 組 織^{へ の}薬 剤^の移行を制 限す る 血液 脳 関 門^が存 在 する た め， これは必 ずしも 容 易で ほ ない．

血液 脳 関 門^に つい ては， Re e s e ら^{2 ，}が 西洋わ さ び^ペ ルオ キシ

ダ^ー ゼをト レ^ー サ ^ー と して電子顕 微 鏡^で観 察^し， そ^の本 体が 脳 毛細血管 内 皮細 胞^にあること を初^{め て}証明 し た^． 脳毛 細血管 内 皮 細 胞ほ超 敏 形 態 学 的^に， 内 皮 細 胞が 互い に密 着 帯 く^tight

j^{u n ctio n}l で接 合 し て ^いる ^こと ， 胞 体 内^の飲み込み小 胞

くpino cy totic v e siclel がきわ めて少な^{い こ}と， 有 窓くfe n e str ati−

O nI 形成^が存 在し ない こと， お よ び 血管周囲が グ リ^ア細 胞^の終 足^によ り覆われていること な ど が特 徴と さ れ^{て い}る^抑． グ リア

細胞は 血液脳関 門^{と しての}構造^と機 能^を稚 持 す^{る た めに}重 要な 役割を ほ た して いる と さ れて いる^匂． 機 能 的^には， 血液 脳 関 門 を通 過^し得る物 質ほ脂 溶 性^の高^いも^の， ブ ド ウ糖やア ミ ノ酸^な ど何ら かの輸送 担 体^が関 与 するも^{の に}制 限さ れ^{て い} る^引． すな わ ち， へキ^{ソー ス}， 単^{カ ル}ポ キシ ル酸， 中 性^{ア ミ ノ}酸， ア ミ

ン， 塩 基性ア ミ ノ酸， ヌクレオ シ ド， プリン塩 基， 甲状 腺ホ ル モ ンな ど^に関して少なくとも8 種 類^の異^{な る}輸 送 系^がある と さ れて いる^即．

一 方， 種^々の病態^で血液 脳 関門は容 易^に破 綻 する と さ れてお り^れ， 脳 腫 瘍^でも 脳 毛細^血管^の構造^と機 能^の変 化^{につ い}て ほ^い

く^つかの報告^{8 卜 1 射}があるもの の， 脳慮 瘍 内^血管^の透 過 性^に関し

ては 不明な点が多^い．

現 在， 血液 脳 開 門^に抗^{し て}脳 腰 瘍^に抗 癌 剤を送 達さ せ る た め， 脂 溶 性^{の カ ル ム ス チン}く1．3−^bisく2−^{Chlo r o ethyu}−^トnitr o s o u rr

e a．B C N UJ， ロ ムス チン tl−く2−^{Chlo r o eth}yll−³−^CyClohe xyトトnitr o−

S O u r e a，C C N U l， セ ム ス チ ン り，^く2−^{Chlo r o eth}yり，³一く4ェ^{m eth}ylcyc−

lohe xyu−^トnitr o s o u r e a， m ethyトC C N Uンな どの^ニ ト^ロ ソウレア系

の薬 剤^が悪 性 脳腫 瘍^に対^してほ よ く 用いられ^{て い}る^{1 5 ，1 6 1} が， こ れ らの薬剤^{は 血}管か ら離れ た腫瘍 細 胞^に薬 剤が十 分 到達し待な いと^いう欠 点を持って いる^怖．

一 方， マ ニ ト^ー ルな どの高 張 液 を用^{い て}脳 毛 細血管^の薬剤 透 過性^を人工的^に高め ようとする試 みもな さ れ て^いる^{1 TIL2 2 −}が， 薬 剤が 正常 脳 組織^に移 行 する^ことに よ る神 経毒 性^の発現^が懸念さ れ る^． した がっ て 巨踵 瘍 部位 以外

の正常 脳組 織^には移 行せず， 脳腫 瘍^{に の}み選択 的^に移 行し得る 抗 癌 剤を用^いれば， 効 果と副 作 用^の両面か ら理 想 的^な化学 療 法

平 成5年⁸ 月2 日受付， 平 成6 年^{4 月2 6 日受 理}

A b breviation s こA C N U，トく^{4−amino−2m eth}yl_{p y}rimidin e⁻5⁻_ylj^{−m eth}yト3⁻く^{2−Chlo roeth}ylう^ー3−^{nitroso u r e ah}yd^ro chlo ridei A D M ， adria m y^cin3 B C N U，l ，3⁻bisく^{2−Chlo r o eth}yl 汁^nitr o s o u reaニB U I， br ain up t^ake inde xi C C N U ，トく^{2−Chlo r o eト} h 跡^3−Cy^Clohe xyl⁻トnitr o s o u r e a ニ 5⁻F U ， 5 イIu o ro ur a cil ニ m ethyl⁻C C N U， トく^{2−Chlo r o eth}yll⁻³⁻く⁴−^{m eth}ylcy^clohexylJ⁻

が行え る と考え ら れ る．

本 研 究^{でほ 9 L グリ オ ー マ}を脳腫 瘍^のモデ^ルと して用^い， 脳 腫 瘍^における毛 細血管^の構 造と磯 能^の変 化を脳 内 吸 収 指 数 く^{br ain u}p takeinde x，B U Il 法^{2剃 と}電 子顕 微 鏡^を用^{い て}検 索^し，

そ^の結 果に基^づき 脳 腫 瘍^に選 択 的^に抗癌 剤^の送 達を行 う^には．

抗 癌剤に ど^のような性 質が 必要である かに つ いて検 討^{し た．}

材 料 および方 法 王． 実 験 動 物

雄性^{の フ}ィ ッ シ_ャ ^ー系ラッ ト り 適 齢， 体 重1 8 0 ⁻2 2 0gJ く日 本^チ ャ ^ー ルズ リ^{バ ー}社， 厚 木I を用^い， 金 沢 大学 動 物 実 験 施 設 内^の空 調 飼 育室 く室 温 ^{23 士2 て}， 湿 度^{5 5 士5}瑚 ^で1 餌と 水 を自 由に与えて飼 育^した．

H ． 試 薬

本 研 究^{で は}放 射 性 標 識 化 合 物と し^てほ，

1 4C^−シュ クロ ^ー ス

ぐ⁴C^，S u C r O S eH 5^．Om CV ^{m m ol}l くNe w Engla nd Nu cle a r， Bo sto n，

U^．S^．A^．1，

3H^一永 く^{3H−W ate r}l く^{1．OmC i}ノglく^{Ne w En}gla nd Nu cle a rl．

N−^{ト1 4C−ブ タ ノ ー ル} くN⁻ト^ー4C⁻buta n oけ く1^．1m C iJI

m m oll くNe w

Engla nd Nu cle a rL ³H⁻5⁻フ ロ ロ ウ ラ ^{シ ル} く^里−5−flu o r o u r a cil， 3H⁻5⁻F UH^{1 9．3 C i}Jlm m o11 く^{Ne w En}gla nd N u cle arl，

1 −C一^{塩 酸ニムス}

チ ソ ぐ⁴C−^トく4⁻a min o⁻2m ethyI p yrimid in eふyll⁻m ethylL^{3−く2−Ch lo−}

r o ethyu⁻3⁻nitr o s o u r e a hydr o ch lo ride，

l −C⁻A C N UH^{2 7}FLC iI^{m gIく三} 共， 東 京1，

1 4C⁻ラ ^ニム ス チン ぐ^4C−^l−く2⁻Chlo r o ethylJ⁻3⁻くm ethyla⁻

D⁻glu c op yr a n o s⁻6⁻ylJ⁻1⁻nitr o s o u r e a，

一4C⁻M C N Ulく^{4 5}F^LC il ^mgl し東 京 田辺， 東 京1^を使用^{し た．} 非標 識 化 合 物と し て はl ア ド リア ^マイ シソくadria mycin， A D M H 協和 発 酵， 東京 トを使 用し た^．

m ． 細 胞の移植^{2 5I}

l O ％ 非 働^ウシ胎 児血清 くf^etal _{c a}lf s e r u m ， F C SH G I B C O，

Gr a nd Isla nd，U S Al を含む R P M I 1 6 4 0 培 地 く日水 製 薬， 東 京ト^{に て}l 培 養^{し たラ} ット 9 L グ リ オ ^{ー マ}細 胞^抑を 3 ^xl Oソ^{ml に} 調製し， 等 量の1 ％の寒 天を含 む 培 地を加 え，l^．5xl Oソ^mlの細 胞 浮 遊 液を作 製し た． 対照と して，0^．5 ％の寒 天^を含^む培 地^を使 用^{した． ラ}ッ ト を塩 酸^{ケ タ ミソ} く⁸r ngハ^{0 0}g， 筋 注ぅ ^{に て}麻 酔 後， 定 位 脳 手 術 装 置^に 固定し， 冠 状 縫 合上 ^で矢 状 縫 合よ り 3m m の位 置^に直径^{1．5m m の}穿 頭^を行^い，右 尾 状 核^一 被 殻部^に 1 0_jLl の9 L グ リ オ ^{ー マ}細 胞 浮 遊 液く1^．5^x l O⁵c ellsI を約3 0秒かけ て移 植し た^． 対照 群^には同量^の0^．5 ％の寒 天^を含む R P M I1 6 4 0 培 地^を注入 し た^，

N ^． 脳 腫 瘍 内の毛 細血管の透 過 性に関 する実 験 1 ． B U 工法

り ^{B U 工}法 く図 り

0 1de ndo rf ら^{2馴 の}方 法に し た がった．

移植1 4 日 目の ラッ ト を塩 酸^{ケ タ ミン}く2 3^．5m gハ^{0 0}g， 勝 江I と キシ ラジ^ンく2^．3m gハ^{0 0}g，筋 注1 ^にて麻 酔 後， 右総 頚 動 脈^を露 出 し た． 基 質^{と し で4C−シュ クロ ー ス}く^{1 0}恥^{C i}ノ^mりを，基 準 物 質^と し て ³H^一水 く^{5 0}F^LC iノ^mlJ を含 むリ^ン ゲル の H E P E S 緩 衝 液 くpH 7⁻のを作 製し た^{． こ の}リンゲル の H E P E S 緩衝 液^{2 00}FLl を ラッ tの総 頸 動脈 内^に瞬 時 く^0．5 砂 以 和 に投 与し， 5秒 後^に断 頭し右 大 脳 半 球を摘 出した^． こ の時 間ほ注入 された物 質^が脳 内 を 1 回循 環 するの には十 分^な時 間^であ^{る が}， 物質が脳か ら逆 流 し た り仁脳 内を 2 回循 環 するにほ短い時 間である^． 摘 出し た脳

は腫 疹， 皮 質， 海 馬， 間脳^の部 位^に分 け， 粉砕し た後， それ ぞ れ 1^．5mlのプ^ロ トゾ^ー ルくNe w Engla nd Nu cle a rl を加え た．

一

方， 脳を ^一 塊^{と し て}定 量す^{る と}き^は粉 砕^{し た}後， 2 本^{の バ}イア ル に分注し， それ ぞれ 1^．5_mlのプ^ロト ゾ^{ー ル}を加 えた^．6 0 てこで 3時 間 振 返し， 組 織を 可溶 化し た後， 3 0 ％ 過 酸 化 水 素 水を 30 0函 加^え， 室 温^{で1 5}分間 静 置した． そ^の後，6 0 C で3 0分 間加 熱し， 室 温^にて冷 却後， 液 体シ ンチ レ^ー ショ ンカ ク テ ル クリア ゾ^ルf 伴 井化 学， 京 恥 ^{を 1 0ml}，1 0 0 ％ 酢酸を 6 4ノ^Jl 加え， 液 体^{シ ンチレ ー シ}ョ ンカウ^ンタ ^ー L S C⁻67 1くA loka， 東 京I ^{で 3}H と^{1 −}C と放射 活 性を測 定し た．

2つ 解析 法

B U l 値は次^の式で計 算し た^．

B U Iく^％1 ^ニ

Ct，dノ^Ct，r

C i，d_J^Ic i，r Xl O O

Ct．dこ基 質^の脳 内^の放 射 活 性 く^dpml脳1 Ct，r ニ基 準物 質^の脳 内^の放 射 活 性 くdpmノ脳I C i，dこ基質^の薬 液 中の放 射 活 性 く^dpmノ薬液I C i，r 二基準 物 質^の薬 液 中^の放 射 活 性 く^dpmノ薬 液う

2 ^． 脳 毛 細血管 内 容 積^の測 定 り 赤^血球^がICr 標 識方 法

ラッ ト総 頚 動 脈^{よ り}採血 し た 血液^に1ノ⁷ 容 積^{の ク エ} ン酸デ キス ト^{ロ ー} ス溶 液くa cid⁻Ci^tr ate，^{de xtr o s es olutio n}，A C Ds olutio nJ くpH 5．OI を加え撮 拝^し， 1 5 0 0rpm で 1 5分 間遠^{心 し た． 上}帝を捨 て， 得ら れ た赤血球^に等 量^の 0^．1 M リン酸 緩 衝 生理的 食 塩 水 くpho sphate⁻buffe r ed s alin e，P B SI くpH 7．4I を加え据 絆し， 同様

に遠心 し た^． こ の洗 浄 操 作^をも う^一 度 繰り返し た^． 上清を捨 て， 得ら れ た赤血球 分 画 1 0 0F^Ll に対^{し Na25 1CrO}．く^{3 7 6．3 9mC i}ノ

m gCrl く^{Ne w En}gla nd Nu cle a rl ^{が 1 0}J^LC i にな る ように加 え^て捷 拝し，3 7 C で 3 0分 間 静 置し た^． P B S を加え渡 拝し， 1 5 0 0rpm

で1 5分 間遠 心^{した． 上}清^と赤^血球 分 画^とに分 け， 上清^の放射 能 活 性^が赤血球 分 画^の1 ％以 下にな る まで同様^の操 作を繰り返し た^． 最 後^に赤血球と等 量^のリンゲル の H E P E S 緩 衝 液を加え て

4 こ で保 存^した．

ニニ彦^フ

Fig^．1^． Sche matic r epr e s e ntatio n of inje ctio n pr o c edu r e ofa mixtu r e of ^{1 4}C⁻1abeled s ubsta n c e a nd ³H−^{labeled s ubsta n c e}

into the r at c o m m o n c a r otid ，a^{rte ry fo r br ain up take inde x}

くB U エー^．

トnitr o s o u reai M C N U ，lく^{−2−Chlo r o eth}yll⁻³⁻く^{m eth}yla 皿glu cop y^{r a n o s−}6⁻ylト^1qnitr o s o u r e ai P B S， pho sphate buffe r ed

S aline