珪 肺 症 け 抗 抗体産生 関 す 研 究

金沢大学 十 全医 学 会雑 誌 第

9 8

巻 第

2

号

4 8 9

^疇

5 0 6

く

1 9 89

う

珪肺^{症にお ける}抗 ^コ ラ ^ー ゲ ^ン抗 体 産 生^に 関す^る研究

金

沢

大 学 医学 部 公 衆 衛

生

学 講座 く

主

任^こ岡

田

晃教 掛

長 岡 匡

く平 成¹年³

月

^{1 1}

日

受 付I

4

8 9

珪 肺 症

は

， 肺^に生

じ た

線 維 増 殖 性 変 化

の

疾 病

で あ る が

，

そ

の

主

体

は

^コ

ラ

^ー

ゲ

ン の増生

で

あ

る

． 本 研究

^{で は}

， 珪 肺 症 患者 血 清 中

の

抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗体^につい

て

検 討

し

，

ま た

免 疫

グ

^ロ

ブ リ

^ン

お よ び

珪 肺 症

で よ

く 認

め ら れ る

各種 自

己

抗 体

で

あ

る

抗ⁿ

D N A

抗 体， 抗核 抗 体 く^{a nt}

i

⁻n u C

l

e a ra nt

ib

o

d i

e s，

A N A

l，

リ ウ

マ

トイ ド

因

子

く^r

h

e u m ato

i d f

a cto r，

R F

l^， 免 疫複 合体 く

i

m m u n e c o mp

l

e x ，

l C

l

を

測 定

し

， 抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン 抗体

と の

関 連 性

に

つ い

て

検 討

し た

^．

さ ら

^に血 清pr o c o

ll

age n

III

pep t

id

eく

P III P

I

と

の関連^{に つ い}

て も

考 察

を

行っ

た

^． 珪 肺 症 患 者

1 3 4

名

お よ び

健 常 者

4 0

名

の

血 清

を

用^い

て

， 抗^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体

を

e n zy^m e^．

ii

n

k

e

d i

m m 。n 。S 。r

b

e nt a s s ayく

^{E L I S A}

l ^に

よ り

測 定

し た

^． 珪 肺 癌 患者 血 清 中

の

抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体 価

は

， 抗^ヒ

ト I

型^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体， 抗^ヒ

川I

型^コ

ラ

^ー ゲ^ン抗 体

が

対 照 群^に

比

^べ

て

有 意^に高値

で

あ^っ

た

く

P

く

0

．

0

伸^．

し か し

抗

ウ

^シ

工

型^コ

ラ

^ー ゲ^ン抗 体， 抗^ヒ

トI V

型コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗体

に は

， 両 群 間

に

差

は

認

め ら れ な か

^っ

た

^． 珪 肺 症 患者

の

抗コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗体 陽 性 率

は

， 抗^ヒ

ト 工

型^コ

ラ

^ー ゲ^ン抗 体

が3 4

^t

3

％， 抗^ヒ

ト m

型^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体

が 3 5

．

1

％

と

高 率

で あ

^っ

た

の に対

し

， 抗

ウ

^シ

工

型コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗体

は1 2

^．

7

％I 抗^ヒ

ト工Y

型^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体

は 8

^．

2

％

と

低 率

で

あっ

た

．

ま た

各 抗^コ

ラ

^ー ゲ^ン抗体 価

を

塵 肺 胸 部

X

線 分 類

に よ る

病 型 別^に比 較

し た が

差

は

認

め ら れ

ず， 粉 塵 作 業 年 数 別

で

検 討

し た と

^こ

ろ

， 抗^ヒ

ト工V

型^コ

ラ

^ー ゲン抗体

は

， 粉 塵 作 業 年数

が

増

す と と も

^に高値

を 示 す

傾 向

が

認

め ら れ た が

， 抗^ヒ

ト ト

型コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体， 抗

ウ

シ

工

型^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体， 抗^ヒ

川l

型^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体

で は そ の よ

う

な

傾 向

は

認

め ら れ な か

^っ

た

^■ こ

れ ら

の こ

と よ り

， 抗コ

ラ

^ー ゲン抗 体

は

， 珪 肺 症

^{の よ り}

早 期^の段 階

か ら

出現

す る

^こ

と が 示

唆

さ れ た

^■

ま た

免 疫

グ

^ロ

ブ リ

^ン

は

， 珪 肺症 患 者

で は I

g

G

，

I

g

A

_，

I

_g

E が

対 照 群^に

比

較

し て

有 意に高値

で

あ^っ

た

^．

ま た I

g

G と

抗^ヒ

ト I

型^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体

と の

間に

正

の有 意

な

相 関 関 係

を

認

め た

^． 珪 肺 症 患 者^の自

己

抗 体 陽 性 率

は

， 抗ⁿ

D N A

抗 体

1 1

⁻

2

％，

A N A 1 3

^．

4

％，

R F l O

．

4

％，

I C 9

．

0

％

と

対 照 群^に

比

較

し て

高 率^で

あ

っ

た

^一 珪 肺 症 患 者^の抗n

D N A

抗 体 ％

．^{性 者}

は

， 陰 性者^に比 較

し

抗^ヒ

ト 工

型コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗体

は

低 値

を 示 し た が

，

A N A

陽 性 者

は

， 陰 性 者^に

比

較

し

抗

ヒ

ト 工

型^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体

は

高 値

を 示 し た

^，

ま た R F

陽 性者

も

， 陰 性 者^に

比

較

し

各 抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体

は

高 値

の

傾 向

を 示 し

，

1 C

陽性 者

も

^， 陰 性 者^に比 較

し

抗

ウ

^シ

1 型

^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体

は

高値

を示 し た

^{． 一} 方

珪

肺 症 患 者

で は

対 照 群^に

比

較

し て

， 血 清

P lll P は

有 意^に高 値

を 示 し た

く

P

く

0

一吋^一

し

^か

し

抗^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体

と

の関連 性

は

認

め ら れ な

^かっ

た

． 以

上

の こ

と よ り

珪 肺 症^{に お い}

て

抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体

は

， 免疫

グ

^ロ

ブ リ

^ン

お よ び

各 種 自

己

抗 体

と

関 連

し て

^い

る

こ

と が 示

唆

さ れ

， 体 液 性 免疫^の克進に

よ る

免疫 異 常

も

抗コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体^の

産

生^に関 与

し て

い

る と

考

え ら れ た

^． 抗^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体

を

測 定

す る

^こ

と は

^， 珪 肺 症に お

け る

早 期^の肺

の線 推 化

お よ び

自

己

免疫 異 常^の発

現

^に関

す る

指 標

と し て

有 意 義^で

あ る と

考

え ら れ た

⁻

Ke

y

^{w o r}ds silic o sis

， a n

t

i⁻C Olla

g

^{e n a n}

t

ib odi^{e s}， e n Z

y

^{m e−}1ink^ed i^{m m} un o s o r⁻

be n

t

a s s a

y

く^{E LI S A}l^{， a u}

^t

^{O a n}

^t

^ibod

^y

^，

^p

^{r O C Olla}

^g

^{e n III}

^p

^e

^{p t}

^ide

A bbr e via

t

io n s こ A N A ， a n

t

i⁻n u Cle a r a n

t

ibodie s

三

A N O V A ， a n al

_y

sis of v a ria n c e

三

B S A，

bo vin e s e r u m alb um in

i

B I ， bo vin e

t y p

^e I c olla

g

^{e n}

三

E D T A ， e

t

h

_y

le n ed ia min e

t

e

t

r a⁻a C e

t

ic a cid

_三

E LI S A

， e n Z

y

^{m e−}1inked im m u n o s o rbe n

t

a s s a

y 三

F I T C ， Flu o r e s c ein is o

t

hio c

y

^{a n a}

t

e

ニ

H R P_， ho r s e r ad ish

_p

e r o x

y

da s e

三

H I_， hu m a n

t y p

^e I ^{c o}lla

g

^{e n}

三

H IIl， h u m a n

t y p

^e III

4 90

珪肺 症

は

， 仁遊 離

け

^い酸

じ ん 又 は

遊 離

け

^い酸 く

S i O

2ニ シ

リ

利

を

含

む

粉

じ ん を

吸

入 す る

^こ

と に よ

っ

て

肺^に生

じ た

線 推 増殖 性変 化^の疾 病J

と

定 義

さ れ

^{1 I}， 塵 肺 症^の

な か で は

最

も

多

く み ら れ か

^つ

ま た

， 最

も

線 維 化^の強^い 疾 患

で あ る

^． 珪 肺 症

で は

多 量^{の シ}

リ カ を

長 期 間

吸 入 す る

^こ

と

^に

よ り

肺^の線 推 化

が

進 行

し

， つ い に

は

珪 肺 結 節

を

形成

す る

に

至 る が

， 粉 塵 暴 貢

が や ん だ

後

も

病 変

は

徐^{々 に}拡 大

す る

慢 性

で か

^つ進 行 性の疾 患

で も

あ

り

²¹，

珪 肺 症^の線 推 増殖 性 病 変

の

主 体

は

^コ

ラ

^ー ゲ^ン

の

増 生

で あ る

こ

と も

知

ら れ て

^い

る

^{3 I． 一} 方， 肝 臓^に線 維 化

を

来

す

疾 患

で

あ

る

肝 硬 変^， 慢 性持 続 性 肝 炎

な どで は

， 抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体

が

検 出

さ れ

^4I，

ま た

肺^に線 推 化

を き た す

特発 性 肺 線 推 症

で も

抗コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体^の存 在

が

認

め ら れ て

^い

る

^均．

し

^か

し

， 珪 肺 症^{に お}

け る

抗^コ

ラ

^ー ゲ^ン抗 体 検 出^{に つ い}

て の

報告

は

未

だ な く

t

そ

こ

で

本 研 究

で は

， 珪 肺 症 患 者 血 清 中

の

抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体

を

， 酵 素 抗 体 免 疫 測 定 法 くe n zy^m e^．

1i

n

k

e

d i

m m u n o s o r

b

e nt a s s ay，

E L I S A

1^{6 ，}

に て

測 定

し

，珪 肺 症

の

発 症，進 展^に関

す る そ

の意 義t 役 割

を

検 討

す る

^こ

と と し た

^．

ま た

， 珪 肺 症^に

は

肺 結 核^刀あ

る

^い

は

膠 原病^{恥1 11}

が し

ば

し

ば 合 併

す る

こ

と が

知

ら れ て お り

， 免疫 異常

の

存 在

も 示

唆

さ れ て

^も1

る

^{． こ}

の

^こ

と か ら も

， 珪 肺 症

の

発症

お よ び

進 展^に

は

何

ら か の

免 疫 異 常^， 特^に自

己

免 疫 機 序

が

重 要

な

役 割

を

果

た し て

^い

る

こ

と が

推 測

さ れ る

． 今 回， 免 疫 グ^ロ

ブ

リ

^{ン1 2ト1 5 1ぉ}

よ び

珪 肺 症

で よ く

認

め ら れ る

各 種 自

己

抗 体

で

あ

る

抗

D N A

抗 体^{川1咽1 乃}，抗 核 抗 体^{1 の−公I，}

^{リ ウ}

^マ

^{ト イ} ド

因

子

^{叫 榊一珊}， 免疫 複 合 体^{1 8 I}

な ど も

測 定

し

， 抗^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体

と の

関 連性^{に つ い}

て

検 討

し た

^．

さ ら

^に肝 臓^お

よ び

肺

の

線維化

の

早 期の指 標

と な る

血 清

プ

^{ロ コ}

ラ

^ー

ゲ

ン

工 II

^ペ

プ チ ド

くp^{r o c o}

ll

ag^{e n}

III

_pep t

id

e，

P III P

J^{2 7，}

と

の関 連^{に つ い}

て も

考察

を

行っ

た

．

対 象

お よ び

方 法

工

． 対 象

者 山 県 束 部 在 住^の男性 粉塵 作 業 出 稼 ぎ 者 く

9 0

％ 以

上 が

障 道 建 設勢

^で

^{珪 肺 症}

^と

^{診 断}

^{さ れ て}

^い

る も の 1 3 4

名

を

対 象

と し た

． 年 齢

^{は 5 0}

^旬

^{6 9}

歳 く平 均 年 齢

6 0

^．

2

歳1

で

粉 塵作 業 年 数

は

，

1

^へ

旬0

年 く平 均

1 7

．

2

斡

で

あ^っ

た

．塵 肺 法

で

定

め ら れ た

胸 部

X

線 病

型

分 類^の内訳

は

，

0 型1 1

名 く

8

^．

2

％1，

1

型

63

名 く

4 7

．

0

％ナ，

2

型

3 7

名 く

2 7

−

6

％1，

3 型 4

名 は^．

0

％L

4

型

1 9

名 く

1 4

^．

2

％1 ^で

あ

っ

た

^． 血 清

は

，

採 血 後

そ の 日 の

う

ち

に遠 心 分 離

し

， 測 定

ま で

⁻

8 0

⁰

C で

c olla

g

^{e n}

i

H IV ^{hu m a n}

t y p

^e IV c o11a

g

^{e n}

芸

I C，

凍 結 保 存

し た

．

ま た

健 康診 断受 診者

の う ち

， 健 常

で

粉 塵 作 業 歴の

な

い男 性

4 0

名

を

対 照 群

と し た

^■ 対

照

群^の血 清

も 上

記

と

同 様^に保 存

し 用

^い

た

^． 対 照 群

の

年 齢

は

，

4 8

^旬

7 1

歳 坪 均 年 齢

5 8

^．

1

歳ナ^で

あ

っ

た

^t

な

お， 両 群

と も

肝 機 能 異 常者

は

除 外

し た

．

工 工

^{． コ}

ラ

^ー

ゲ

^ン

抗 原

と し て

^ヒ

ト I

型^コ

ラ

^ー

ゲ

^ンく

H

u m a n t y pe

I

C O

ll

age n ，

H

り，

ウ

^シ

I 型

^コ

ラ

^ー ゲ^ンく

B

o v

i

n et y p^e

I

C O

ll

ag^{e n ，}

B I

l， ヒ

トIIl

型^コ

ラ

^ー

ゲ

ンく

H

u m a nt y pe

工 H

C O

ll

ag^{e n} ，

H II

D， ヒ

ト工V

型^コ

ラ

^ー

ゲ

ン く

H

u m a n t y pe

I V

c o

ll

age n ，

H IV

l

を

用い

た

^．

H I

く^ヒ

ト

胎 盤 由 来，

N

o．

Y

⁻

1

1，

H 丑

H ^ヒ

ト

胎 盤 由 来，

N

o．

Y

⁻

2

1，

H 王V

く^ヒ

ト

胎 盤 由来，

N

o．

Y

⁻

3

1

は

， 富

士

薬 品

工

業 く高 剛 製，

B 工

く

ウ

シ真 皮 由 来，

N

o．

40 2 3 1

1

は

， コ

ラ ボ

レ イ

テ

ィ

プ

社 く

U 5

^．

A

^．I 製^の

も の を

用^い

た

^．

H I

．

S D S

⁻

ポ リ ア ク リ

^{ル ア}

ミ ド ゲ

^ル電 気 泳 動法 く^{s o}

^di

^{u m}

^d

^o

^d

^{e cy}

^l

^{s u}

^lf

^ate−pO

^l

^{ya c ry}

^l

^a

^{m i d}

^e g^e

l

e

l

e ctr op

h

o r e s

i

s，

S D S

⁻

P

A

G E

I

各^コ

ラ

^ー ゲン

の

純度

^を

確 認

す る た め S D S

^．

P A G E

^劉

を

行^っ

た

^． 各^コ

ラ

^ー

ゲ

ン の

0

^．

1

％ 溶 液

5 0

声

1

_，

0

^．

5 M ト リ

ス

H Cl

く

P H 6

．

8

1

1 0

F^E

l

_，

1 0

％

S D S

く半 井， 京恥

1 0

ノ

バ を チ

^{ュ ー}

ブ

^に採

り

，

10 0

⁰

C で 5

分 間加 熱後，

5 0

％

グ リ

^{セ ロ ー ル} ，

0

^．

0 0 5

％

プ

ロ ム フ ェノ ^ー ル

ブ

ル ^ー

く

^{B P}

研 く和 光^， 大 阪1 溶 液

を そ れ ぞ れ

各

1 0

月

l

添加

し

，

全 量

7 0

_ノ

バ の

う

ち 2 0

_月

1 を

泳 動 用 試 料

と し た

^． ス

ラ ブ

ゲ^ル電 気 泳 動 装 置 く

K S

^．

8 0 0 0 S E

， マ

リ

ソ ル社， 東 刹

^を

用^い，

7

^．

5

％

ア ク リ

^ル

ア ミ ド

^ス

ラ ブ

ゲ^ル

の S D S

⁻

トリ

ス^ーグ

リ

シ ン系^に

て

，

2 0

m

A

で

3

時 間 泳 動

し た

^． 泳動 後，

0

^．

1

％

ク

^{マシ ー}

プ

ル ^ー 色 素 伴 井1⁻

5 0

％

メ タ ノ

^ー ル

．

1 0

％ 酢 酸 水 溶 液^に

て 3 0

分 染 色 後， 水 洗

し

，

5

％メ

タ

ノ ^ー ル^ー

7

^．

5

％酢 酸 溶 液^に

て

脱 色

し た

^． 各^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン

サ

ン

プ

ル

は

還 元 前

と 2

^一

メ

ル

カ プ ト

^エ

タ

ノ ^ー ル 伴 料 ^に

て

還 元 後^に電 気 泳 動

し た

．

N

^． 抗

血

清

ヒ

ト I

型^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン， ヒ

ト工 工 I

型^コ

ラ

^ー

ゲ

ン

を

^マ

ウ

^ス に免 疫^に

し て

得

ら れ た

^{モ ノ}

ク

ロ ^ー

ナ

^ルマ

ウ

ス抗^ヒ

ト工

型^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体， モ ノ

ク

^{ロ ー}

ナ

^ルマ

ウ

ス抗^ヒ

川

浬

コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体 く^いず

れ も

和 歌 山 県立 医科 大 学 第

¹

病

理

学 教 室 大 島 章 教 授

よ り

恵 与

さ れ た

1

お よ び ポ リ ク

ロ ^ー

ナ

^ル抗

ウ

シ

工 型

コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体 く

A B

⁻

1 0 1 0

，

ア ド

バ ン ス社， 東 京1

を

使 用

し た

^．

im m u n e c o m

p

le x

芸

工し 1，in

t

e rle uk in⁻1

_三

ⁿD N A，

n a

t

iv e d e o x

y

^ribo n u cleic a cid

_ニ

O D， O

p t

im al de n si

t y ニ

O P D， 0⁻

p

he n

y

le n ed ia m in e

三

P B S，

p

ho s

p

ha

t

e buffe r ed s alin e

ニ

P S S ，

p

^{r O}

g

^{r e S S}iv e s

y

^s

t

e mic s cle r o sis

i

PIII P，

p

^{r O C O}11a

g

^{e n} HI

珪 肺 症^に

お け る

抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体 産 生^に関

す る

研 究

v

． 杭^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗 体^の測 定

抗コ

ラ

^ー ゲン抗 体

は

，

R

e n n a r

d ら

^{2 9 1}

の

方 法^に

よ り

E L I S A

法^朗

で

測 定

し た

く図 り^．

各^コ

ラ

^ーゲ^ン

を 5

^m

M

酢 酸^に溶 解 軋

⁰

^．

^{0 5 M ト リ}

ス^ー

H C l

緩 衝 液 く

^{P H 7}

^．

⁶

^， 含

0

⁻

1 5 M N

a

C l

，

0

．

0 2

％

N

a

N

J

を

加

え

，

1 0

JL glm

l の

濃度

^に

^{希 釈}

^{し て}

^{抗 原 溶 液}

と し た

^． 抗 原 溶 液

1 0

叫

^l を ポ リ

^ス

チ

^{レ ン マ}

イ ク

^ロ

タ イ タ

^ー

プ

レ ^ー

ト

のy^{n a}te c

h L

a

b

o r ato r

i

e s，

l

n c．

1

m m u

l

o n

l P l

ate s，

V i

rg

i

n

i

a，

U

．

S

．

A

J−

の

各

ウ

^{ェル に} 加

え

，

4

⁰

C で

^一 夜 静 置 後^に p

h

o sp

h

ate

b

u

ff

e r e

d

s

a li

n eく

P B S

J⁻

0

^．

0 5

％

T

w e e n

2 0

く和 鋤 く

^{P B S}

^．

^T

^{w e e n}l

で w

a s

h

e rく

S

e r a

W

a s

h

e r^．

9 6

，

B i

ote c ， 東 剰

を 用

^い洗 浄

C

。 at

i

ⁿg o

f

c o

11

age n く

H I

，

B l

，

H tI

，

H N

l

c o

ll

age n く

1 0

p gノ^m

^l

^l

ⁱ

ⁿ

^O

^．

^{0 5 M T}

^r

ⁱ

^sp

H Cl

⁻

b

u

ff

^{e r}，

P H 7

^．

6

J¹

0

^．

0 2 ％ N

^a

N

3

1 0 0

J¹

1 i

^{n e a c}

h

m

i

c r ot

i

te r p

l

ate w e

ll O

v ern

i

g

h

^{t at}

4 C

w a s

h w i

t

h P B S

−

⁰

^．

^{0 5 ％ T}

^{w e e n}

^{2 0}

^X

³

2 0 0

p

I P B S

⁻

0

^．

0 5 ％ T

^{w e e n}

2 0

JI

l ％ B S A 2t

l r at

37 C

w a s

h

^w

i

t

h P B S

⁻

0

．

0 5 ％ T

w e eⁿ

2 0

x

3 1 0 0

p

I

s e r u m

d il

ute

d l

ニ

5 0

くo r a nt

i

−

s e ru ml ^w

ⁱ

^t

^{h P B S}

⁻

⁰

^．

^{0 5 ％ T}

^{w e e n}

^{2 0}

ノ

3

^m

M E D T A J

^I

o

^．

1 ％ B S A 2 h

^{r at}

3 7 C

w a s

h

wi t

h P B S

⁻

0

．

0 5 ％ T

w e e n

2 0

^X

3 1 0 0

p

l

pe r o x

id

^{a s e c o n}j^ugate

d

go at a nt

i h

u m a n く^{o r m o u s e o r r a}

^{b bi}

^tl

I

g

G

an t

ib

^o

d

y

d il

ute

d l

二

1 0 0 0

^w

i

t

h P B S

⁻

0

^．

0 5 ％ T

^{w e e n}

2 0

1b

r at

3 7 C

w a s

h

w

i

t

h P B S

⁻

0

．

0 5 ％ T

^{w e e n}

2 0

X

3 1 0 0

p

l f

r e s

h l

y pr epa r e

d

su

b

strate

く

O P エ コ

ー

3 0

m

i

n at r o o m te mp^{e r a}tu r e

1 00

ノ^J

1 4 N E

2

S O

4

O D

49 2 m e a S^ur e m e nt

F i

g^．

1

．

T h

e pr o c e

d

u r e o

f E L I S A f

o r

d

et_{e c}t

i

o n o

f

a nt

i

⁻C O

11

age n a nt

ib

o

d i

e s．

4 9 1

し た

． 非 特 異 的

反

応

を

抑

え る

目 的で，

2 0 0

_〆

l の P B S

^，

T

w e e n^，

1

％

b

o v

i

n e s e r u m a

lb

u m

i

n く

B S A

l く

Si

gm a

C h

e m

i

c a

l C

o m p^{a n}y，

S

t．

L

o u

i

s，

U

^．

S

^．

A

1^．

で 2

時 間

ア

^フ

タ

^{ー コ ー}

テ

ィ ング

し た

後 洗 浄

し た

． 前

も

って

5 6

⁰

C

，

3 0

分 間 加 熱^に

よ り

非 働 化

し た

血 清

を P B S

⁻

T

w e e n⁻

3

m

M E D T A

⁻

0

．

1

％

B S A で 5 0

倍^に希 釈

し た も の

，

ま た は

抗 血 清

を プ

^{レ ー}

ト

に加

え

，

3 7

⁰

C で 2

時 間

イ

ン

キ

エペ ^ー

ト

後，

P B S

⁻

T

w e e n

で

洗 浄

し た

^． 次^い

で P B S

⁻

T

w e e n

で 1 0 0 0

倍^に希 釈

し た

^{ペ ル}

オ キ

^シダ^ー

ゼ

標 識

ヤ ギ

抗^ヒ

ト I

g

G

く

N

o．

3 2 0 1

⁻

00 8 1

，

H ぬ L

鎖 ，

C

ap pe

l L

a

b

o_，

U

^．

S

．

A

．1

ま た は

， ペ ル

オ キ

シダ^ー

ゼ

標 識

ヤ

ギ 抗^マ

ウ

^ス

I

_g

G

く

N

o．

6 4 5 0

，

H 皮 L

鎖，

T

ago ，

U 息 A

．1 あ

る

い

は

， ペ ル

オ キ

シダ^ー

ゼ

標 識

ヤ

ギ抗

ウ サ ギ I

g

G

く

N

o．

6 4 0 0

，

H 8

t

L

鎖，

T

ago ，

U

^．

S

^．

A

1．

を

加

え

，

3 r C で 1

時 間 反応

さ せ た

^． 再度

P B S

⁻

T

w e e n

で

洗 浄後， 0⁻p

h

e ny

l

e n e

d i

a m

i

n eく

O P D

l く

S i

g^{m a}

C h

e m

i

c a

l C

o mp an yl ^に

H

2

0

，

を

加

え て

調 整

し た

基 質 溶 液

を

加

え て

， 室温に

て3 0

分間 発 色

さ せ

，

さ ら

^に

4 N H

2

S O

4

を

加

え

反 応

を

停 止

し た

後， a utO m ate

d

m

i

c r op

l

ate p

h

oto m ete r く

M T P

⁻

2 2

，

C

o r o n a 社， 茨 城 1 ^に

て 4 9 2

n m

の

吸 光 度

を

測 定

し た

^．

ま た

， 非 特 異 的 反応

を

除

く た め

， 対 照

と し て

抗 原く^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン1

用

の緩 衝 液

の み で

^{コ ー}

ト し た プ

^レー

ト の ウ

^{ェル に}各 被検 血 清，

ま た は

抗血 清

を

加

え 上

記

と

同様^の操 作

を

施

し た

場 合

の

発 色 値

を プ ラ

ン

タ

値

と し

， 抗 原

を

^{コ ー}

ト し た

場 合

の

発 色 債

か ら ブ ラ

^ン

ク

値

を

差

し

引^い

た

値

を

抗^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体 価

と

し た

^．

Vl

．

イ

^{ン ヒ}

ビ

シ_ョン試 験

抗 血 清^に， あ

ら

か

じ め H I

，

B I

，

m I

L

H I V を

加

え 3 7

⁰

C で 3 0

分 間 反 応

さ せ た

後，

上

述

し た E L I S A

法^に

て

同様

に

測 定

し た

．

ま た

抗^コ

ラ

^ー

ゲ

ン抗 体 価^の高^い珪 肺 症 患者 血 清

2

検 体に つ い

て

同様

の イ

^{ン ヒ}

ビ

ショ ン試 験

を

行^い抗^コ

ラ

^ー

ゲ

^ン抗体の特 異 性

を

検 討

し た

^．

VII

^． 抗rL

D N A

くn at

i

v e

D N A

ナ 抗体^の検 出

蛍光 抗 体 間 接 法

で あ る

^{フ ル}

オ

^ロ n

D N A

te stく

^{M B L}

社， 名 古屋1

を 用

^い

た

．

す な わ ち

，

C

^r

i

t

h idi

^a

l

u c

ili

a e

を 塗

抹

し た

ス

ラ イ ド グ ラ

ス に

血

清 く

5

倍

お よ び 1 0

倍 希 釈1

を

滴 下

し

， 抗 原 抗 体 反 応

を

行^い ， 二 次 抗 体 く

F I T C

標 識 抗^ヒ

ト イ

^{ム ノ}グロ

ブ リ

ン1

を

滴 下

し

再 度 抗 原 抗 体 反 応

を

行^い， 直

ち

^に蛍 光 顕微 鏡^{の 4}

0 0

倍^で鏡 検

し た

^．

5

倍 希 釈 血 清^に

て K i

n etop

l

a st に著

し

^い蛍 光

が

認

め ら れ

pe r

i

_p

h

e r

a l

状^に染色

さ れ る も

の

を

陽 性

と し

p

^e

p t

ide

ニ

R A ， rh e u m a

t

oid a r

t

h^ri

_t

is

ニ

R F， rhe u m a

t

oid fa c

t

o r

i

S D S， S Od iu m dode c

y

ls ulfa

t

e⁻

p

^ol

_y

a c r

y

la mid^e

g

^el ele c

t

r o

p

ho r e sis

i

S L E， S

y

^S

t

e mic lu

p

^{u s e r}

y t

he m a

t

o s u s

i

^{S S}D N A ， Sin

g

le S

t

r a nded de ox

y

^ribo n u cleic a cid