Title
Studies on Microbial Formation and Degradation of ε-Poly-L-
lysine( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
鬼頭, 光暁
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(工学) 甲第202号
Issue Date
2003-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/1923
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏名(本籍) 学 位 の 種 類 学位記号番号 学位授与年月日 専 攻 学位論文題 目 鬼 頭 光 暁 (愛知県) 博 士(工学) 甲 第 202 号 平成15年 3月25日 物質工学専攻 Studie$On Micrdbi&lFo円弧tion鮎Id 鮎訂d鵬i皿Ofど-Poly-L-1ysine (微生物によるど-ポリートリジンの合成と分解に関する研究 学位論文審査委貝 (主査) 教 授 長 澤 透 (副査) 教 授 西 川 一 八 教 授 北 助教授 吉 田 豊 和
論文内容の要旨
e-Poly-L-1ysineは放線菌Str印tOnU,CeS albulusが生産する強塩基性0 ノ酸である｡本物質は抗菌活性を示し､詳細な安全性の評価の後､食品備 用されるようになった｡現在､C-pOly-L-1ysineはS.albulusを用いてコ いるが､未だその価格が高いことが欠点である｡安価な大量供給が可能に 解性の機能性ポリマーとしての新たな用途開発が期待されている｡e-Poly一 産性向上には､まずその生合成､生分解機構の解明が必須であるが､こか 素､遺伝子レベルでの研究報告がないのが現状であった｡本申請者はe-pOl 生合成､生分解の機構を明らかにする一ことを目的に本研究に着手した｡ 本申請者は､まずS.albulusが e-pOly-L-1ysineの合成活性だけで】 poly-L-1ysine分解活性を示すことを見出した｡培地のpHが酸性条件下｢ 1ysineを生産するが､中性領域では分解酵素活性が顕著となり､e-pOly-は認められない｡このe-pOly-L-1ysine分解酵素の実体を明らかにするたbe みられた｡本分解酵素は膜に強固に結合していたため､チオシアン酸ソー率的な可顔化法が見出された｡次に､カラムクロマトグラフィを用いて卑
が調製された｡精製酵素は54kDaの同一サブユニットから成り､e-pOly-存在に相関性があり､C-pOly-L-1ysine生産菌は､自らが生産した抗菌物質 1ysineに対する自己防御のために､本分解酵素を細胞表層に有しているとそ￠ 義が考察された｡またe-pOly-L-1ysine分解活牲を指標に､新規c-POly-L-1ysi を探索する新しいスクリーニング方法が考案された｡これらの成果は､｢第1 べられている｡ e-PolyTL-1ysine分解酵素遺伝子のクロ｢ニングと､一次構造解析が行われプ はぎ･COe封coJorA3の推定メタロペプチダーゼと70%の相同性を示し､本酵覇 関与するアミノペプチダーゼであることが明らかにされた｡またe-pOly-L-1ysi 素遺伝子の近傍領域の解析が行われ､その近傍領域に6つの0肝が明らかにさ らの遺伝子のc-pOly-L-1ysineの生合成との関与について解析が行われた｡こオ は､｢第2章｣に述べられている｡ 次に､S･albulusにおけるe-pOly-L-1ysineの生合成が詳細に検討された｡ を用いた反応では､㌻pOly-L-1ysinel合成の前駆体としてL-1ysineが､またコ 源としてグルコースが必須であることが確認された｡また膜画分にATPとL-1y えることで､C-pOlyl■-1ysineが生成されることが明らかにされた｡C-Poly-L一 生成過程において､5残基程度のレ1ysineオリゴマーが検出された｡このオリ プライマーとなり､C-pOly-レ1ysineへと伸長反応が進行する生合成機構が提頚 これらの研究は進行中で佳境に入ってため｢Appendix｣に記されている｡, さらに5･8肋血5とは別途に､新たに自然界から㌻pOly-L-1ysine耐性 ChrYSeObacteTium sp･OJ7およびSphingobacterium multiYOrum OJlOが分離さ らの耐性菌の持つC-pOlyrL-1ysine分解酵素についても検討が加えられた｡両再 製単離され､酵素化学的諸性質が明らかにされた｡OJ7株の酵素はc-pOly-L-1y亡 ンド型に､OJlO株の酵素はエキソ型に分解するアミノペプチダーゼであること にされた｡両株の高濃度c-pOlyrL-1ysine耐性がこれらの分解酵素と密接に関ち ことが結論づけられた｡これらの成果は､｢第3章｣に報告されている｡
論文審査結果の要旨
微生物が生産するE-pOly-L-1ysineの発見は20年余り前になる｡その抗菌再性から食品保存剤としての応用開発が行われ､現在､放線卑Str印tO町Ceざ
aル いた工業生産が行われている｡食品保存剤e-pOiy-レ1ysineは国内で汎用されモ ノ一 旦ヽ⊂ニIヽ■ Jゝ レヽ -℡ _} ll_L ノゝ血l:与司ト_′まノh土臭チロコ J ⊥人 J■ __■t､す ､_ 一｡h L ▼ J_♪与,nn ′l_ 一_産するが､中性p甘領域ではe-pOly-L-1ysineを生産せず､顕著なEFpOly-酵素活性を示した｡このe-pOlyFレ1ysine分解酵素の実体を明らかにすぞ 試みられた｡本酵素は膜に強固に結合していたが､チオシアン酸ソーダ壱 法が見出された｡可溶化後､カラムクロヰトグラフイにより本酵素は単一 れた｡本酵素は54kDa.のサブユニットから成る｡本分解酵素はe-pOly-L-1y のL-1ysineを1分子ずつ遊離するエキソ型の分解様式を示した｡酵素活十 ンをコファクタ→とすることが明らかにされた｡ (2)各種放線菌における膜結合性のe-pOly-L-1ysine分解酵素活性の分布 5tr印tO町Ce5 V山冨山jaeIFO12827､Str印ね町Ce5･.月OUr5eゴIFO15452 が悍 成することが見出された｡膜結合型のe-pOly-L-1ysine分解酵素を有する壱 e-pOly-レ1ysine生産活性を示した｡即ち､E-pOly-L-1ysine生産活性と薫 存在に相関性があり､e-pOly-L-1ysine生産菌は､自らが生産した抗阻 1ysineに対する自己防御のために､本分解酵素を細胞表層に有していると 義が考察された｡また8rpOly-レ1ysine分解活性を指標に､積極的に新規e-p一 生産菌を探索する新しいスクリーニング方法が提案された｡ (3)e-Poly-Lplysine分解酵素遺伝子のクローニングと､山次構造解析カミ albulusのc-pOly-レ1ysine分解酵素はS.coelicolor A3の推定メタロー 7鴫の相同性を示し､一次構造中に亜鉛結合モチーフが存在することからtオ 関与するアミノペプチダーゼであることが明らかにされた｡また5.aJ血J レ1ysine分解酵素遺伝子の近傍簡域の解析が行われ､その近傍領域に6つ･ かにされた｡これらの遺伝子のE-pOly-L-1ysineの生合成との関与について た｡ (4)S.albulusによるe-pOlyTL-1ysineの生合成が培養および休止菌体を 検討された｡休止菌体を用いた反応では､C-pOly-L-1ysine合成の前駆体とt が必須であり､またエネルギー源とtしてグルコースの添加が必須であるこ た｡またS.albulusの膜画分にATPとL-1ysineを加えることでie-pOl･ 生成されることが明らかにされた｡またこのE-pOly-L-1ysineの生合成過毒 残基程度からなるL-1ysineオリゴマーが検出された｡このオリゴマーがフ り､C-pOly七1ysineLへと伸長反応が進行する生合成機構が提案されたこ (5)S.albulus とは別途に､新たに自然界からE-POly-Lqlysine 面 αrγ5eO占acterj皿Sp.OJ7および伽ム血卯ムacter血皿用UJtjyoru皿OJlOが曇 らの耐性菌の持つE-POly-L-1ysine分解酵素についても検討が加えられた｡ 製単離され､酵素化学的諸性質が明らかにされた｡OJ7株の酵素はe一口｡1v-】
梼の全容解明に迫る状況となってきた｡これらの基礎研究の成果は､今後､E-pOly-L-1ysine生産性の増強を図る応用研究に活用でき､将来的に本学位論文のバイオインダス トリーへの貢献度は極めて大きいと思われる｡
