赤 球系幹細胞 分化増殖調 節機序 刺 激 細胞 ト よ

金沢大 学十 全 医学 会稚 誌 第9 6巻 第4号 6 9 3 ⁻7 0 5 く1 98 71

P h_{y t}^o he m agglutinin 刺激^丁細 胞^{サ ブセ ッ} トによる 赤^血球 系 幹 細 胞^の 分 化 増 殖 調節機序

一 先 天 性 赤芽 球療^{に お け る}検^{討 一}

金沢大 学 医学 部^小児 科 学講 座 く主 任^二谷口 昂 教授1

堀 田 成 紀

く昭和^{6 2}年⁶ 月2 2日受 付¹

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先天性 赤 芽 球 磨 く^{c o n}ge nital hy popla stic a n e mia，C H Al^にお け る赤血 球造 血 障 害の機序を明ら^か にす る為， まず正常 末槍 血 赤血球 系 幹 細胞 くe ry thr oid b^{u r st−}fo rming ^{u n}its， B F U^．El 調節^にお け る非 自 己ph_{y t}ohe m ag glutinin くP H Al 刺 激丁細胞サ ブセ ット の役 割を調^べ， さ らにC H A 各stage で の末棺 血 丁細胞サ ブセ ット と対比 し た^． 非 付着 細 胞， T 細胞， T 4^＋細 胞お よ び T 8^＋細 胞を 1^．0％P H A 存 在 下で 2 0 時 間培 養し， 各 分画の末棺 血B F U⁻E ^への作用 を検 討し た． ま た各培 養 上 帯 中の赤血 球系 幹 細 胞 刺激 活 性 Cbu r st⁻pr O mOtingfa cto r，B P Fl の有 無に^{つ い}て も検 討し た． 正常 宋檎血 P H A 刺 激丁細胞は B F U⁻E 増 加 作用 を示 し， この作用 は T 細 胞 分 画 中の T 4^＋細 胞が主役であった^． T 細胞^およ び T 4^＋細 胞培 養上清 中

には B P F が認め ら れ，P H A 刺 激T 4^＋細胞が B P F 産生 を介し て B F U⁻E 増 加 作 用を 示 す と考え ら れ た． こ の B P F は， コ ロ ニ ^ー 数の増 加のみ な らず1個の^{コ ロ ニ ー} 当り の細 胞 数の増 加^およ び^{ヘ モ}グ^ロ ビン合 成 促 進 作用 も有し て^いた^． a ctiv e stage 4 例， tr a n Sfusio n⁻depe nde nt _stage 2例のC H A で同様の検 討を行っ

た が，P H A 刺 激T 4^十細 胞^の B P F 産 生 能^に障害が見ら れ た． a ctiv e stag^e 4例はステ^ロイ ド剤に よって完 全寛解^{と なった が， 4}例 中2例で P H A 刺 激丁細 胞 ある^いは T 4^＋細 胞は B F U⁻E を増 加さ せ た． ま た 4 例 全例で培養上清 中^にB P F 活 性が見^い出さ れ， B P F 産 生 能は 回復し^{て い}た^． す な わ ち， C H A ではa ctiv e Stage で T 4^＋細 胞^のB P F 産 生 障 害があり， これ が赤 血球 造 血 障害の ^一因と考え ら れ た． し か し，血 液 学 的 完全 寛解後も末 棺血 B F U⁻E 数が低値であった^こと， 正常T 4^＋細 胞の添 加にて も形 成さ れ る^{コ ロ ニ ー} 数が 低値で あった^こと， か ら完全 寛 解後も幹 細胞 自体^の内的 障 害 くB P F 反応 性低 下1 が残存して^いる可能 性も 示唆さ れ た^．

Key ^{w or}ds e ry thr oid burst⁻fo r ming ^{u n}its_，bu r st⁻p^{r O m O}tingfa cto r_，C O ng^{e n}ital h y p^opla stic a n e m ia，P H A ^．stim ul ated T 4^＋ c ell

先天性赤 芽球 療 くc o nge nital hy popla stic a n e mia，

C H Al は乳 幼 児期 発 症^の赤 血球 系のみ の低 形 成を特 徴 と す る疾 患であ る^り21． in vitr o コ ロ ニ ^ー 法^の進 法^で，

赤血球 造血^{の メ}カ^ニ ズム の解 明や種々 の疾 患にお け る 造血 異常の病 態^の解 明が可 能^にな^って来ている^．C H A

で の赤血球 造 血障 害の機 序^に関し て も多くの報 告が見 ら れ る^{3ト1 21}．し か し，その成 因に関して依 然不 明の点が 多く残さ れ て^いる． 自己骨 髄 赤血球 系 幹細 胞^の増殖を

抑 制す る細 胞 障 害性リ^{ン パ}球の存 在が， Hoffm a n ら^3I や S^teinbe rg ら^けによっ て報 告さ れ^{て い}る が， この説 を否 定す る報 告も見ら れ る^5糊． ま た骨 髄 幹細 胞の エリ スロ ポ^エチ^{ン へ}の反応 性が低下 し て^いる為， 幹 細 胞か ら前 赤 芽 球^{へ の}分 化障 害が起^っている^{7ト 川}， との報 告 も見ら れ，C H A は成 因の上 で異 質性 くbete r oge n eit yl

の多^い疾 患群である と考え ら れ る．

一方， 正常^の赤 血球 造 血で は， その前駆細 胞^が増殖 B F U⁻E ， e ry thr oid b u r st⁻fo r ming ^{u n}its三B P F_，bu r st⁻p^{r O m O}ting fa cto rニC H A _， C O ng^{e n}i_tal h_{y p}opla stic a n e miaニE_po_， e ry thr op^oietin三N A T ⁻， n O n ad he r e nt T ⁻depleted_三P H A ， ph_{y t}o⁻

he m ag glutininニP H A⁻T C M ， P H A ⁻Stim ulated T⁻C ell c o nditio n ed m ediu m 三P H A⁻T 4 C M _，

分化す る 上 で， エリ^スロ ポ^エチン およ び赤血球 系 幹細 胞 増 殖 刺激 因子 くbu r st⁻pr Om Oting fa cto r， B P Fl が 必 須であ り， 末 楷 血 細 胞 群の中で は T 細 胞^{川−1 7}や単 球^{1 8ト2い}が B P F 産 生細 胞^の主役と考え ら れ て^いる．

今回， レク チ^ン刺 激末 梢血丁細胞サ ブセ ット^によ る 末 棉血赤 血 球 系 幹 細 胞 くe ry thr oi d bu r st⁻fo rmi ng u nits，B F U⁻EI 調 節機 構を明ら かにし， 赤血球 系低 形 成を特 徴と す る C H A 6 例に つ いて同 様の検 討を行

い_， 新しい知見を得た の で報 告す る．

ま た， C B A 末 楷 血リ^{ン パ}球の正常 骨 髄 赤血球 系幹 細 胞の障害^の有 無^{に つ い}て も検 討を加え た．

対 象お よ び方法

工^． 対 象

D ia m o nd ら^りの診 断基 準を満た す 6 例の C H A を対 象と した． 表1 は診 断 時の末 棉 血お よ び骨 髄 所見， 臨 床経 過を 示 し た も の である^． 全 例 末梢 血で は白血 球 減 少^およ び血小板 減 少を伴わ な^い高 度の貧血を認め， 骨

髄 像で は著しい赤 芽球 低 形 成を 示 し て^いた． 症例4 お よ び 6 は治療 開 始 前に， 症 例2 およ び 5 は 2 回の濃 厚 赤 血 球 輸 注後^に検 討し たこ ^これ ら4 症 例^はいずれ もス テ^ロイ ド 反応 例^で， 1 ケ月^から 2 ケ月の治 療で完全寛 解と な り以後 除々に ステ^ロイ ド剤は減量 さ れ， 約6 ケ 月か ら 1 2 ケ月で中止 さ れ た． 第2 回目の検 討で は，全 例が^ステ^ロイ ド剤や輸血 を必 要と し な く な^って^いた．

症例1 お よ び 3 はステ^ロイ ド不応 例^で， 月¹ 回^の濃 厚 赤 血球 輸 注を繰返し て^いた．

工工． T 細 胞^の分離

C H A 6例と 正常 対 照と し て健 康 成人末 柵血を^ヘパ リ^ン加 採血し，リ^ン酸 緩 衝 生理食 塩 水で 2 倍^に希釈艶 F ic oll⁻H y paqu e くLym phopr ep， N yega a rd 8z Co．，

Oslo，No r w aylを 用^いた 比 重遠心 法^{に て}単核 細 胞を採

取し た． 単 核 細 胞は10％非 働 化ウシ胎 児血清 くfetal bo vin e s eru m ，F B S．M ．A^．B iop^{r o}du cts

，W alke r s ville，

M Dl を含む R P M I 1 6 4 0培 地 くG I B C O，N Yl ^{に 1 X} l O⁶ノ^ml の濃度^に浮 遊し， プ ラスチック 皿 を用^いて付着

Tablel． Labo r ato ry data at di^ag^{n o s}is a nd clinic al c o u r s e s−

Patie nt 1．く^R．U1^． 2．くK．I．1 3．くT．GI． 4．くM ．N1． 5く．T ．M 1^． 6．ロ^．Nl^．

Ag^{e a}t diag^{n o s}is 1 1 m o 3 m o 3 m o 6 m o 6 m o 8 m o

Peri_phe r al blo od

1 6 2 8 3 1 0 2 1 5 8 1 5 9 2 0 2

Red blo od c e11s

く^Xl Oソ皿丘I He m oglobin

くgノdり W h ite blo od c ells

くノ^皿丘I P latelets

く^X1 0ソm丘I

4 ^．7 2^．8 3^．6 4^．4 3^．9 4^．2

7 3 0 0 3 60 0 3 6 0 0 5 7 0 0 8 3 0 0 7 4 0 0

3 0．4 2 2．4 2 5．6 4 4 ^．1 4 3^．8 1 5^．0 Retl C ulo cy te s

く％I 0 0^．5 0 ^．5 0 0 0．1

Bo n e m a r r o w

1^．6 4^．0 2^．0 0．2 1．4 5．6

Ery thr obla sts く卿

GノE r atio 4 8^．0 1 1．3 2 3．3 16 7．0 5 5．0 1 3^．0

T he r ap y pr ed pr ed p^{r e}d _pr ed pr ed pr ed

a ndr a ndr

Pr ogn o sis Tr a n s r emi s sio n Tr a n s r e mis sio n r e mi^{s s}io n r e mis sio n

Age at tim e of study 1 2_yr 4r n o，3yr 1 6yr 6r n o，3y^r 7m o，2_yr 8r n o，3yr

GノE ^{r at}io， Gr a n ulo cy teIEry thr oid r atioこ Pr ed，Pr ednis o n eニa ndr，a ndr oge ni Tr a n s，

Tr a n sfu sio n⁻dep^{e n}de nt．

P H A⁻Stim ulated T 4^{＋ −}C ell c o nditio n ed ^m edi^u _町 P H A ⁻T 8 C M ， P H A ⁻Stim ulated T 8^{＋−C e}ll

c o nditio n ed m ediu m ^．

先天性 赤芽 球 療の赤 血 球 系幹 細胞 分 化 増殖 調 節 障 害

細胞の単球を除 去し た 俳 付 着 馴 副^{． T} 細 胞は 1 ^X lO⁷ノml の非 付 着細 胞を^ノイ ラ ミ^ニ ダ^ー ゼ く1 0 uノml_， B^ehring^{w e r}kel 処理羊 赤血球とのE ^ロゼット法を行

い分 離し た^{2 2ナ．} T 細 胞^お よ び 非 付 着 非^丁細 胞 くn o n ad he r e nt T⁻depleted， N A T−1 分画 中の単球の 比率を メ イ ^． ギ^ムザ， かサ フテ^ー ル ^．プ チレ ^ー ト^{． エ} ステ ラ^ー ゼ染色を行^い検 討し た が， いずれ も 4 ％ 以下 で あった．

m^． T 細胞サ ブ^セッ ト^の解 析と 分離

末 梢 血丁細 胞サ ブセットの解 析は， 単 核 細 胞を flu o r e s c ein is oth io cyan ate くFI T Cl 標識^{モ ノ}クロ ^ー

ナ^ル抗体O K T 3， O K T 4， O K T 8 くOrtho D iag^{n o s}tic

S_yste m In c^．， Ra rita n， NJl ^にて標 識し， フロ ^ーサ イ ト メ ト リ^ー くOrtho Spe ctr u mIIり を用^いて算 定し た^{2 3I．}

T 4^＋およ び T 8^＋細 胞の分 離は， 末 梢血 丁細 胞5 X lO⁶ノmlにO K T 8 あ る^い は O E T 4 モ ノク^ロ ナ ^{ー ル}抗

体 く1 ^{ニ 1}仁嘲 を加え室 温^{3 0} 分 放 置 後 補 体 く^{Lo w −} To x⁻H r ab b it c o m ple m e nt， Ceda rla n e， O^{nta r}io，

Ca n adalを 2 5％濃 度^に加え， さ らに3 r C 4 5 分 間イ^ン

ク^{ベ ー} ト の の ち に R P M 王1 6 40 培 地で 2 回洗 浄し た^{2 4J2 51．}O K T 8 処理 丁細 胞分 画を T 4^＋細 胞，O K T 4 処 理 丁細 胞を T 8^十細 胞と し て 以下^の検 索^に使用 し た^．

フロ ^ー サ イ ト メ ト リ^ー によ る解析で は， 前 者は 7 8％か ら 8 5％のO K T 4 陽 性 細 胞 を有し後 者は 8 2％か ら 86％の O K T 8 陽性 細 胞を有し て^いた．

IV ． P H A ^による T細 胞， T 4^＋細 胞お よ ぴ T 8^＋細 胞 刺 激

5 ^X lO⁶個^の T 細 胞， T 4^十細 胞， T 8^十細 胞を 1 0％ F B S を含む R P M I 1 6⁴0培 地 ^に 浮 遊 し， P H A⁻P くD ifc o，Detr oit_， M Il を最終 濃 度^1．0％^にな る様^に加

え炭酸ガ^ス培養 恒 温 器 く3 7⁰C， 5％C O21 内で2 0時 間 培養し た． 培養 終了後， 多量の R P M 王1 6 4 0 培 地^にて 2

回洗浄し赤 血球 系 幹細 胞 培 養^{で のエ フェ}ク タ^一紙 胞と して用^いた^{． 一}部の実験で は非付 着 細胞を同様に処理 し^エフェク タ^ー細 胞と し た． 0^．1 6％ト リ^{バ ン}プル ^ー に よ る検定では 83％以 上 が生 細胞で あった． ま た各々の

培養上清 くP H A 刺 激丁細 胞 培 養上手乱 P H A⁻T C M ニ P H A 刺 激T4^十細 胞 培 養上浦P H A ⁻T 4 C M 三P H A 刺

激T 8^＋細 胞 培 養^上清， P H A⁻T 8 C Ml も同 様^に回収 し⁻20⁰C で保 存し， 使用の際に自然 融 解し 用^いた^．

V ． 培 養上清^の耐 熱 性

各培 養上清を 56⁰C 3 0 丸1 0 0⁰ClO 分およ び 3 0 分 熱 処理 し 1 0％の濃 度^でB F U ⁻E 培 養 系^に添加し， 熱 処理 後の B P F 活性^の変化を検 討し た．

VI， 赤血球 系幹 細 胞培 養 法

ヒト末 輸 血 赤 血 球 系 幹 細 胞^の培 養は 工s c o v e ら^2別の

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方 法^に準じ て行った． 2．5XlO⁵個^の非 自己 N A T ^．細 胞を B F U ^．E s o u r c e と し て， 2^．O I Ulml の^エ リ^スロポ

エチ^ン CEpo， Co n n a ugh^t S^tep l工I she ep ^{e r}y thr o^． p^oietinl 存 在 下で 0．8％メ チル セ ルロ ^ース 押ishe r

Scie ntific Co．，NJl， 3 0％F B S，10％脱イ オ^ン化ウ^シ 胎 児ア^ルブ ミ^ンくS igm al， 10^，4M 2⁻メルカ プ ト^エタ ノ ^ー ル くS i_gm aI を含ん だ メ チ^{ル セ ル} ロ ^ー ス法に て 行^った．炭 酸ガス培 養恒 温器で 1 4 日間培 養後 倒立 顔微 鏡^にて 1 0 0個 以上 の赤 色か ら貴赤 色の細 胞集 団お よ び 3 個 以上のサ ブコ ロ ニ ^ーから成る細 胞 集 団を B F U⁻E 由来の^{コ ロ ニ ー} と し て算定し た．

エフ ェク タ ^ー細胞は 上記培 養系^に1^．2 5Xl O⁵個の都 合で加え B F U ⁻E ^への影響につ いて検 討し た． 各 培養 上清 く熱 処理後の 上清も含めンは B P F 活性^の有 無を 検 討す る為， 最 終 濃 度1 0％^にな る様^に1^．5 エロノ^ml E_po

と共^に加え た． 湛 合培 養^ではstim ulatio n inde x を下 記の式に基づ^いて算 定し た^． stim ulatio n inde x くS^． 王．1 ^ニ混 合 培 養で の全B F U ⁻E数ノ単 核 細 胞 あるいは N A T⁻ 細胞 単 独でのB F U⁻E 数＋P H A 刺 激非 付 着細 胞 ある^いは T 細胞 単 独での B F U⁻E 数

ま た， 骨 髄 赤 血 球 系 前 駆 細 胞 く^{c o}lo ny^．fo rming u nits ofe ry thr oid，C F U⁻EI の培 養は， 末 檎血 と同様

の方 法で採 取 し た骨 髄 細 胞 く^{2 X}l O⁵1 を C F U ⁻E

s o u r c e と し て Tep pe r m a n ら^{2 71の}血襲 凝 固 法を用^い て行った． エフ ^ェク タ ^ー細 胞を 1 X lO⁵ 偶の割 合で加 え 3 7⁰C 5 ％C O2 下で培 養し 7 日目^{に ヘモ}グロ ビン

く^{べ ン}チ ジンI 染 色を行^い， ベ ンチ ジン陽 性の 8 個 以上 の細 胞 集 団を C F U^．E 由 来^{のコ ロ ニ ー と し て}算 定し た^．

W I． 統 計 学 的 検定

有 意 差^の検 定^には Stude nt の t^一検 定を 用^いて， p く 0^．0 5 を統 計学 的^に有意と し た．

成 績

工． 正常^ヒト未棉^{血 B F U −E の調 節}

1 ^． 非 自己 丁細 胞^の末棺 血B F U⁻E に及ぼ す影響 非 自己 丁細 胞^に各 濃 度 く0 ，0．1％，1^．0％うのP H A を添加し培 養し た後，1^．2 5^X lO⁵個，2．5Xl O⁵個お よ び 5^．O^{X l}O⁵個の T 細 胞を B F U ⁻E 培 養系^に加え， そ の影 響を検 討し た く図 い．T 細胞は P E A 添加の有 無^{に か}

かわ らずB F U ⁻E 形 成を増 加さ せ， さ ら^に添加丁細 胞 数^に比例し て B F U⁻E 増 加 作 用を 示 し た^． 1^．0％P H A

を加え培 養し た場 合^{1．2 5Xl O5}個の T 細胞 添 加で も，

他のP H A 濃 度の場 合^に比し有意^に くp く0．0 21 B F U ⁻ E 形成を増加さ せ た．P H A 渡 度を 2^．0％と し た場 合，

生 細 胞 数^{は 2 0}％以 下^に なった為， 以 下の検 索で は P H A 濃 度1．0％， エフ ユタ タ ^ー細胞 数1．2 5^Xl O⁵ と し