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慢性蕁麻疹患者の血清中の自己反応性 抗二本鎖デオキシリボ核酸 (

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(1)

慢性蕁麻疹患者の血清中の自己反応性

抗二本鎖デオキシリボ核酸 ( double stranded [ds]

DNA) 免疫グロブリン E 抗体価の有意な上昇と

dsDNA による好塩基球の 活性化

に関する研究

日本大学大学院医学研究科博士課程 内科系皮膚科学専攻

畠田 優子 2014 年

指導教員 照井 正

(2)

慢性蕁麻疹患者の血清中の自己反応性

抗二本鎖デオキシリボ核酸 ( double stranded [ds]

DNA) 免疫グロブリン E 抗体価の有意な上昇と

dsDNA による好塩基球の 活性化

に関する研究

日本大学大学院医学研究科博士課程 内科系皮膚科学専攻

畠田 優子 2014 年

指導教員 照井 正

(3)

目次

概 要 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

1

諸 言 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

4

対 照 と 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

7 (1)

患 者 背 景 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

7 (2)

試 薬 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

7 (3)

自 己 反 応 性 抗 体 の 検 出 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

9 (4)

自 己 血 清 皮 内 テ ス ト ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

10 (5)

好 塩 基 球 の 活 性 化 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

10 (6)

統 計 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

14

結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

15 (1)

抗

dsDNA IgE

価 の 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 お よ び ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 で

の 有 意 な 増 加 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

15

(4)

(2)

抗

dsDNA IgE

価 と 、血 清

IgE

値 、罹 患 期 間 、性 別 、自 己 血 清 皮 内 テ ス ト の 結 果 と の 相 関 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

17 (3) dsDNA

は 慢 性 蕁 麻 疹 の 一 部 の 症 例 で 好 塩 基 球 の 活 性 化 を 惹 起 す る

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

18

考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

19

ま と め ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

25

謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

26

引 用 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

41

研 究 業 績 目 録 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

49

(5)

略語

ASST： autologous serum skin test

： 自 己 血 清 皮 内 テ ス ト

BSA： bovine albumin solution

： ウ シ 血 清 由 来 ア ル ブ ミ ン

CaCl

2：

calcium chloride

： 塩 化 カ ル シ ウ ム

DPBS： Dulbecco’s phosphate buffered saline

： ダ ル ベ ッ コ リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水

dsDNA： double stranded DNA： 二 本 鎖 デ オ キ シ リ ボ 核 酸

ELISA： enzyme-linked immunosorbent assay

： 酵 素 免 疫 測 定 法

FACS： fluorescence activated cell sorter

： 自 動 細 胞 解 析 分 離 装 置 FITC：fluorescein isothiocyanate： フ ル オ レ セ イ ン イ ソ チ オ シ ア ネ ー ト

FCS： fetal calf serum

： ウ シ 胎 児 血 清

G： gravitation acceleration

： 重 力 加 速 度

HEPES buffer

：

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

： へ ぺ ス 溶 液

HRP

：

horse radish peroxidase

： 西 洋 ワ サ ビ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ

IgE

：

immunoglobulin E： 免 疫 グ ロ ブ リ ン E

IgG

：

immunoglobulin G： 免 疫 グ ロ ブ リ ン G

(6)

ISS

：

itch severity score： 痒 み の 強 さ の ス コ ア

LSM： lymphocyte separation medium

： リ ン パ 球 分 離 溶 液

MFI： mean fluorescence intensity

： 平 均 蛍 光 強 度

MgCl

2：

magnesium chloride

： 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム

MBP

：

major basic protein： 主 要 塩 基 性 蛋 白 N.A： not applicable

：該 当 せ ず

NaN

3：

sodium azide： ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム N.D： not determined： 施 行 せ ず

N.S

：

not significant

： 有 意 差 な し

PC7

：

R-phycoerythrin /cyanine 7： R-

フ ィ コ エ リ ス リ ン

/シ ア ニ ン 7 PE： phycoerythrin： フ ィ コ エ リ ス リ ン

PE/Cy5：R-phycoerythrin /cyanine 5：R-フ ィ コ エ リ ス リ ン/シ ア ニ ン 5

PFA：paraformaldehyde phosphate buffer solution：パ ラ ホ ル ム ア ル

デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液

(

固 定 液

)

SA： streptavidin

： ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン

SA-HRP： streptavidin-horse radish peroxidase：

西 洋 ワ サ ビ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン

(7)

SLE

：

Systemic lupus erythematosus

： 全 身 性 エ リ テ マ ト ー デ ス

ssDNA： single stranded DNA

： 一 本 鎖 デ オ キ シ リ ボ 核 酸

(8)

- 1 -

概要

背 景：慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 一 部 の 症 例 で は 患 者 の 血 清 中 に 抗

FcεR

Ⅰ抗 体 や 抗

IgE

抗 体 と い っ た 自 己 反 応 性

IgG

が 存 在 す る こ と か ら 自 己 免 疫 が 発 症 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ て い る 1。し か し な が ら 、慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 血 清 中 に 自 己 反 応 性

IgE

が 存 在 す る か は 明 ら か に は な っ て い な い 。 こ の 研 究 で 我 々 は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 血 清 中 に 自 己 反 応 性

IgE

が 存 在 す る か ど う か を 検 討 し た 。

方 法：倫 理 委 員 会 の 承 認 後 、同 意 書 を 書 面 で 頂 い た

67

人 の 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル 、108 人 の 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 ，お よ び

29

人 の ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 の 血 清 を 実 験 に 供 し た 。 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

108

人 の う ち 橋 本 病 合 併

1

人 、 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 合 併

5

人 は 除 外 し 、

102

例 で 検 討 し た 。 自 己 血 清 皮 内 テ ス ト

(autologous serum skin test

，ASST) は

39

人 で 施 行 し た 。自 己 抗 原 に 対 す る 自 己 反 応 性

IgE

抗 体 価 と

IgG

抗 体 価 は 酵 素 免 疫 測 定 法

(enzyme-linked immunosorbent assay

，

ELISA)

を 用 い て 測 定 し た 。二 本 鎖 デ オ キ シ リ ボ 核 酸

(double stranded DNA，dsDNA)

で 活 性 化 さ れ た 好 塩 基 球 に お け る

CD63、 CD203c

の 発 現 レ ベ ル は 自 動

(9)

- 2 -

細 胞 解 析 分 離 装 置

(fluorescence activated cell sorter

，

FACS)

を 用 い て 測 定 し た 。 異 な る 三 群 間 の 比 較 は ス テ ィ ー ル ・ ド ゥ ワ ス 検 定 を 用 い て 評 価 し 、

p<0.05

を も っ て 有 意 と し た 。

結 果：血 清 中 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 と ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 で 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 有 意 な 増 加 を 認 め た 。 し か し 抗

dsDNA IgG

抗 体 価 は 三 群 間 で 有 意 差 は 認 め な か っ た 。 チ オ レ ド キ シ ン 、サ イ ロ グ ロ ブ リ ン に 対 す る

IgG

抗 体 価 は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 と 他 の

2

群 間 で 有 意 な 差 を 認 め な か っ た 。 チ オ レ ド キ シ ン 、 ぺ ル オ キ シ レ ド キ シ ン 、 サ イ ロ グ ロ ブ リ ン に 対 す る す べ て の

IgE

抗 体 価 お よ び ぺ ル オ キ シ レ ド キ シ ン に 対 す る

IgG

抗 体 価 は カ ッ ト オ フ 値 以 下 で あ っ た 。

ASST

陽 性 と

ASST

陰 性 患 者 と の 間 で 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 の 有 意 差 を 認 め な か っ た 。 検 討 し え た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

9

人 の う ち

2

人 の 好 塩 基 球 で は

dsDNA

に 反 応 し て

CD63

の 発 現 の 増 強 を 認 め た 。 ま た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

4

人 中

1

人 の 好 塩 基 球 で は

dsDNA

に 反 応 し て

CD203c

の 発 現 の 増 強 を 認 め た 。

(10)

- 3 -

結 語：自 己 反 応 性 抗

dsDNA IgE

が 慢 性 蕁 麻 疹 の 病 態 に 関 与 し て い る 症 例 が 存 在 す る こ と が わ か っ た 。

(11)

- 4 -

諸言

蕁 麻 疹 は 痒 み を 伴 う 一 過 性 の 膨 疹 と 紅 斑 の 出 没 を 特 徴 と す る 疾 患 で あ る 。 蕁 麻 疹 の 臨 床 像 は 多 彩 で 、 日 本 皮 膚 科 学 会 に よ る 「 蕁 麻 疹 ガ イ ド ラ イ ン 」2で は 、蕁 麻 疹 は

(1)

特 発 性 の 蕁 麻 疹 、(2) 刺 激 誘 発 性 の 蕁 麻 疹 、

(3)

血 管 性 浮 腫 、 お よ び

(4)

蕁 麻 疹 関 連 疾 患 、 の

4

群 に 分 け ら れ 、16 病 型 に 分 類 さ れ る

(表 1)。こ れ ら の 病 型 別 の 頻 度 と し て は 、特

発 性 の 蕁 麻 疹 が

7

割 以 上 を 占 め る 。 特 発 性 の 蕁 麻 疹 は 経 過 に よ り 急 性 蕁 麻 疹 と 慢 性 蕁 麻 疹 に 区 分 さ れ 、 本 邦 で は

4

週 間 以 上 継 続 す る 蕁 麻 疹 を 慢 性 蕁 麻 疹 と 定 義 し て い る 2。

蕁 麻 疹 で は 、 皮 膚 マ ス ト 細 胞 が 何 ら か の 機 序 に よ り 脱 顆 粒 し 、 皮 膚 組 織 内 に 放 出 さ れ た ヒ ス タ ミ ン を 始 め と す る 化 学 伝 達 物 質 が 皮 膚 微 小 血 管 と 神 経 に 作 用 し て 血 管 拡 張

(

紅 斑

)、血 漿 成 分 の 漏 出 (

膨 疹

)、お よ

び 痒 み を 生 じ る 。 蕁 麻 疹 に お け る マ ス ト 細 胞 の 活 性 化 の 機 序 と し て は

Ⅰ 型 ア レ ル ギ ー が 広 く 知 ら れ て い る が 、 実 際 に は 原 因 と し て 特 定 の 抗 原 を 同 定 で き る こ と は 少 な い 。 一 方 、 蕁 麻 疹 に は Ⅰ 型 ア レ ル ギ ー 以 外 に 機 械 的 擦 過 を 始 め と す る 種 々 の 物 理 的 刺 激 や 薬 剤 、 運 動 、 体 温 上 昇 な ど に よ る 過 敏 性 に よ る も の 、 明 ら か な 誘 因 な く 自 発 的 に 膨 疹 が 出 現

(12)

- 5 -

す る も の な ど が あ り 、 症 例 に よ り こ れ ら の 機 序 の い ず れ か 、 ま た は 複 数 の 因 子 が 複 合 的 に 関 与 し て 病 態 を 形 成 す る と 考 え ら れ る 2。

自 己 血 清 皮 内 テ ス ト

(autologous serum skin test

，ASST

)は 、FcεR

Ⅰ あ る い は

IgE

に 対 す る 自 己 反 応 性 抗 体 の 検 出 に 役 立 つ 3。 ま た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 約

4-5

割 が

FcεR

Ⅰ あ る い は

IgE

に 対 す る 自 己 反 応 性

IgG

を も っ て お り 4-6、慢 性 蕁 麻 疹 患 者 か ら 精 製 し た 抗

FcεR

Ⅰ 抗 体 と 抗

IgE

抗 体 は 、 好 塩 基 球 か ら の ヒ ス タ ミ ン 放 出 を 誘 導 す る と 報 告 さ れ て い る

7。そ の た め 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の

4-5

割 で は 自 己 免 疫 が 原 因 に な っ て い る

と 考 え ら れ て い る 4-6。

ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 の 患 者 の 血 清 中 に は チ オ レ ド キ シ ン 、

dsDNA

、一 本 鎖 デ オ キ シ リ ボ 核 酸

(single stranded DNA

、

ssDNA)、 サ イ ロ グ ロ

ブ リ ン な ど に 対 す る 自 己 反 応 性

IgE

が 存 在 す る こ と が 報 告 さ れ て お り 自 己 反 応 性

IgE

が 病 態 に 関 わ っ て い る こ と が 示 唆 さ れ て い る 8,9。ま た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 で は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル に 比 し て 抗 サ イ ロ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ

IgE

抗 体 価 が 高 い と 報 告 さ れ て い る 10,11。 し か し な が ら 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 血 清 中 に ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 で 認 め ら れ る よ う な 自 己 反 応 性

IgE

が 存 在 し て い る か ど う か 、 ま た 慢 性 蕁 麻 疹 の 症 状 に 自 己 反 応

(13)

- 6 -

性

IgE

が 関 与 し て い る か ど う か は わ か っ て い な い 。 最 近 、 難 治 性 気 管 支 喘 息 の 治 療 に 使 用 さ れ て い る ヒ ト 型 抗

IgE

抗 体

(

オ マ リ ズ マ ブ

)

が 特 発 性 慢 性 蕁 麻 疹 の 治 療 に も 有 効 で あ る と の 報 告 が あ り 12,13、 こ れ は

IgE

依 存 性 の マ ス ト 細 胞 お よ び 好 塩 基 球 の 活 性 化 が 慢 性 蕁 麻 疹 の 病 態 に 関 与 し て い る こ と を 示 し て い る 。 こ の 研 究 で は 、 自 己 反 応 性

IgE

が 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 血 清 中 に 存 在 し て 、 慢 性 蕁 麻 疹 の 病 態 に 関 わ っ て い る か ど う か を 調 べ た 。

(14)

- 7 -

対象と方法

(1)患 者 背 景

検 体 の 供 与 者 全 て か ら イ ン フ ォ ー ム ド コ ン セ ン ト を 得 た 。 こ れ ら の 検 体 の 採 取 及 び 取 扱 い は 、 日 本 大 学 板 橋 病 院 臨 床 研 究 審 査 委 員 会 に よ っ て 承 認 さ れ た 方 法 に 基 づ い て 行 っ た 。 全 て の 研 究 は 世 界 医 師 会 ヘ ル シ ン キ 宣 言 の ガ イ ド ラ イ ン に 沿 っ て 行 わ れ た 。 当 院 で 加 療 し た

108

例 の 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 、

29

例 の ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 、 お よ び

67

例 の 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル の 末 梢 血

10 ml

か ら 遠 心 分 離 に て 血 清 を 分 離 し た 。 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

108

例 の う ち 、 橋 本 病 合 併

1

例 、 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 合 併

5

例 は 除 外 し て 検 討 し た 。 慢 性 蕁 麻 疹 お よ び ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 の 診 断 は 日 本 皮 膚 科 学 会 が 作 成 し た そ れ ぞ れ 蕁 麻 疹 診 療 ガ イ ド ラ イ ン と ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 診 療 ガ イ ド ラ イ ン の 日 本 皮 膚 科 学 会 「 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 の 定 義 ・ 診 断 基 準 」 に 基 づ い て 行 っ た 2,14。 患 者 背 景 を 表

2

に 示 す 。 好 塩 基 球 の 活 性 化 を 検 討 し た 患 者 背 景 を そ れ ぞ れ 表

3、 表 4

に 示 す 。

(2)試 薬

自 己 成 分 と し て 、 使 用 し た

dsDNA

、 チ オ レ ド キ シ ン (

thioredoxin

(15)

- 8 -

human)、 ペ ル オ キ シ レ ド キ シ ン (peroxiredoxin 1 human

)、 サ イ ロ グ ロ ブ リ ン (

thyroglobulin from bovine thyroid)、 カ ル シ ウ ム イ オ ノ

フ ォ ア

A23187

は す べ て

Sigma-Aldrich (St. Louis、MO.

、USA) か ら 購 入 し た 。

以 下 の 試 薬 は そ れ ぞ れ 下 記 の 会 社 か ら 購 入 し た 。

牛 血 清 由 来 ア ル ブ ミ ン

( bovine albumin fraction V solution

、BSA)、ダ ル ベ ッ コ リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 (Dulbecco’s phosphate buffered saline

、

DPBS)

は

Life technologies (Calsbad、 CA.

、

USA)、 リ ン パ 球 分 離

溶 液

(lymphocyte separation medium、 LSM)

は

Biomedicals (Solon

、

OH.、 USA)、 R-フ ィ コ エ リ ス リ ン (R-phycoerythrin、 PE)

標 識 抗

CD63

抗 体 、ビ オ チ ン 標 識 抗

IgE

抗 体 、ビ オ チ ン 標 識 抗

IgG

抗 体 は

BD Biosciences (San Diego、 CA.

、

USA)、 西 洋 ワ サ ビ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ (horse radish peroxidase

、

HRP )

標 識 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン

(streptavidin、 SA) (SA-HRP)

は

R&D Systems (Minneapolis

、

MN.、

USA)、 R-

フ ィ コ エ リ ス リ ン

/シ ア ニ ン (R-phycoerythrin /cyanine 5、

PE/Cy5)

標 識 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン は

Biolegend (San Diego

、

CA.

、

USA)、抗 FcεRIα

抗 体 は

eBioscience ( San Diego、 CA.、 USA)、IL-3

(16)

- 9 -

は

PeproTech EC Ltd (London、 UK)、 ウ サ ギ 抗 IgE

抗 体 は

DAKO Cytomation (Carpinteria

、

CA.

、

USA)、 4%

パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液 (固 定 液 )は 和 光 純 薬

(大 阪 、 日 本 )

。

Allergenicity Kit

は

Beckman Coulter (Brea、 CA.、 USA)。

(3)自 己 反 応 性 抗 体 の 検 出

自 己 反 応 性 抗 体 の 検 出 は

Zeller

ら 9の 論 文 に よ る 方 法 に 改 良 を 加 え て

ELISA

法 で 行 っ た 。 慢 性 蕁 麻 疹 に お い て 自 己 反 応 性

dsDNA IgG

抗 体 価 、ペ ル オ キ シ レ ド キ シ ン

IgG

抗 体 価 、サ イ ロ グ ロ ブ リ ン

IgG

抗 体 価 が 健 常 人 と 比 較 し て 高 い と の 報 告 1、疾 患 コ ン ト ロ ー ル で あ る ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 に お い て 自 己 反 応 性 チ オ レ ド キ シ ン

IgE

抗 体 価 が 健 常 人 と 比 較 し て 高 い と の 報 告 9か ら こ の 実 験 で は

dsDNA、ペ ル オ キ シ レ ド キ シ

ン 、 サ イ ロ グ ロ ブ リ ン 、 お よ び チ オ レ ド キ シ ン に 自 己 反 応 性

IgE

を 検 討 し た 。DPBS で 希 釈 し た

5 μg/ml

の

dsDNA、チ オ レ ド キ シ ン 、ぺ ル

オ キ シ レ ド キ シ ン 、サ イ ロ グ ロ ブ リ ン を 用 い て

96

穴 プ レ ー ト を

1

晩 静 置 し 固 相 化 し た 。 洗 浄 後 、

1% BSA

を プ レ ー ト に 入 れ 非 特 異 的 反 応 を 阻 害 し た の ち 、 自 己 反 応 性

IgE

抗 体 価 測 定 に 関 し て は

DPBS

で

1/10

(17)

- 10 -

に 希 釈 し た 血 清 、 自 己 反 応 性

IgG

抗 体 価 測 定 に 関 し て は

DPBS

で

1/1000

希 釈 し た 血 清 を プ レ ー ト に 加 え

2

時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。結 合 し た 自 己 反 応 性

IgE

も し く は

IgG

は

0.2

％ ビ オ チ ン 標 識 抗

IgE

も し く は

0.2％

ビ オ チ ン 標 識 抗

IgG

モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と

0.5

％

SA-HRP

を 用 い て 検 出 し た 。 定 量 は

Thermo SCIENTIFIC

社 の

MULTISKAN GO

を 用 い て

450 nm

と

570 nm

の 吸 光 度 を 測 定 し て 行 っ た (図

1)。

(4)

ASST

ASST

は 国 際 的 な プ ロ ト コ ー ル に 沿 っ て 行 っ た 15。 す な わ ち

0.2 ml

の 自 己 血 清 と 陰 性 コ ン ト ロ ー ル と し て 生 理 食 塩 水 を 前 腕 に 皮 内 注 射 し た 。

30

分 後 に 膨 疹 の 直 径 が 陰 性 コ ン ト ロ ー ル よ り

1.5

㎜ 以 上 あ れ ば 陽 性 と し た 。

(5)好 塩 基 球 の 活 性 化

好 塩 基 球 の 活 性 化 は

Gymsi

16ら の 論 文 に よ る 方 法 に 改 良 を 加 え て 行 っ た 。 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

9

例 、 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル

5

例 の 末 梢 血 か ら の 単 核 球 の 分 離 は ヘ パ リ ン 添 加 末 梢 血 を

DPBS

で

3

倍 に 希 釈 し 、

LSM

を 入

(18)

- 11 -

れ た 試 験 管 に 希 釈 血 液 を 重 層 し

450

重 力 加 速 度 (

Gravitational

acceleration： G)

で

30

分 間 遠 心 し た 。 末 梢 血 単 核 細 胞 層 を 回 収 し 、 洗 浄 の た め 約

50 ml

の

DPBS

を 加 え て 混 和 し

810G

で

5

分 間 遠 心 し 、 上 清 を 吸 引 除 去 し た 。 も う 一 度 同 様 の 方 法 で 洗 浄 し 、 細 胞 ぺ レ ッ ト に

10 ml

の

DPBS

を 加 え 細 胞 数 を 測 定 し た 。さ ら に 同 じ 方 法 で 洗 浄 し た 。 分 離 し た 細 胞 を 、

1 mM CaCl

2

, 1 mM MgCl

2 お よ び

0.025% BSA

を 含 む HEPES バ ッ フ ァ ー で

2

×107細 胞

/ml

の 濃 度 に 調 整 し た 。末 梢 単 核 球 は

10 ng/ml

の

IL-3

を 加 え

37

℃ で

30

分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 、 洗 浄 し 、

dsDNA (1

ま た は

10 μg/ml)

、カ ル シ ウ ム イ オ ノ フ ォ ア

A23187

(10-6

M) 、 抗 IgE

抗 体 (0.1 μg/ml)で

37℃ で 3

分 間 刺 激 し た 。 抗

IgE

抗 体 で 3 分 以 上 刺 激 す る と 細 胞 表 面 の

FcεRⅠ の 発 現 が 減 弱 す る た め 、

こ の 実 験 系 で は 刺 激 時 間 を 3 分 間 と し た 。 こ れ ら の 細 胞 を 回 収 し て 遠 心 し 、

200 μl

の

4%

パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液

(paraformaldehyde phosphate buffer solution

、

PFA)

で

37

℃ で

20

分 間 固 定 し た 。

100 μl

の

DPBS

を 加 え

2800G

で

5

分 間 遠 心 し 、 上 清 を 吸 引 除 去 し た 。ビ オ チ ン 標 識 抗

FcεRⅠ 抗 体 と PE

標 識 抗

CD63

抗 体 を 添 加 し

4℃ で 20

分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、

100 μl

の

DPBS

を 加 え

5

(19)

- 12 -

分 間 遠 心 し 上 清 を 吸 引 除 去 し た 。

2

次 抗 体 に は

R-

フ ィ コ エ リ ス リ ン

/

シ ア ニ ン

(R-phycoerythrin /cyanine 5

、

PE/Cy5)

標 識 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン を 添 加 し 、4℃ で

20

分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、100 μl の

DPBS

を 加 え

5

分 間 遠 心 し 上 清 を 吸 引 除 去 し た 。

0.1% NaN

3

, 2%

ウ シ 胎 児 血 清

(fetal calf serum

、

FCS)

を 添 加 し た

DPBS(以 下 こ れ を FACS

バ ッ フ ァ ー と よ ぶ

) 500 μl

に 細 胞 を 浮 遊 さ せ 、BD FACS フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い て 測 定 し 、FcεRⅠ 陽 性 集 団 の

CD63

の 発 現 量 を 検 討 し て 活 性 化 を 評 価 し た 16。

CD63

は 顆 粒 膜 に 存 在 す る テ ト ラ パ ニ ン フ ァ ミ リ ー の Ⅲ 型 膜 た ん ぱ く 質 で あ り 、 マ ス ト 細 胞 や 好 塩 基 球 な ど の 細 胞 の 活 性 化 に 伴 っ て 細 胞 膜 と 顆 粒 膜 が 融 合 し 細 胞 表 面 に 発 現 す る 17。 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー の 解 析 は

BD CellQuest

を 用 い て 行 っ た 。 ま た 、 発 現 強 度 を 平 均 蛍 光 強 度

(mean fluorescence intensity

、

MFI） で 示 し

た 。 図 の 中 の 数 値 は 刺 激 後 の

CD63

の 発 現 強 度 を 刺 激 前 の

CD63

の 発 現 強 度 で 割 っ た 値 で あ る

(

図

9)

。 好 塩 基 球 の 活 性 化 の 指 標 と し て

CD203c

も 用 い ら れ 、そ の 発 現 測 定 用 の キ ッ ト と し て

Allergenicity kit

が 市 販 さ れ て お り 、 こ の キ ッ ト を 用 い て 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

4

名 、 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル

5

例 を 追 加 検 討 し た 。末 梢 血

1ml

は

10 ng/ml

の

IL-3

を

(20)

- 13 -

加 え

37℃ で 30

分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 、

dsDNA (3

ま た は

10 μg/ml)

、カ ル シ ウ ム イ オ ノ フ ォ ア

A23187

(10-6

M) 、キ ッ ト に 付 属 の positive

control

溶 液 [抗

IgE

抗 体

(10 μg/ml) ]

、キ ッ ト に 付 属 の 抗 体 混 合 液 [ フ ル オ レ セ イ ン イ ソ チ オ シ ア ネ ー ト

(fluorescein isothiocyanate

、

FITC)

標 識 抗

CD294

抗 体 、 フ ィ コ エ リ ス リ ン

(phycoerythrin、 PE)

標 識 抗

CD203c

抗 体 、

R-フ ィ コ エ リ ス リ ン /シ ア ニ ン (R-phycoerythrin

/cyanine 7

、

PC7)

標 識 抗

CD3

抗 体 ] 、 キ ッ ト に 付 属 の 活 性 化 バ ッ フ ァ ー を 加 え

37

℃ で

15

分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 キ ッ ト に 付 属 の 反 応 停 止 液 を 加 え よ く 撹 拌 し た の ち 、 キ ッ ト に 付 属 の 溶 血 ・ 固 定 液 を 加 え 室 温 で

10

分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。

5

分 間 遠 心 し 上 清 を 吸 引 除 去 し た 。

DPBS

で

0.1 %に 希 釈 し た ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ( Formaldehyde ) 500

μl

に 細 胞 を 浮 遊 さ せ 、

BD FACS

フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い て 測 定 し 、

CD294

陽 性 か つ

CD3

陰 性 集 団 の

CD203c

の 発 現 量 を 検 討 し て 活 性 化 を 評 価 し た 。CD203c は Ⅱ 型 の 膜 貫 通 型 タ ン パ ク で 好 塩 基 球 の 定 常 状 態 で も 低 レ ベ ル で 発 現 し て い る が 、 活 性 化 に 伴 い そ の 細 胞 表 面 の 発 現 量 が 増 え る 18。 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー の 解 析 は

BD CellQuest

を 用 い て 行 っ た 。図 の な か の 数 値 は

CD294

陽 性 か つ

CD203c

陽 性 を 示 す

(21)

- 14 -

細 胞 の 割 合 で あ る

(

図

10 )。

(6)統 計

異 な る 三 群 間 の 比 較 は ス テ ィ ー ル・ド ゥ ワ ス 検 定 を 用 い て 評 価 し 、p <

0.05

を も っ て 有 意 と し た 。 抗

dsDNAIgE

抗 体 価 と 血 清

IgE

値 、 罹 患 期 間 と の 相 関 関 係 は 回 帰 分 析 を 用 い て 評 価 し た 。抗

dsDNAIgE

抗 体 価 と 性 差 は

t

検 定 を 用 い て 評 価 し 、

p < 0.05

を も っ て 有 意 と し た 。

(22)

- 15 -

結果

(1)抗

dsDNA IgE

抗 体 価 は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 お よ び ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 で 有 意 に 増 加 す る

血 清 中 の 自 己 反 応 性

IgE

抗 体 価 お よ び

IgG

抗 体 価 が 増 加 し て い る か ど う か を 調 べ る た め 、

dsDNA、チ オ レ ド キ シ ン 、 ぺ ル オ キ シ レ ド キ シ ン

、サ イ ロ グ ロ ブ リ ン 反 応 性

IgE、 IgG

抗 体 価 を 測 定 し た 。抗

dsDNA IgE

抗 体 価 が 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル に 比 し て 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 お よ び ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 で 統 計 学 的 に 有 意 に 増 加 し て い た (図

2

)。 ま た ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 の 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 の 高 値 の 患 者

1

例 を の ぞ い て 統 計 学 的 検 討 を 行 っ た が 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル に 比 し て 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 お よ び ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 で 統 計 学 的 に 優 位 に 増 加 し て い た 。 ま た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 年 齢 が 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル に 比 べ て 統 計 学 的 に 有 意 に 高 い 為 ( p < 0.001 )、

50

代 か ら

80

代 を の ぞ い た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

77

例 と 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル

67

例 間 で 、年 齢 の 有 意 差 が な い 条 件 で 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 の 統 計 学 的 検 討 を 行 っ た 。 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル に 比 し て 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 で 統 計 学 的 に 有 意 に 増 加 し て い た

(

図

3)

。 し か し 、 抗

dsDNA IgG

抗 体 価

(23)

- 16 -

は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 、 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 、 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル で 有 意 差 は 認 め な か っ た (図

4)。 チ オ レ ド キ シ ン 、 サ イ ロ グ ロ ブ リ ン 反 応

性

IgG

抗 体 価 は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 、 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 、 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル の 三 群 間 で 有 意 差 は 認 め な か っ た (図

5-6

)。 チ オ レ ド キ シ ン 反 応 性

IgE

抗 体 価 は ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 で 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル 、 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 に 比 し て 有 意 に 低 下 し て い た

(p < 0.001)。 し か し 、 ア ト

ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 の チ オ レ ド キ シ ン 反 応 性

IgE

抗 体 価 は 全 て カ ッ ト オ フ 値 以 下 で あ っ た 為 、 信 頼 性 が な い と 考 え る 。 チ オ レ ド キ シ ン 、 サ イ ロ グ ロ ブ リ ン 反 応 性

IgE

抗 体 価 、ぺ ル オ キ シ レ ド キ シ ン 反 応 性

IgE

抗 体 価 、 お よ び

IgG

抗 体 価 は 検 出 感 度 以 下 で あ っ た (検 出 感 度 以 下 の た め 図 は 示 し て い な い )。

(24)

- 17 -

(2)抗

dsDNA IgE

抗 体 価 は 、 血 清

IgE

値 、 罹 患 期 間 と の 相 関 関 係 、 性 差 は 認 め ず 、

ASST

陽 性 お よ び 陰 性 と の 関 係 も 認 め な い

抗

dsDNA IgE

抗 体 価 と 血 清

IgE

値 と の 相 関 関 係 は ｙ ＝

2.4×

10

-5

(x-269)+0.350、 ｒ (ア ー ル )

2＝

0.00263

で 相 関 は 認 め な か っ た 。 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 と 罹 患 期 間 と の 相 関 関 係 は ｙ ＝

-4.6×

10

-5

(x-51)+0.341、 ｒ (ア ー ル )

2＝

0.0004

で 相 関 は 認 め な か っ た 。 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 と 性 差 は

0.35 ± 0.02

対

0.34 ± 0.02(男 対 女 )で 性 差

は 認 め な か っ た (図

7)

。

ま た 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 は

ASST

陰 性 と 陽 性 患 者 に お い て 有 意 差 は な か っ た (図

8

)。

(25)

- 18 -

(3)dsDNA

は 一 部 の 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 好 塩 基 球 を 活 性 化 す る

dsDNA

に よ る 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル お よ び 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 好 塩 基 球 の 活 性 化 を 検 討 す る た め に 、dsDNA 添 加 に よ る 好 塩 基 球 表 面 の

CD63

、

CD203c

の 発 現 の 変 化 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い て 測 定 し た 。 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル お よ び 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 末 梢 血 単 核 球 は と も に

IL-3

で

30

分 間 前 処 置 を し た 。

CD63

を 用 い た 好 塩 基 球 の 活 性 化 の 検 討 で は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル

5

例 で は

dsDNA

刺 激 で

CD63

の 発 現 の 変 化 は 認 め な か っ た が 、 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 で は

9

例 中

2

例 で

dsDNA

刺 激 で

CD63

の 発 現 の 増 強 を 認 め た (図

9

)。表

3

の

A、 B

の 患 者 で

CD63

の 発 現 の 増 強 を 認 め た 。 発 現 の 増 強 を 認 め た

1

例 を 示 し た 。

CD203c

を 用 い た 好 塩 基 球 の 活 性 化 の 検 討 で は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル

5

例 で は

dsDNA

刺 激 で

CD203c

の 発 現 の 変 化 は 認 め な か っ た が 、慢 性 蕁 麻 疹 患 者 で は

4

例 中

1

例 で

dsDNA

刺 激 で

CD203c

の 発 現 の 増 強 を 認 め た (図

10)。 表 4

の

a

の 患 者 で

CD203c

の 発 現 の 増 強 を 認 め た 。 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル

1

例 及 び 慢 性 蕁 麻 疹 の 発 現 の 増 強 を 認 め た

1

例 と 慢 性 蕁 麻 疹 の 発 現 の 増 強 を 認 め な か っ た

1

例 を 示 し た 。

(26)

- 19 -

考察

本 研 究 で は 抗

dsDNA IgG

抗 体 価 、 チ オ レ ド キ シ ン 、 ぺ ル オ キ シ レ ド キ シ ン 、サ イ ロ グ ロ ブ リ ン に 対 す る 自 己 反 応 性

IgG

抗 体 価 は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル と 有 意 差 を 認 め な か っ た (図

4-6)が 、 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 で

の 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 が 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 統 計 学 的 に 有 意 に 増 加 し て い る こ と を 明 ら か に し た (図

2)。 ま た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

の 年 齢 を 補 正 し て の 検 討 も 行 っ た が 、 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 で の 抗

dsDNA

IgE

抗 体 価 は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 統 計 学 的 に 有 意 に 増 加 し て い た (図

3)。し か し 、抗 dsDNA IgE

抗 体 価 は

ASST

の 陽 性 患 者 と 陰 性 患 者 の 間 で 有 意 差 は な く (図

8)、 総 IgE

値 、 罹 患 期 間 、 性 別 と の 間 で 相 関 は 認 め ら れ な か っ た (図

7

)。 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル

5

例 の 好 塩 基 球 で は

dsDNA

刺 激 に よ る

CD63

の 発 現 増 強 は 認 め な か っ た が

dsDNA

刺 激 に よ っ て 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

9

人 中

2

人 の 好 塩 基 球 表 面 の

CD63

の 発 現 増 強 を 認 め た (図

9)。 ま た 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル 5

例 の 好 塩 基 球 で は

dsDNA

刺 激 に よ る

CD203c

の 発 現 増 強 は 認 め な か っ た が

dsDNA

刺 激 に よ っ て 慢 性 蕁 麻 疹 患 者

4

人 中

1

人 の 好 塩 基 球 表 面 の

CD203c

の 発 現 増 強 を 認 め た (図

10

)。 以 上 の こ と か ら 、 抗

dsDNA IgE

は 慢 性 蕁 麻 疹

(27)

- 20 -

の 少 な く と も 一 部 の 症 例 で 病 態 に 関 わ っ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 一 部 で は 、 血 清 中 に マ ス ト 細 胞 や 好 塩 基 球 を 活 性 化 す る 因 子 が 存 在 す る こ と は 以 前 か ら 報 告 さ れ て い る 19。 こ の 因 子 の 主 た る も の は 抗

IgE

抗 体 あ る い は 抗

FcεRⅠ 抗 体 で あ る こ と が 明 ら か

に さ れ 5、こ れ ら の 病 態 を 自 己 免 疫 性 蕁 麻 疹 と 呼 ば れ て い る 。慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 血 清 中 の 自 己 抗 体 の 検 出 の 一 つ と し て

ASST

が あ る が 、 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の

ASST

の 陽 性 率 は 報 告 者 に よ り

4.1%か ら 76.5%

と 大 き な 幅 が あ る 15。し か し 、実 際 に 自 己 抗 体 の 保 有 頻 度 は そ れ ほ ど 高 く な く 、

ASST

陽 性 の う ち 約

13.8

か ら

85

％ が 抗

IgE

抗 体 あ る い は 抗

FcεR

Ⅰ 抗 体 と い っ た 自 己 抗 体 に よ る 反 応 で あ る と さ れ て い る 15, 20,21。一 方 で 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 に 関 し て は

ASST

の 陽 性 と 陰 性 患 者 に お い て そ の 抗 体 価 に 有 意 差 は な か っ た 。こ の こ と よ り 、抗

dsDNA IgE

を 含 む 血 清 成 分 自 体 が マ ス ト 細 胞 や 好 塩 基 球 を 活 性 化 す る の で は な く 、 他 の 機 序 が 示 唆 さ れ る 。 例 え ば 炎 症 局 所 で 破 壊 さ れ た 細 胞 か ら 漏 出 し た

dsDNA

が 炎 症 局 所 で マ ス ト 細 胞 や 好 塩 基 球 を 活 性 化 す る 機 序 で あ る 。

今 回 の 実 験 で は 疾 患 コ ン ト ロ ー ル 群 と し て ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 を 用 い た 。 そ の 理 由 は 、 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 の 患 者 の 血 清 中 に は チ オ レ ド キ シ

(28)

- 21 -

ン 、

dsDNA、 ssDNA、サ イ ロ グ ロ ブ リ ン な ど に 対 す る 自 己 反 応 性 IgE

が 存 在 す る こ と が 報 告 さ れ 8,9、 そ の 病 態 へ の 関 与 が 示 唆 さ れ て お り 、 自 己 免 疫 性 疾 患 の 側 面 を 有 し て い る 。 ま た 慢 性 蕁 麻 疹 に お い て も 自 己 免 疫 性 と 考 え ら れ る 患 者 が 約

4-5

割 い る 4-6

。両 者 の 病 態 に 共 通 性 が 認

め ら れ る と 考 え た 。 そ の た め 、 疾 患 コ ン ト ロ ー ル と し て ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 を 実 験 、 及 び 検 討 に 加 え た 。 結 果 は ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 患 者 の 抗

dsDNA IgE

抗 体 値 は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 有 意 に 増 加 し て い る こ と を 確 認 し た 。さ ら に 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 で も 有 意 に 増 加 し て い た 。

抗

dsDNA

抗 体 は 全 身 性 エ リ テ マ ト ー デ ス (Systemic lupus

erythematosus、 SLE )の 代 表 的 な 自 己 抗 体 で 、 そ の 陽 性 率 と 疾 患 特 異 性

は 高 く 、そ の 抗 体 価 は 疾 患 活 動 性 と 相 関 す る 事 が 多 い た め 、抗

dsDNA

抗 体 は 診 断 基 準 の 項 目 の 一 つ に 採 用 さ れ て い る 22。抗

dsDNA

抗 体 の 中 で も

IgG

型 は 病 勢 を よ く 反 映 す る と 報 告 さ れ て い る 23。

SLE

の 活 動 性 腎 症 で は

dsDNA IgG

お よ び

dsDNA IgA

抗 体 価 が 上 昇 し 、

SLE

の 非 活 動 性 腎 症 で は

dsDNA IgG

お よ び

dsDNA IgM

お よ び

dsDNA IgA

抗 体 価 が 上 昇 し て い る と の 報 告 24も あ る が 、dsDNA IgM 抗 体 、dsDNA IgA 抗 体 の 臨 床 的 意 義 に つ い て は 詳 細 に 検 討 さ れ て い な い 。 ま た 文 献 で 検 索 し

(29)

- 22 -

得 る 限 り で は 、

SLE

患 者 に お け る 抗

dsDNA IgE

抗 体 の 上 昇 の 報 告 は な い 。

dsDNA

の よ う な 自 己 抗 原 は 自 己 反 応 性

IgE

が 結 合 し た

FcεR

Ⅰ を 架 橋 し 、 マ ス ト 細 胞 と 好 塩 基 球 の 活 性 化 を 惹 起 す る 。 今 回 の 実 験 で は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 好 塩 基 球 を 使 っ て 実 験 し 、

dsDNA

に よ り

CD63

の 活 性 化 は

9

例 中

2

例 で

CD203c

の 活 性 化 は

4

例 中

1

例 で 惹 起 さ れ た 。ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 で の 同 様 の 検 討 は い ま だ さ れ て い な い 。 今 回 我 々 は は じ め て

dsDNA

が 抗

dsDNA

抗 体 に よ る 好 塩 基 球 の 活 性 化 に 直 接 働 く こ と を 示 し た 。 重 症 度 の 定 義 は 慢 性 蕁 麻 疹 で は な い が 、 副 腎 皮 質 ス テ ロ イ ド 内 服 薬 を 服 用 し て い る 患 者 は 重 症 で あ っ た と 考 え る と

CD63

の 活 性 化 を 検 討 し た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 中 で 、 活 性 化 が 惹 起 さ れ た 症 例 と 惹 起 さ れ な か っ た 症 例 両 者 に 副 腎 皮 質 ス テ ロ イ ド 内 服 薬 を 服 用 し て い る 患 者 が い た 。 ま た

ASST

も 陽 性 陰 性 そ れ ぞ れ が 活 性 化 が 惹 起 さ れ た 症 例 と 惹 起 さ れ な か っ た 症 例 に 存 在 し た 。 現 時 点 で は 重 症 度 お よ び

ASST

の 結 果 と

dsDNA

に よ る 好 塩 基 球 の 活 性 化 の 関 連 は な い よ う に 思 わ れ る が 、 検 討 し た 症 例 数 が 少 な く 、 今 後 症 例 数 を 増 や し 再 検 討 を し な け れ ば な ら な い 。

オ マ リ ズ マ ブ は 、

IgE

に 対 す る 遺 伝 子 組 み 換 え 型 ヒ ト 化 モ ノ ク ロ ー

(30)

- 23 -

ナ ル 抗 体 で 、

IgE

の 抗

FcεRⅠ 受 容 体 へ の 結 合 を 防 ぐ と と も に 、 2

次 的 に 好 塩 基 球 や マ ス ト 細 胞 上 の

FcεR

Ⅰ 受 容 体 の 発 現 を 低 下 さ せ る と さ れ 25,26、 難 治 性 気 管 支 喘 息 の 治 療 に 使 用 さ れ て い る 27。 最 近 、 オ マ リ ズ マ ブ の 難 治 性 慢 性 蕁 麻 疹 に 対 す る 有 効 性 が 報 告 さ れ て い る 12,28。

Kaplan

ら は 、従 来 の 治 療 29で あ る

H1

受 容 体 拮 抗 薬 の 通 常 量 及 び 増 量

(4

倍 量 ま で

)、 抗 ロ イ コ ト リ エ ン 薬 の 併 用 、 H1

受 容 体 拮 抗 薬 の 変 更 、

H2

拮 抗 剤 の 併 用 で 効 果 の な い 自 己 免 疫 性 蕁 麻 疹 患 者

336

人 に 対 し て オ マ リ ズ マ ブ

300mg

を

4

週 毎 に 投 与 し 、

12

週 で 痒 み の ス コ ア

(itch severity score

、ISS) 30,31が

8.6

ポ イ ン ト 減 少 し 、プ ラ セ ボ 群 で

4.0

ポ イ ン ト の 減 少 で あ っ た の に 比 べ て 有 意 で あ っ た と 述 べ て い る 32。

高 親 和 性

IgE

受 容 体

(FcεRⅠ )の み な ら ず 、 Puccetti

ら は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 血 清 中 に は 低 親 和 性

IgE

受 容 体

FcεRⅡ (CD23)

に 対 す る 自 己 抗 体 が 存 在 し 、 そ れ が 患 者 の 皮 膚 に 浸 潤 し た 好 酸 球 細 胞 表 面 上 に 発 現 し た

CD23

に 結 合 し 、 主 要 塩 基 性 蛋 白 (major basic protein、

MBP)

な ど の 好 酸 球 顆 粒 蛋 白 を 遊 離 さ せ マ ス ト 細 胞 の 活 性 化 を 惹 起 し て ヒ ス タ ミ ン の 遊 離 を お こ す と 述 べ て い る 33。 難 治 性 慢 性 蕁 麻 疹 に オ マ リ ズ マ ブ が 有 効 で あ っ た こ と を 考 え る と 、今 回 我 々 が 報 告 し た 抗

dsDNA IgE

以 外

(31)

- 24 -

に も 複 数 の 自 己 反 応 性

IgE

が 関 与 し て い る と も 考 え ら れ る 。

慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の

7

割 以 上 が 特 発 性 で 原 因 が わ か っ て い な い 。 我 々 の 検 討 で は 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 が 統 計 学 的 に 有 意 に 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル に 比 し て 高 か っ た 。ま た 検 討 し 得 た

13

例 中

3

例 の 慢 性 蕁 麻 疹 の 症 例 に お い て

dsDNA

が 好 塩 基 球 を 活 性 化 し た 。 こ の こ と は 慢 性 蕁 麻 疹 の 病 態 が 自 己 免 疫 性 と 考 え ら れ て い る 一 旦 を 明 ら か に し た 。 ま た 、 こ の よ う な 自 己 免 疫 性

IgE

を 治 療 標 的 と し た 治 療 法 は 新 規 の 慢 性 蕁 麻 疹 の 治 療 と な り う る 。 ま た 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 血 清 中 に 存 在 す る 自 己 反 応 性

IgE

を 網 羅 的 に 調 べ る こ と に よ っ て 慢 性 蕁 麻 疹 の 病 態 解 明 に 更 に 寄 与 で き る の で は な い か と 考 え ら れ る 。

(32)

- 25 -

まとめ

本 研 究 で 著 者 は 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル に 比 し て 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 で の 抗

dsDNA IgE

抗 体 価 の 有 意 な 増 加 を 示 し た 。 ま た

dsDNA

は 慢 性 蕁 麻 疹 患 者 の 好 塩 基 球 を 直 接 活 性 化 す る

。

以 上 の 事 か ら 抗

dsDNA IgE

抗 体 は 慢 性 蕁 麻 疹 の 病 態 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。

(33)

- 26 -

謝辞

本 研 究 は 日 本 大 学 医 学 部 大 学 院 医 学 研 究 科 先 端 医 学 系 旧 分 子 細 胞 免 疫・ア レ ル ギ ー 学 研 究 室（ 羅 智 靖 教 授 ）、現 免 疫・ア レ ル ギ ー 学 グ ル ー プ に お い て 実 施 し た も の で す 。

本 研 究 に 関 し て 、 研 究 な ら び に 学 位 論 文 の 御 指 導 、 御 校 閲 を 直 接 賜 り ま し た 同 グ ル ー プ の 岡 山 吉 道 博 士 に 深 謝 い た し ま す 。

本 研 究 の 御 指 導 を 賜 り ま し た 日 本 大 学 医 学 部 皮 膚 科 学 系 皮 膚 科 学 分 野 、 照 井 正 教 授 な ら び に 日 本 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 先 端 医 学 系 旧 分 子 細 胞 免 疫 ・ ア レ ル ギ ー 学 分 野 、 羅 智 靖 教 授 に 深 謝 い た し ま す 。

本 研 究 は 患 者 さ ん の 協 力 な し に は 不 可 能 で あ り ま し た 。 快 く 血 液 を 供 給 し て 下 さ っ た 患 者 さ ん 方 に 深 謝 い た し ま す 。 ま た 健 常 者 コ ン ト ロ ー ル と し て 血 液 を 供 給 し て 下 さ っ た 皮 膚 科 医 局 員 一 同 、 お よ び 病 院 ス タ ッ フ に 深 謝 い た し ま す 。

(34)

- 27 -

表

1

蕁麻疹の主たる病型

表

1：

「蕁麻疹診療ガイドライン(2011年改訂版)」2より抜粋。蕁麻疹は (1) 特 発性の蕁麻疹、

(2)

刺激誘発性の蕁麻疹、

(3)

血管性浮腫、

(4)

蕁麻疹関連疾患、

の

4

群に分けられ、16病型に分類される。

(35)

- 28 -

表

2 患者背景

表

2：慢性蕁麻疹患者群 102

例の年齢の中央値と四分位範囲は

42±21

歳、アト ピー性皮膚炎患者群

29

例は

39 ± 13

歳、健常者コントロール群は

67

例は

34.6 ±

8.7

歳であった。慢性蕁麻疹患者とアトピー性皮膚炎患者の罹患期間はそれぞれ

24 ± 67.8、360 ± 192

か月(中央値と四分位範囲)、IgE値は

156±313、3414 ±

6029 IU/ml(中央値と四分位範囲)であった。慢性蕁麻疹患者の 75

例が

H1

受容 体拮抗薬内服をしており、そのうち

8

例が副腎皮質ステロイド内服薬も併用し ていた。慢性蕁麻疹患者の

16

例 (41%) が

ASST

陽性であった。N.A = not

applicable (該当せず)、N.D = not determined (施行せず)

(36)

- 29 -

表

3 CD63

を用いた好塩基球の活性化の検討 患者背景

表

3

：

CD63

を用いた好塩基球の活性化の検討を施行した患者

9

例の背景を示し た。全例が

H1

受容体拮抗薬内服をしており、

2

例は副腎皮質ステロイド内服薬 も併用していた。ASSTは

4

例で施行されており、陽性

2

例、陰性

2

例であっ た。H1B：H1受容体拮抗薬、PSL：副腎皮質ステロイド内服薬

(37)

- 30 -

表

4 CD203c

を用いた好塩基球の活性化の検討 患者背景

表

4

：

CD203c

を用いた好塩基球の活性化の検討を施行した患者

4

例の背景を示 した。全例が

H1

受容体拮抗薬の内服をしていた。

ASST

は

4

例で施行されてお り、陽性

2

例、陰性

2

例であった。H1B：H1受容体拮抗薬

(38)

- 31 -

図

1

図

1：DPBS

で希釈した

5 μg/ml

の

dsDNA、チオレドキシン、ぺルオキシレド

キシン、サイログロブリンを用いて

96

穴プレートを

1

晩静置し固相化した。慢 性蕁麻疹において自己反応性

dsDNA IgG

抗体価、ペルオキシレドキシン

IgG

抗体価、サイログロブリン

IgG

抗体価が健常人と比較して高いとの報告1、疾患 コントロールであるアトピー性皮膚炎において自己反応性チオレドキシン

IgE

抗体価が健常人と比較して高いとの報告9からこの実験では

dsDNA、ペルオキ

シレドキシン、サイログロブリン、およびチオレドキシンに自己反応性

IgE

を 検討した。洗浄後、1% BSAをプレートに入れ非特異的反応を阻害したのち、

自己反応性

IgE

抗体価測定に関しては

DPBS

で

1/10

に希釈した血清、自己反応 性

IgG

抗体価測定に関しては

DPBS

で１/1000希釈した血清をプレートに加え

2

時間インキュベートした。結合した自己反応性

IgE

もしくは

IgG

は

0.2％

ビ オチン標識抗

IgE

もしくは

0.2％

ビオチン標識抗

IgG

モノクローナル抗体と

0.5

％ HRP標識ストレプトアビジンを用いて検出した。

(39)

- 32 -

図

2 抗 dsDNA IgE

抗体価

図

2：慢性蕁麻疹患者 (102

例)、アトピー性皮膚炎患者 (29例)、健常者コント ロール (67 例)の血清抗

dsDNA IgE

抗体価を

ELISA

法で測定した。点線は抗

dsDNA IgE

抗体価のカットオフ値をを示している。カットオフ値は溶液のみの

吸光度が

0.04-0.05

前後であったためその

2

倍数であり、また吸光度が

80%で

ある

0.1

と設定した。カットオフ値以下の値は信頼性がないと考、統計学的処理 には入れていない。白丸が個人を示している。右側の線はそれぞれの中央値お よび四分位範囲を示している。

(40)

- 33 -

図

3 抗 dsDNA IgE

抗体価(年齢補正)

図

3：50

代から

80

代の慢性蕁麻疹患者をのぞいた慢性蕁麻疹患者 (77例)、健 常者コントロール (67例)の血清抗

dsDNA IgE

抗体価を

ELISA

法で測定した。

点線は抗

dsDNA IgE

抗体価のカットオフ値をを示している。カットオフ値は溶

液のみの吸光度が

0.04-0.05

前後であったためその

2

倍数であり、また吸光度が

80%である 0.1

と設定した。カットオフ値以下の値は信頼性がないと考え統計学

的処理には入れていない。白丸が個人を示している。右側の線はそれぞれの中 央値および四分位範囲を示している。

(41)

- 34 -

図

4

抗

dsDNA IgG

抗体価

図

4：慢性蕁麻疹患者 (102

例)、アトピー性皮膚炎患者 (29例)、健常者コント ロール (67例)の血清抗

dsDNA IgG

抗体価を

ELISA

法で測定した。点線は抗

dsDNA IgG

抗体価のカットオフ値をを示している。カットオフ値は溶液のみの

吸光度が

0.04-0.05

前後であったためその

2

倍数であり、また吸光度が

80%で

ある

0.1

と設定した。カットオフ値以下の値は信頼性がないと考え統計学的処理 には入れていない。白丸が個人を示している。右側の線はそれぞれの中央値お よび四分位範囲を示している。

(42)

- 35 -

図

5 抗チオレドキシン IgG

抗体価

図

5：慢性蕁麻疹患者 (102

例)、アトピー性皮膚炎患者 (29例)、健常者コント ロール (67例)の血清抗チオレドキシン IgG抗体価を

ELISA

法で測定した。点 線は抗チオレドキシン IgG抗体価のカットオフ値をを示している。カットオフ 値は溶液のみの吸光度が

0.04-0.05

前後であったためその

2

倍数であり、また吸

光度が

80%である 0.1

と設定した。カットオフ値以下の値は信頼性がないと考

え統計学的処理には入れていない。白丸が個人を示している。右側の線はそれ ぞれの中央値および四分位範囲を示している。

(43)

- 36 -

図

6 抗サイログロブリン IgG

抗体価

図

6：慢性蕁麻疹患者 (102

例)、アトピー性皮膚炎患者 (29例)、健常者コント ロール (67 例)の血清抗サイログロブリン IgG 抗体価を

ELISA

法で測定した。

点線は抗サイログロブリン IgG抗体価のカットオフ値を示している。カットオ フ値は溶液のみの吸光度が

0.04-0.05

前後であったためその

2

倍数であり、また

吸光度が

80%である 0.1

と設定した。カットオフ値以下の値は信頼性がないと

考え統計学的処理には入れていない。白丸が個人を示している。右側の線はそ れぞれの中央値および四分位範囲を示している。

(44)

- 37 -

図

7 抗 dsDNA IgE

抗体価と血清

IgE

値、罹患期間との相関関係および性差

図

7：抗 dsDNA IgE

抗体価と血清

IgE

値との相関関係はｙ＝2.4×

10

-5

(x-269)+0.350、ｒ(アール)

2＝0.00263で相関は認めなかった。抗

dsDNA IgE

抗体価と罹患期間との相関関係はｙ＝-4.6×10-5

(x-51)+0.341、ｒ(アール)

2＝

0.0004

で相関は認めなかった。抗

dsDNA IgE

抗体価と性差は

0.35 ± 0.02

対

0.34

± 0.02(男対女)で t=0.78

で性差は認めなかった。

図

表 4 CD203c を用いた好塩基球の活性化の検討 患者背景
図 2 抗 dsDNA IgE 抗体価
図 3 抗 dsDNA IgE 抗体価(年齢補正)
図 4 抗 dsDNA IgG 抗体価
+3

参照

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