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学位申請論文
BMP — 2 含有光重合型 PDVA で補強したコラーゲンスポンジによる 吸収性骨補填材
山田 知枝
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 機能再生・再建科学専攻 咬合・有床義歯補綴学分野
主任教授
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 咬合・有床義歯補綴学分野
皆木 省吾
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緒言
外傷や感染症，骨腫瘍切除などで骨欠損が生じた場合の補填材料には，自家骨，
他家骨，あるいは人工骨補填材が用いられている。自家骨は骨形成能を有し生体 親和性も高く，ゴールドスタンダードとされている1)。しかし，自家骨採取には 外科的侵襲が伴い，また採取骨量に制限がある。一方，他家骨には免疫学的問題 や倫理的問題があり，日本で認可されているものは少ない。そこで，自家骨の代 わりとなる補填材料として，人工骨補填材の開発が進められてきた。
骨再生には骨形成能，骨伝導能ならびに骨誘導能が必要である2)。骨補填材は 骨再生の足場となるため骨伝導性が求められ，さらに生体親和性，圧迫強度3)， 多孔性および生分解性を有することが望ましいとされている4)。また近年では，
骨再生を促進させる成長因子の担体としての性質も注目されている。骨形成の 細胞分化増殖因子として代表的なものに骨形成蛋白質(Bone Morphogenetic
Protein：BMP)があり，なかでもBMP—2の骨形成促進作用については多くの研 究が行われてきた5, 6)。しかしBMP—2は生体内での拡散・吸収が早いため，骨形 成能を十分に発揮させるためには，骨形成を必要とする部位にBMP—2がある一 定期間保持され，適度な速度で徐放されるような担体が必要である7, 8)。 人工骨補填材のうち無機材料としては，骨の無機質の主成分であるハイドロ
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キシアパタイト(HA)や，生体吸収性のあるリン酸三カルシウム(TCP)などが開 発されてきた。これらバイオセラミックスは生体骨と癒合し，また機械的強度に 優れるが，その硬さゆえに成形の自由度が小さいことが問題とされている。また 製作過程で焼成処理が必要なため材料内部に成長因子を含有させることはでき ず，完成後に材料表面に含浸させる方法がとられている。一方，有機材料では天 然高分子材料であるコラーゲン9, 10)や合成高分子材料であるポリグリコール酸
(PGA)とポリ乳酸の共重合体である乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)11)が用い
られている。コラーゲンスポンジやPLGAは生体親和性や生分解性に優れるが，
形状安定性に劣り骨形成のスペースメイキングとしての強度が低いため，広範 囲な骨欠損部位への適応に向けて改良が望まれる12, 13)。そこで近年，物性改善
を目的としてコラーゲンスポンジ，PLGA，低結晶性HAおよびβ—TCPなどを組 み合わせた複合材料の臨床応用が報告がされている14, 15, 16, 17)。
本研究材料のアジピン酸ジビニル(DVA)(図 1)は分子内に分解性を有するエス テル基と重合時に架橋性を示すビニル基を有するジビニルエステルモノマーで
あり，重合体 poly—DVA(PDVA)はエステル結合部で加水分解することが可能で ある。コラーゲンスポンジにDVAをコーティングして加熱重合し補強した材料 は，連通多孔性で，生分解性を示し，骨伝導性を有することが報告された 18)。 しかし加熱重合法では100℃の加熱処理を行うため，BMP—2などの成長因子を
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補填材内部に含有させることができない。
そこで本研究では熱処理を必要としない光重合型DVA を用いて，BMP—2 の 活性を維持したまま材料内部に含有する補填材の作製に取り組んだ。本研究の
目的は，コラーゲンスポンジのコラーゲン繊維にBMP—2含有光重合型DVAを コーティングして光重合処理にて作製した試料の吸収性骨補填材および BMP—
2担体としての可能性を評価することである。
材料ならびに方法
本研究に使用したDVA(JAPAN VAM & POVAL CO., LTD.，大阪)には光増感 剤としてカンファーキノン ((CQ) ; Sigma—Aldrich, USA)1.2w/v%，重合促進剤
として第 3 級アミンである 4—(ジメチルアミノ)安息香酸エチル(Ethyl 4— dimethylamino—benzoate(EDMAB) ; Sigma—Aldrich, USA)4.8w/v%を添加し た。
1．細胞毒性試験
実験① 光照射時間の設定
本研究試料の光照射時間の設定において，DVA，CQ および EDMAB の光重
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合後における細胞毒性を調べた。実験試料として，PDVA ブロック体を作製し
た。直径8 mm，厚さ2 mmのシリコーン型にDVAを注入し，ガラス板で密閉
した状態でLED光照射器(ペンキュアー，モリタ，大阪)を用いて光照射を行い，
照射時間80秒，120秒，180秒の3種類の試料を各3個作製した。
細胞はマウス骨芽細胞様細胞株 MC3T3—E1 細胞(理化学研究所バイオリソー ス研究センター，つくば)を用いた。12wellディッシュにポアサイズ1.0 µmの 透過性膜付きインサート(Falcon，USA)を設置し，コラーゲンゲル(Cellmatrix
Type I—A；新田ゼラチン，大阪)と10%FBS(Thermo Fisher Scientific，USA)含 有α—MEM(Thermo Fisher Scientific，USA)で調整した0.4 mLの三次元培地 に MC3T3—E1 細胞を 1.0×105cells 混和して播種した(図 2)。12well ディッシ ュ内に1mLの10%FBS含有α—MEMを加えて 37℃，5%CO2下で培養し，培 養液は3日毎に交換した。72時間培養後にコラーゲンゲル細胞層上に各試料を 設置し，24 時間曝露させた後に各インサート内の細胞生存率を MTS assay 法 を用いて測定した。MTS assay試薬(CellTiter 96R Aqueous Non—Radioactive
Cell Proliferation Assay；Promega，USA)400µLを添加した新しい12wellデ ィッシュに，試料を撤去した各インサートを移動させ，1時間培養後に490 nm で吸光度測定を行った。試料曝露のない細胞の生存率を100%とし，各試料に曝 露させた細胞の生存率を算出した。測定値は一元配置分散分析ののちTukey 法
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を用いて多重比較を行い，有意水準は5%とした。
実験② 本研究試料の細胞毒性試験
実験群試料(D群)は，コラーゲンスポンジ(テルプラグ，オリンパステルモバイ
オマテリアル，東京)を直径8 mm 厚さ2 mm にトリミングして，DVAに浸漬 した状態で5分間真空抜気を行い，1000 rpmで1分間の遠心分離によってDVA/
コラーゲンスポンジ質量比が 13/2 となるまで余剰 DVA を除去することで気孔
率70%とした。嫌気条件下でLED光照射器(ペンキュアー，モリタ，大阪)を用
いてDVAを光重合させ，光照射時間は実験①の結果を用いた。陽性対照として トリミングしたままのコラーゲンスポンジ，陰性対照として直径 8 mm 厚さ 2 mmにトリミングしたアクリル板(三菱レイヨン，東京)を用いた。試料は各3個 作製した。
細胞はマウス骨芽細胞様細胞株MC3T3—E1細胞を用い，細胞毒性試験は実験
①と同様の手順で行った。実験結果は一元配置分散分析ののちTukey 法を用い て多重比較を行い，有意水準は5%とした。
2．骨石灰化実験
PDVAブロック体は，直径8 mm，深さ2 mmのシリコーン型にDVAを注入 し，ガラス板で密閉した状態で180秒間光重合して作製した。
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PDVA ブロック体を 24well プレート底面に瞬間接着剤(アロンアルフア；東 亞合成，東京)を用いて固定し，プレートごとエチレンオキサイドガス滅菌を行 った後，プレート底面および試料表面をウシ血漿由来フィブロネクチン(富士フ
イ ル ム 和 光 純 薬, 大 阪)で コ ー テ ィ ン グ し た 。MC3T3—E1 細 胞 を 1.0× 105cells/well播種し，10%FBS 含有α—MEM 培地を用いて37℃，5%CO2下で 培養し，3日毎に培地交換を行った。コンフルエントに達した後は，石灰化誘導 因子(50 µg/mL アスコルビン酸および 10 mM/Lβ—グリセロリン酸)を含む
10%FBS 含有α—MEM 培地で培養し，3 日毎に培地交換を行った。28 日後に
95%エタノールで 10 分間固定し，超純水で洗浄後，1%アリザリンレッド S
(Sigma—Aldrich, USA)溶液で30分間染色した。
3．3点曲げ試験
実験群(D群)はコラーゲンスポンジを2×2×25 mmにトリミングし，DVAに 浸漬した状態で5分間真空抜気を行った後，キムワイプ(日本製紙クレシア，東
京)上で DVA/コラーゲンスポンジ質量比が 13/2となるまで余剰 DVA を表層か
ら除去することで気孔率70%とし，その後嫌気条件下で180秒間光重合し作製 した。対照群はトリミングしたままのコラーゲンスポンジとした。オートグラフ (Instron 5500R Model1125；INSTRON，USA)を用いて，支点間距離20 mm，
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クロスヘッドスピード0.5 mm/min の条件下において各試料5個に対して 3点 曲げ試験を行った。得られた最大曲げ応力について t 検定を行い，有意水準は 5%とした。
4．動物埋入試験
細胞毒性試験に用いたD群試料に加え，BMP—2含有DVAを用いたDB群試 料を作製した。DB群試料は，直径8 mm厚さ 2 mmにトリミングしたコラー ゲンスポンジをDVAに浸漬し，1500 rpmで 1分間の遠心分離によってDVA/
コラーゲンスポンジ質量比を 4/1 として嫌気条件下で 180 秒間光照射した後，
rhBMP—2(10 μg/10µLDVA，PEPROTECH，USA)を含有させたDVAを滴下し，
DVA/コラーゲンスポンジ質量比が 13/2 となるまで遠心分離を行い気孔率 70%
とし，2回目の光重合を行った。対照群試料はトリミングしたままのコラーゲン スポンジとした。
動物は8週齢(230—250 g)のWistar系雄性ラット(日本SLC，浜松)45匹を用 い，対照群，D群，DB群の3群に無作為に配分した。ラットは12時間毎の明 暗サイクルの飼育室内において硬性試料(MF；オリエンタル酵母工業株式会社，
東京)および水分を自由摂取できる環境で飼育した。塩酸メデトミジン 0.15 mg/kg(メデトミン注；Meiji Seika ファルマ，東京)＋ミダゾラム2 mg/kg(ミダ
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ゾラム注；SANDOZ，東京)＋酒石酸ブトルファノール2.5 mg/kg(ベトルファー
ル；Meiji Seika ファルマ，東京の3種混合麻酔薬の腹腔内投与による全身麻酔
を行い，手術部位の剃毛，70%エチルアルコールによる消毒，リドカイン(オー ラ注歯科用カートリッジ；昭和薬品化工，東京)による局所麻酔を行った。正中 矢状縫合に沿ってメスで皮膚を切開し，骨膜を鈍的に剥離挙上して，頭蓋骨上正
中に試料を位置付けた。骨膜を7—0 絹糸で，皮膚を5—0絹糸で縫合後，手術を 終了した。術後感染防止のためアンピシリンナトリウム(アミぺニックス；共立
製薬，東京)100 mg/kgを5日間腹腔内投与した。なお，本実験は岡山大学動物 実験委員会の指針に従い，同委員会の承認(OKU—2017021)のもとで実施した。
術後1，2および4ヶ月後に各群5匹ずつに対して3種混合麻酔薬腹腔内投与 による全身麻酔を行い，0.1MPBS(pH：7.4)を用いて灌流・脱血し，4%パラホル ムアルデヒド(PFA)含有 PBS(pH7.4)を用いて通法に従い灌流固定を施した。埋 入試料は頭頂骨と一塊として摘出し，中央で切断器(BS—3000；EXAKT，
Germany)を用いて前後に2等分して，前方はパラフィン標本，後方は非脱灰研
磨標本とした。
1) パラフィン標本
採取した組織を4%PFAにて固定後，プランク・リクロ脱灰液で迅速脱灰を行 った。通法に従いパラフィン包埋，6 µm厚の切片を作製後，ヘマトキシリン・
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エオジン(H—E)染色を行い，光学顕微鏡を用いて病理組織学的観察を行った。
2) 非脱灰研磨標本
採取した組織をVillanueva骨染色後，通法に従いメタクリル酸(MMA)に包埋 し，樹脂ブロックを切断器で薄切した。自動研磨器(MG—4000；EXAKT， Germany)にて 100 µm厚まで研磨した後，蛍光顕微鏡(OPTIPHOT；Nikon，
東京)およびイメージングソフトウェア(cellSence；オリンパス，東京)を用いて 骨形態計測を行った。骨量(BV)，組織量(TV)を一次計測した後，計算インデック スにおける骨量(BV/TV)%を算出した。計測結果は二元配置分散分析ののち
Tukey法を用いて多重比較を行い，有意水準は5%とした。
結果
1．細胞生存率
実験① 光照射時間の設定(図3)
細胞生存率は，試料曝露のない場合と比較して80秒および120秒照射試料を 曝露した場合には有意に低下したが，180 秒照射試料では有意差は認められな かった。この結果より，本研究試料の光照射時間は180秒に設定した。
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実験② 本研究試料の細胞毒性試験(図4)
細胞生存率は，曝露のない細胞と比較して，対照群および D 群では有意差を 認めなかったが，アクリル板では有意に低い値を示した。
2．骨石灰化実験(図5)
アリザリンレッド染色の結果，PDVAブロック体試料表面は赤く染色され，石 灰化物の沈着が認められた。
3．3点曲げ試験(図6)
対照群および D 群の最大曲げ応力はそれぞれ 0.054±0.023 MPa，0.454±
0.049 MPaであり，D群は対照群と比較して有意に高い値を示した。
4．動物埋入実験
コラーゲンスポンジのみを埋入した対照群では，1ヶ月後において試料は完全 吸収されたが，D群および DB 群では 4ヶ月後においても試料の形態が保たれ ていた(図7)。
1 )H—E染色(図8)
対照群では，1ヶ月後において試料は完全に吸収され，全観察期間を通して新
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生骨の形成は認められなかった。
D群，DB群では全観察期間において試料内全体への細胞浸潤，既存骨表面か ら試料内部への部分的な新生骨の形成が認められた。D 群では 2 ヶ月後までは 新生骨量は増加したが，その後はほぼ同程度であった。一方，DB群では観察期 間を通して新生骨量は増加傾向を示した。
また，両群ともに観察期間内で試料内全体を新生骨で埋めることはなく，全観
察期間を通して試料内に部分的にPDVAが残存した。
2) 骨形態計測(図9)
骨量(BV/TV)%はD群，DB群ともに1ヶ月後と比較して2ヶ月後および4ヶ 月後において有意に高値を示した。DB群の新生骨量は観察期間を通して増加し た。D群とDB群の新生骨量を比較すると，1ヶ月後および2ヶ月後には有意差 を認めなかったが，4ヶ月後にはDB群ではD群より有意に高値を示した。
考察
本研究ではDVAの生分解性に注目して，吸収性骨補填材およびBMP—2の担 体としての有用性を検討するため重合方法として光重合を選択し，光増感剤と
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してCQ，重合開始剤としてEDMAB を添加した。
歯科用光重合レジンにも利用されているCQやEDMABなどの重合促進剤は，
重合前には細胞毒性を示すが，光照射時間の延長に伴い毒性が減弱することが 知られている 19)。その理由としては，重合促進剤は光照射後にはポリマーの末 端に取り込まれて光照射前の重合促進剤とは異なる構造を示し 20)，また，重合 体のポリマーネットワークが堅固であれば光増感剤や未反応の重合促進剤の溶 出量が制限されると報告されているからである21)。
一般的な歯科用光重合レジンには CQ が 0.17～1.03w/w%添加され 17)，重合 促進剤がCQ の量に対応して調整されると報告されている 20)。本研究試料では PDVAの物性を向上する目的で，CQを1.2w/v%，EDMAB を4.8w/v%添加し ており 22)，歯科用光重合レジンと比較すると高濃度である。そのため，まず光 重合後の試料における細胞毒性の検討が必要であった。
そこで，光照射時間を80秒，120秒，180秒と変えた試料を作製し，細胞毒 性試験を行った。その結果，細胞生存率は試料曝露のない場合と比較して80秒 および 120 秒照射試料を曝露した場合には有意に低下したが，180 秒照射試料 の曝露では有意差は認められなかった。したがって，180秒の光照射試料によっ て重合反応は十分に進み，未反応の EDMAB が減少するとともに，CQ を含む 未反応化合物が溶出しない物性に達していると考えられた。そこで本研究では
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可及的に細胞毒性を減少させるため，光照射時間は180秒に設定した。さらに，
光照射後の本研究の試料が低い細胞毒性を示した理由として，試料の厚みが 2 mmと薄く，表面にコーティングしたDVAも透明であったため照射光は試料全 体に達し，また嫌気環境下で光照射することで試料表面の未重合層を最小限に することができたことが考えられる。しかし本研究の細胞毒性試験において反 省すべき点として，陰性対照として選択したアクリル板の毒性が低かったこと が挙げられる。アクリル板は一般的に細胞毒性のないものとして採用されるこ とが多く，本細胞毒性実験の陰性対照としては不適切であったと考えられ，手法 および結果の妥当性を明確にするためには明らかな毒性を示す試料を陰性対照 として選択するべきであった。
また，フィブロネクチンでコーティングしたPDVAブロック体上での骨芽細 胞の増殖および石灰化物沈着を認めたことからも，本研究試料は細胞毒性が低 く，生体内で骨芽細胞が接着し骨再生の足場となる可能性があることが示唆さ れた。
3点曲げ試験においてD群は対照群より有意に高い物性を示し，また動物埋 入試験においてDB群試料は4ヶ月後時点でも骨膜下で試料の形態を保ってい たことから，本研究試料は骨再生の足場としての強度を有することが分かっ た。
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骨再生の足場材料として細胞群に十分な栄養と酸素を供給するためには多孔
構造である必要があり23)，大きさ約20～30 µmの骨芽細胞が分化・増殖しネ ットワークを形成するのに必要な孔径はその10倍の300～400 µmであるとい われている24)。本研究で使用したコラーゲンスポンジの繊維を加熱重合PDVA によってコーティングして気孔率70%とした補填材は，SEM画像より孔径50
～150 µmの多孔構造を有していた18)。本研究試料においても，HE染色の結
果からD群およびDB群の試料内全体に線維性組織の侵入が認められており，
細胞増殖が可能なサイズの連通孔構造を有することが示された。しかし，試料
内の一部に填塞されたPDVAは，コーティング前のコラーゲンスポンジの空隙 形状や表面張力の影響によって遠心分離で十分に除去できなかったDVAが空 隙内に残存したものと考えられ，気孔径の形状に関して今後検討する必要があ る。
骨形態計測の結果，D群の骨量は2ヶ月以降増加しなかったが，DB群では 観察期間を通して増加傾向を示した。また，2ヶ月後のD群とDB群の骨量に 有意差は認められなかったが，4ヶ月後におけるDB群の骨量はD群より有意 に高値を示した。清瀧は生体埋入したPDVA周囲にはエステラーゼが認められ ることを示し，加水分解されたPDVAはジカルボン酸であるアジピン酸とビニ ルアルコールの複合体に分解され，最終的には生体内で吸収，排泄されていく
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と推察した18)。このように本研究で用いたPDVAは動物埋入後に徐々に生体 内で分解され，DB群では徐放されたBMP—2が生物学的活性を保ち骨形成を 持続したと考えられた。しかし，本研究では観察期間内に試料内全体を新生骨
で埋めることはなく，またPDVAの完全な吸収も認められなかった。その要因 として，重合率が高い高分子では分解吸収速度が遅く低分子化に時間を要する
ため25)，PDVAから放出されるBMP—2量が少なかったものと考えられる。効 率的により多くの骨を形成させるには，BMP—2の徐放速度をコントロールし
て有効な濃度に保つことが求められるため，その担体であるPDVAの分解・吸 収速度を調整する必要がある。今後は，PDVAがBMP—2などの成長因子の担 体として効果的に分解・吸収される重合率を決定するために，添加する光重合 触媒の濃度や光照射時間などの条件を変えた試料を作製して，PDVAの重合 率，生体適合性，強度，生体内での骨形成量などを検討する必要がある。
結論
BMP—2 含有光重合型 PDVA でコラーゲン繊維を補強したコラーゲンスポン
ジは，生体適合性と骨伝導性および BMP—2 徐放による骨誘導性を示したこと
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から，骨補填材ならびにBMP—2担体として有用である可能性が示唆された。
謝辞
本論文を作成するにあたり，温かい御指導と激励を賜りました岡山大学大学 院医歯薬総合研究科咬合・有床義歯補綴学分野の皆木省吾教授に深く御礼申し 上げます。また，本研究を遂行するにあたり，終始懇切なる御指導を頂きまし た岡山大学大学院医歯薬総合研究科咬合・有床義歯補綴学分野の原哲也准教 授，貴重なご教授を賜りました昭和大学歯学部歯科保存学歯科理工学部門の田 仲持郎助教に心より感謝申し上げます。最後に，本研究を行うにあたり御助 言，御協力いただきました岡山大学大学院医歯薬総合研究科咬合・有床義歯補 綴学分野ならびに岡山大学病院咬合・義歯補綴科の諸先生方に謹んで感謝の意 を表します。
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24) Tsuruga, E., Takita, H., Itoh, H., Wakisaka, Y. and Kuboki, Y.: Pore size of porous hydroxyapatite as the cell substratum controls BMP-induced osteogenesis. J. Biochem., 2, 317-324, 1997.
23
25) 山中克之, 坂井裕大, 山本克史, 重光勇介, 金子正 : PLGA scaffoldを用 いた三次元培養軟骨の作製. Medical Science Digest., 39, 596-599, 2013.
表題脚注
岡山大学大学院医歯薬総合研究科 機能再生・再建科学専攻 口腔・顎・顔面 機能再生制御学講座 咬合・有床義歯補綴学分野(主任：皆木省吾教授)
本論文の一部は，第127回日本補綴歯科学会学術大会(2018年6月，岡山)にお いて発表した。
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図表の説明
図1 DVAの構造式
図2 三次元培養
(a)12wellディッシュ (b)インサート (c)10%FBS含有α—MEM (d)MC3T3E—1細胞 (e)コラーゲンゲル (f)試料
図3 細胞生存率(実験① 光照射時間の設定)
図4 細胞生存率(実験② 本研究試料の細胞毒性試験)
図5 アリザリンレッド染色
PDVAブロック体表面においてMC3T3—E1細胞を石灰化誘導因子含有培地で 28日間培養し，アリザリンレッド染色を行った結果，PDVAブロック体試料表 面は赤く染色され，石灰化物の沈着が認められた。
図6 最大曲げ応力
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図7 動物埋入試験DB群4ヶ月後の骨膜下の試料
4ヶ月後においても頭蓋骨上に埋入した試料の形態は保たれていた。
図8 H—E染色
対照群：1ヶ月時点でコラーゲンスポンジは完全に吸収され，新生骨の形成は 認められなかった。
D群：試料内には線維性組織，新生骨(黒色矢印)，PDVA(白色矢印)を認めた。
DB群：試料内には線維性組織，新生骨(黒色矢印)，PDVA(白色矢印)を認め，
観察期間を通して新生骨の増加傾向を示した。
bar：200µm
図9 骨量(BV/TV)
D群：1ヶ月後と比較して2，4ヶ月後は有意に高値を示した。
DB群：1ヶ月後と比較して2，4ヶ月後は有意に高値を示した。4ヶ月後にお いてD群より有意に高値を示した。
