－ 109 － Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Diseasein Farm Animals Vol.5 No.3 2010 Immune function and mammary gland immunity in cows
末梢血中の白血球や T 細胞サブセットの存 在比率やバランスは、免疫応答を把握する上で 重要な指標となるが、ウシの末梢血における白 血球（顆粒球、T 細胞、B 細胞、単球）および T 細胞サブセット (CD4+、CD8+、γδT細胞 ) の出現割合は十分に把握されていない。 ウ シ γ δ T 細 胞 は、Workshop Cluster 1（WC1）と CD8 の発現パターンによって、 WC1+CD8－γ δ T 細 胞、WC1ーCD8+γ δ T 細胞と WC1－CD8－γδ T 細胞のサブセッ トに分類され、WC1 と CD8 を共に発現する γ δ T 細 胞 は 存 在 し な い。WC1 分 子 は、 215kDa の膜糖タンパク質であり、ウシのγ δ T 細胞でのみ発現し、ヒトやマウスの T 細 胞では認められない。機能的には、IL-2 のシ グナルを制御することでγδ T 細胞の増殖を 抑制することが知られている。また、WC1+ γδ T 細胞はレプトスピラやマイコバクテリ アなどの感染病原体を認識して、活性化や増殖 を行う。さらに、WC1+γδ T 細胞は、子ウ シの末梢血中に非常に高い割合で存在すること から、幼若期のウシの免疫機能の恒常性の維持 に重要な役割を持つと考えられている。CD8+ γδ T 細胞は脾臓や粘膜組織に多く存在し、 マイクロアレイ解析では WC1+γδ T 細胞が WC1－γδ T 細胞より細胞増殖に関連した遺 伝子の発現が高いことが報告されている。した がって、WC1 分子の発現の有無が、ウシのγ δ T 細胞サブセットの機能に深く関与してい ることが予想される。一方で、乳腺ではγδ T
山口高弘
東北大学大学院農学研究科 （〒 981-8555 仙台市青葉区堤通雨宮町１－１）ウシの免疫機能と乳腺免疫
総 説 細胞は免疫抑制的に作用している。しかしなが ら、ウシのγδ T 細胞サブセット機能の詳細 は十分に理解されていない。 シンポジウムでは、ウシの末梢血での T 細 胞サブセット、γδ T 細胞サブセットの存在 割合、機能的特性と乳腺免疫に関する我々の知 見を中心に紹介する。 １）ウシ末梢血の白血球とT細胞サブセットの 出現割合 黒毛和種の 1 ヵ月齢の子牛において、雌で は顆粒球が、雄では T 細胞がそれぞれ高い出 現率を示した。B 細胞と単球の割合、T/B 細 胞比に雌雄間の有意な差は認められなかった。 2 ヶ月齢の雌において、顆粒球の割合が 1 ヶ 月齢の 47.3％から 2 ヶ月齢の 33.0％に、B 細胞の割合が 12.3％から 23.5％に有意に変化 した。T 細胞割合の変化は認められなかった。 その結果 T/B 細胞比は 2.4 から 1.4 に低下 した。 T 細胞サブセットの出現割合は、雌雄間で有 意な差は認められず、CD4+/CD8+T 細胞比は 雌雄ともに 2 以上であった。1 ヵ月齢から 2 ヶ月齢にかけて、雄のγδ T 細胞の割合が 53.2％から 42.1％に有意に減少し、なかでも WC1+γδ T 細胞の割合が著しい減少を示し た。これらのことから、黒毛和種新生子牛では、 雌雄間の免疫応答に違いがある可能性が示さ れた。 一方、育成過程の日本短角種牛では、顆粒 図１ 末梢血 T 細胞サブセットの出現割合ウシの免疫機能と乳腺免疫 球は 20.8 ～ 24.3%、T 細胞は 33.5 ～ 42.7%、 B 細胞は 28.5 ～ 36.2%、単球は 6.9 ～ 8.9% で推移し、有意な変動は認められなかった。T 細胞サブセットの割合は、γδ T 細胞が最も 高く 43.4 ～ 48.3%で、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞の順であり、γδ T 細胞では WC1+γδ T 細胞が優勢を占めた。CD4+/CD8+T 細胞比 は 1.5 以下であった。また、CD25 陽性の活 性型 T 細胞は WC1+γδ T 細胞で最も高く出 現した。このとから、日本短角種牛は同月齢の 黒毛和種牛に比べてγδ T 細胞の割合が高く、 CD4+/CD8+T 細胞比がやや低いことが示され た。以上より、ウシの品種によって末梢血の白 血球ならびに T 細胞サブセットの存在割合が 異なることが示された。 ２）末梢血γδ T 細胞サブセットの出現割合 と形態学的特徴 黒毛和種牛の末梢血γδ T 細胞サブセット の割合を解析したところ、WC1+γδ T 細胞は、 成長に伴って有意に減少したが、CD8+γδ T 細胞は、成長に伴う変動はなく、一定して低い 割合であった（図１）。このことから、成長に 伴うγδ T 細胞の割合の低下は、主に WC1+ γδ T 細胞の低下に起因することが示された。 また、CD4+T 細胞は成長に伴って増加したが、 CD8+T 細胞の割合には変動が見られなかった。 γ δ T 細 胞 サ ブ セ ッ ト を Magnetic cell sorting（MACS）法により、WC1＋γδ T 細 胞と WC1－γδ T 細胞とに調整し、形態学的 特徴を観察した。光学顕微鏡下ではこれらサブ セットの染色性に大きな違いは見られなかっ た。透過型電子顕微鏡下で、WC1＋γδ T 細 胞は比較的大きく、核が多形で分葉しているも のが認められ、ユークロマチンが多く、細胞小 器官の発達が観察された。一方、WC1－γδ T 細胞は比較的小さく、核は卵円形をしており、 細胞質の発達は乏しかった。 ３）末梢血γδ T 細胞サブセットの機能特性 MACS 法 で 調 整 し た WC1＋γ δ T 細 胞 と WC1－γ δ T 細 胞 に、FITC 標 識 の Concanavalin A（ConA）を添加して 12 時 間後の結合能を測定した。その結果、WC1＋ γ δ T 細 胞 の ConA 結 合 能 は WC1－γ δ T 細胞より高かった（図２）。このことから、末 梢血γδ T 細胞サブセットは細胞表面の糖鎖 構造に違いがあることが示された。そこで、 ConA 刺激 (24 時間 ) 下で T 細胞活性化マー カー（IL-2R α）の発現を解析したところ、 WC1＋γδ T 細胞は無刺激状態で Il-2R αの 発現が高く、ConA 刺激によってさらに発現が 増強されることが判明した。一方、WC1－γ δ T 細胞は ConA 処理でほとんど影響が認め られなかった。 次に、同様に分離した WC1＋γδ T 細胞と WC1－γδ T 細胞の ConA 刺激 (12 時間 ) 下 でのサイトカイン mRNA 発現を解析した。そ の結果、WC1＋γδ T 細胞は、IFN- γ、GM-CSF、TNF- β、IL-2、IL-6、TNF- α、TGF-βの mRNA を発現した。一方、WC1－γδ T 細胞は ConA 刺激の有無に関わらず TGF- β の mRNA のみ発現しており、その他のサイト カインの mRNA 発現は認められなかった。 2 ኬᏘൔƸᩀᨺƱNjƴ ˌɥưƋƬƨŵ ȵ உᱫƔǒ ȶஉᱫƴƔƚƯŴᨺƷ6 ኬ ᏘƷлӳƕ ᲟƔǒ Ჟƴஊॖƴถ ݲƠŴƳƔưNj 9% 6 ኬᏘƷлӳƕ ถݲǛᅆƠƨŵƜƷƜƱƸŴ᱅ൗԧᆔૼဃ ܇ཅƴƓƍƯŴᩀᨺ᧓ưβ၃ࣖሉƴᢌƍƕ ƋǔӧᏡࣱǛᅆƢŵ ɟ૾ŴᏋᢅᆉƷଐஜჺᚌᆔཅưƸŴ᫄ ቩྶƸ ᳸Ŵ6 ኬᏘƸ ᳸ Ŵ$ ኬᏘƸ ᳸ŴҥྶƸ ᳸ưਖ਼ᆆƠŴஊॖƳ٭ѣƸᛐNJǒ ǕƳƔƬƨŵ6 ኬᏘǵȖǻȃȈƷлӳƸŴ 6 ኬᏘƕஇNj᭗Ƙ ᳸ưŴ %& 6 ኬᏘŴ%& 6 ኬᏘƷưƋǓŴ 6 ኬᏘưƸ 9% 6 ኬᏘƕΟѬǛҩ NJƨŵ%& %& 6 ኬᏘൔƸ ˌɦư ƋƬƨŵLJƨŴ%& ࣱᨗƷࣱ 6 ኬᏘ Ƹ 9% 6 ኬᏘưஇNj᭗ƘЈྵƠƨŵ ƜƷƱƔǒŴଐஜჺᚌᆔཅƸӷஉᱫƷ᱅ൗ ԧᆔཅƴൔǂ6 ኬᏘƷлӳƕ᭗ƘŴ %& %& 6 ኬᏘൔƕǍǍ˯ƍƜƱƕᅆ ƞǕƨŵƜƷƜƱƸŴǦǷƷԼᆔƴǑƬƯ ఴᘉƷႉᘉྶƳǒƼƴ 6 ኬᏘǵȖǻȃȈ Ʒ܍נлӳƕီƳǔƜƱǛᅆƢŵ ᲬᲣఴᘉ6 ኬᏘǵȖǻȃȈƷЈྵл ӳƱ࢟७ܖႎཎࣉ ᱅ൗԧᆔཅƷఴᘉ6 ኬᏘǵȖǻȃ ȈƷлӳǛȕȭȸǵǤȈȡȸǿȸưᚐௌƠ ƨƱƜǖŴ9% 6 ኬᏘƷлӳƸŴ ᧈƴˤƬƯஊॖƴถݲƠƨƕŴ%& 6 ኬᏘƷлӳƸŴᧈƴˤƏ٭ѣƸƳƘŴɟ ܭƠƯ˯ƍлӳưƋƬƨᲢᲫᲣŵƜƷƜƱ ƔǒŴᧈƴˤƏ6 ኬᏘƷлӳƷ˯ɦ ƸŴɼƴ 9% 6 ኬᏘƷ˯ɦƴឪ׆Ƣ ǔƜƱƕᅆƞǕƨŵLJƨŴ%& 6 ኬᏘƸ ᧈƴˤƬƯفьƠƨƕŴ%& 6 ኬᏘƷлӳ ƴƸ٭ѣƕᙸǒǕƳƔƬƨŵ 6 ኬᏘǵȖǻȃȈǛ /CIPGVKE EGNN UQTVKPIᲢ/#%5ᲣඥƴǑǓŴ9%Ქ6 ኬᏘƱ 9%Ყ6 ኬᏘƱƴᛦૢƠŴ࢟७ ܖႎཎࣉǛᚇݑƠƨŵήܖ᫋ࣇᦟɦưƸƜ ǕǒǵȖǻȃȈƷ௨ᑥࣱƴٻƖƳᢌƍƸᙸ ǒǕƳƔƬƨŵᡢᢅᩓ܇᫋ࣇᦟɦưŴ 9%Ქ6 ኬᏘƸൔ᠋ႎٻƖƘŴఋƕٶ ࢟ưЎᓶƠƯƍǔNjƷƕᛐNJǒǕŴȦȸǯ ȭȞȁȳƕٶƘŴኬᏘݱ֥ܫƷႆᢋƕᚇݑ ƞǕƨŵɟ૾Ŵ9%Ყ6 ኬᏘƸൔ᠋ႎ ݱƞƘŴఋƸό࢟ǛƠƯƓǓŴኬᏘឋƷႆ ᢋƸʅƠƔƬƨŵ ᲭᲣఴᘉ6 ኬᏘǵȖǻȃȈƷೞᏡཎ ࣱ /#%5 ඥưᛦૢƠƨ 9%Ქ6 ኬᏘ Ʊ 9%Ყ 6 ኬ Ꮨ ƴ Ŵ (+6% ᜤ Ʒ %QPECPCXCNKP#Ტ%QP#ᲣǛชьƠƯ ᧓ࢸƷ %QP# ኽӳᏡǛยܭƠƨŵƦƷኽ ௐŴ9%Ქ6 ኬᏘƷ %QP# ኽӳᏡƸ 9%Ყ6 ኬᏘǑǓ᭗ƔƬƨᲢᲬᲣŵƜ 0 20 40 60 80 100 0.5 1 2 6 12 18 adult 䠄36䡚41䠅 CD4䠇㼀⣽⬊ CD8䠇㼀⣽⬊ ᭶ 㱋 ྜ 䠄 䠂 䠅 a-c䠖p䠘0.05 ab a ab ab a ab b A B 0 20 40 60 80 100 0.5 1 2 6 12 18 adult ᭶ 㱋 ྜ 䠄 䠂 䠅 WC1WC1CCD8D8䠇䠇䠇䠇JGJGJGJG JG JG a-c:p<0.05 x-z:p<0.05 ab abc x a x y ab x ab y yz bc c z ᅗ䠍㻌 ᮎᲈ⾑ 㼀 ⣽⬊䝃䝤䝉䝑䝖䛾ฟ⌧ྜ㻌 図１ 末梢血 T 細胞サブセットの出現割合
－ 111 － Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Diseasein Farm Animals Vol.5 No.3 2010 Immune function and mammary gland immunity in cows
さらに、WC1＋γδ T 細胞と WC1－γδ T 細胞のアポトーシス関連遺伝子発現について 検討した。アポトーシス抑制遺伝子（Bcl-xL、 Bcl-2）の mRNA 発現は WC1＋γδ T 細胞で 認められ、WC1ーγδ T 細胞では認められな か っ た。 一 方、 ア ポ ト ー シ ス 誘 導 遺 伝 子 （caspase-3、caspase-8）の mRNA 発現は、 WC1＋γδ T 細胞と WC1ーγδ T 細胞でとも に発現した。これらのことから、WC1＋γδ T 細胞と WC1－γδ T 細胞ではアポトーシス の 誘 導 は 起 こ る が、WC1＋γ δ T 細 胞 で は WC1ーγδ T 細胞とは異なり、アポトーシス の抑制機能が働くことが示された。 以上のことから、ウシ末梢血中のγδ T 細 胞は、WC1 分子の発現の有無により機能が異 なり、WC1＋γδ T 細胞は活性化状態で機能 的であること、WC1ーγδ T 細胞は不活性化 状態であることが判明した。 ４）γδ T 細胞サブセットの活性化に伴う機 能的特徴 IL-2 は T 細胞の増殖と分化を促すサイトカ インである。そこで、ウシγδ T 細胞サブセ ットを IL-2 で刺激し、活性化に伴うこれらの サブセットのエフェクター細胞への分化と活性 化したサブセットの機能的特徴を解析した。 末 梢 血 単 核 球（PBMC） を IL-2（20U/ ml）で刺激を行い、γδ T 細胞サブセットの 割合変化を検討した。WC1＋γδ T 細胞は刺 激 1 日目以降有意に増加した（図 3）。IL-2 刺 激したγδ T 細胞サブセットでの IL-2R αの 発現は、1 日目で WC1＋γδＴ細胞が約 75% であるのに対し、WC1ーγδＴ細胞は約 30% であった。このことから、WC1＋γδ T 細胞 は IL-2 の刺激に対して WC1ーγδＴ細胞より 速やかに活性化されることが示された。増殖活 性 は IL-2 刺 激 を し た WC1＋γ δ T 細 胞 で、 WC1－γδ T 細胞より高いことが示された。 細胞傷害活性に関連する遺伝子発現は、WC1 ＋γδ T 細胞と WC1ーγδ T 細胞では共に、
IL-2 刺 激 に よ り Perforin と GranzymeB の mRNA 発現が増加し、また IL-2 の刺激の有無 に関わらず、恒常的に Bo-lysin と NKp46 の mRNA を発現した。 以上のことから、IL-2 刺激により WC1＋γ δ T 細胞が速やかに活性化され、エフェクタ ー細胞に分化することが示された。 ５）ウシの乳腺での免疫機能 ウシの乳腺内には腸管のようなリンパ組 織は存在しない。しかしながら、末梢血に比 べ T 細胞の存在割合が高く、乳腺上皮細胞 間 に は リ ン パ 球 (mammary intraepithelial lymphocytes: mIEL) が存在する。この mIEL がサイトカインを介して乳腺上皮細胞の機能に 影響し、また mIEL 存在様式が泌乳期と乾乳期 で異なる。そこで、mIEL のサイトカイン産生 と乳腺上皮細胞との相互作用、乳腺上皮細胞で の Toll like receptor (TLRs) の発現と TLRs を介する免疫作用について検討した。 3 ƷƜƱƔǒŴఴᘉ6 ኬᏘǵȖǻȃȈ ƸኬᏘᘙ᩿ƷኄᦋನᡯƴᢌƍƕƋǔƜƱƕ ᅆƞǕƨŵƦƜưŴ%QP# Хນ ᧓ ɦư 6 ኬᏘࣱ҄ȞȸǫȸᲢ+.4ᲣƷ ႆྵǛᚐௌƠƨŵ9%Ქ6 ኬᏘƸХ ນཞ७ư +N4Ʒႆྵƕ᭗ƘŴ%QP# Х ນƴǑƬƯƞǒƴႆྵƕفࢍƞǕǔƜƱƕ ЙଢƠƨŵɟ૾Ŵ9%Ყ6 ኬᏘƸ %QP# ϼྸưDŽƱǜƲࢨ᪪ƕᛐNJǒǕƳƔƬƨŵ ഏƴŴӷಮƴЎᩉƠƨ 9%Ქ6 ኬᏘ Ʊ 9%Ყ6 ኬᏘǛ %QP# Хນ ᧓ ɦưƷǵǤȈǫǤȳ O40# ႆྵǛᚐௌ ƠƨŵƦƷኽௐŴ9%Ქ6 ኬᏘƸŴ+(0 Ŵ)/%5(Ŵ60(Ŵ+.Ŵ+.Ŵ60( Ŵ6)(Ʒ O40# ǛႆྵƠƨŵɟ૾Ŵ 9%Ყ6 ኬᏘƸ %QP# ХນƷஊƴ᧙ ǘǒƣ 6)(Ʒ O40# ƷLjႆྵƠƯƓ ǓŴƦƷ˂ƷǵǤȈǫǤȳƷ O40# ႆྵ ƸᛐNJǒǕƳƔƬƨŵ ƞǒƴŴ9%Ქ6 ኬᏘƱ 9%Ყ 6 ኬᏘƷǢȝȈȸǷǹ᧙ᡲᢡˡ܇ႆྵƴƭ ƍƯ౨᚛ƠƨŵǢȝȈȸǷǹ৮Сᢡˡ܇ Ტ$ENZ.Ŵ$ENᲣƷ O40# ႆྵƸ 9% Ქȷȷ 6 ኬᏘưႆྵƠŴ9%ȸ6 ኬᏘ ưƸႆྵƠƳƔƬƨŵɟ૾ŴǢȝȈȸǷǹ ᛔݰᢡˡ܇ᲢECURCUGŴECURCUGᲣ Ʒ O40# ႆྵƸŴ 9%Ქ6 ኬᏘƱ 9%ȸ6 ኬᏘưƱNjƴႆྵƠƨŵƜǕ ǒƷƜƱƔǒŴ9%Ქ6 ኬᏘƱ 9%Ყ 6 ኬᏘưƸǢȝȈȸǷǹƷᛔݰƸឪƜ ǔƕŴ9%Ქ6 ኬᏘưƸ 9%ȸ6 ኬᏘƱƸီƳǓŴǢȝȈȸǷǹƷ৮СೞᏡ ƕƘƜƱƕᅆƞǕƨŵ ˌɥƷƜƱƔǒŴǦǷఴᘉɶƷ6 ኬᏘƸŴ9% Ў܇ƷႆྵƷஊƴǑǓೞ ᏡƕီƳǓŴ9%Ქ6 ኬᏘƸࣱ҄ཞ ७ưೞᏡႎưƋǔƜƱŴ9%ȸ6 ኬᏘ Ƹɧࣱ҄ཞ७ưƋǔƜƱƕЙଢƠƨŵ ᲮᲣ6 ኬᏘǵȖǻȃȈƷࣱ҄ƴˤƏ ೞᏡႎཎࣉ +. Ƹ 6 ኬᏘƷف഻ƱЎ҄Ǜ̟ƢǵǤȈ ǫǤȳưƋǔŵƦƜưŴǦǷ6 ኬᏘǵ ȖǻȃȈǛ +. ưХນƠŴࣱ҄ƴˤƏƜ ǕǒƷǵȖǻȃȈƷǨȕǧǯǿȸኬᏘǁƷ Ў҄Ʊࣱ҄ƠƨǵȖǻȃȈƷೞᏡႎཎࣉ ǛᚐௌƠƨŵ ఴ ᘉ ҥ ఋ ྶ Ტ 2$/% Უ Ǜ +. Ტ7ONᲣưХນǛᘍƍŴ6 ኬᏘǵ ȖǻȃȈƷлӳ٭҄ǛȕȭȸǵǤȈȡȸǿ ȸư౨᚛Ơƨŵ9%Ქ6 ኬᏘƸХນ ଐႸˌᨀஊॖƴفьƠƨᲢ Უŵ+. Х ນƠƨ6 ኬᏘǵȖǻȃȈưƷ +.4 ƷႆྵƸŴ ଐႸư 9%ᲥኬᏘƕኖ ưƋǔƷƴݣƠŴ9%ȸኬᏘƸ ኖ ưƋƬƨŵƜƷƜƱƔǒŴ9%Ქ WC1+JGT⣽⬊ WC1䠉JGT⣽⬊ Con A-FITC 25.3% 7.9% ᅗ JGT ⣽⬊䝃䝤䝉䝑䝖䛾 㻯㼛㼚㻭 ⤖ྜ⬟㻌 CD4 CD8 JG CD8䠇JG WC1䠇JG WC1㻙JG 0 day 1 day 3 day 7 day 0 20 40 60 80 100 ྜ (% ) 䠆 䠆 䠆 䠆 䠆 n=3 䠆䠖p<0.05 ᅗ 㻟㻌 㻵㻸㻙㻞 ่⃭䛻䜘䜛JG䠰⣽⬊䝃䝤䝉䝑䝖䛾ㄏᑟ㻌 3 ƷƜƱƔǒŴఴᘉ6 ኬᏘǵȖǻȃȈ ƸኬᏘᘙ᩿ƷኄᦋನᡯƴᢌƍƕƋǔƜƱƕ ᅆƞǕƨŵƦƜưŴ%QP# Хນ ᧓ ɦư 6 ኬᏘࣱ҄ȞȸǫȸᲢ+.4ᲣƷ ႆྵǛᚐௌƠƨŵ9%Ქ6 ኬᏘƸХ ນཞ७ư +N4Ʒႆྵƕ᭗ƘŴ%QP# Х ນƴǑƬƯƞǒƴႆྵƕفࢍƞǕǔƜƱƕ ЙଢƠƨŵɟ૾Ŵ9%Ყ6 ኬᏘƸ %QP# ϼྸưDŽƱǜƲࢨ᪪ƕᛐNJǒǕƳƔƬƨŵ ഏƴŴӷಮƴЎᩉƠƨ 9%Ქ6 ኬᏘ Ʊ 9%Ყ6 ኬᏘǛ %QP# Хນ ᧓ ɦưƷǵǤȈǫǤȳ O40# ႆྵǛᚐௌ ƠƨŵƦƷኽௐŴ9%Ქ6 ኬᏘƸŴ+(0 Ŵ)/%5(Ŵ60(Ŵ+.Ŵ+.Ŵ60( Ŵ6)(Ʒ O40# ǛႆྵƠƨŵɟ૾Ŵ 9%Ყ6 ኬᏘƸ %QP# ХນƷஊƴ᧙ ǘǒƣ 6)(Ʒ O40# ƷLjႆྵƠƯƓ ǓŴƦƷ˂ƷǵǤȈǫǤȳƷ O40# ႆྵ ƸᛐNJǒǕƳƔƬƨŵ ƞǒƴŴ9%Ქ6 ኬᏘƱ 9%Ყ 6 ኬᏘƷǢȝȈȸǷǹ᧙ᡲᢡˡ܇ႆྵƴƭ ƍƯ౨᚛ƠƨŵǢȝȈȸǷǹ৮Сᢡˡ܇ Ტ$ENZ.Ŵ$ENᲣƷ O40# ႆྵƸ 9% Ქȷȷ 6 ኬᏘưႆྵƠŴ9%ȸ6 ኬᏘ ưƸႆྵƠƳƔƬƨŵɟ૾ŴǢȝȈȸǷǹ ᛔݰᢡˡ܇ᲢECURCUGŴECURCUGᲣ Ʒ O40# ႆྵƸŴ 9%Ქ6 ኬᏘƱ 9%ȸ6 ኬᏘưƱNjƴႆྵƠƨŵƜǕ ǒƷƜƱƔǒŴ9%Ქ6 ኬᏘƱ 9%Ყ 6 ኬᏘưƸǢȝȈȸǷǹƷᛔݰƸឪƜ ǔƕŴ9%Ქ6 ኬᏘưƸ 9%ȸ6 ኬᏘƱƸီƳǓŴǢȝȈȸǷǹƷ৮СೞᏡ ƕƘƜƱƕᅆƞǕƨŵ ˌɥƷƜƱƔǒŴǦǷఴᘉɶƷ6 ኬᏘƸŴ9% Ў܇ƷႆྵƷஊƴǑǓೞ ᏡƕီƳǓŴ9%Ქ6 ኬᏘƸࣱ҄ཞ ७ưೞᏡႎưƋǔƜƱŴ9%ȸ6 ኬᏘ Ƹɧࣱ҄ཞ७ưƋǔƜƱƕЙଢƠƨŵ ᲮᲣ6 ኬᏘǵȖǻȃȈƷࣱ҄ƴˤƏ ೞᏡႎཎࣉ +. Ƹ 6 ኬᏘƷف഻ƱЎ҄Ǜ̟ƢǵǤȈ ǫǤȳưƋǔŵƦƜưŴǦǷ6 ኬᏘǵ ȖǻȃȈǛ +. ưХນƠŴࣱ҄ƴˤƏƜ ǕǒƷǵȖǻȃȈƷǨȕǧǯǿȸኬᏘǁƷ Ў҄Ʊࣱ҄ƠƨǵȖǻȃȈƷೞᏡႎཎࣉ ǛᚐௌƠƨŵ ఴ ᘉ ҥ ఋ ྶ Ტ 2$/% Უ Ǜ +. Ტ7ONᲣưХນǛᘍƍŴ6 ኬᏘǵ ȖǻȃȈƷлӳ٭҄ǛȕȭȸǵǤȈȡȸǿ ȸư౨᚛Ơƨŵ9%Ქ6 ኬᏘƸХນ ଐႸˌᨀஊॖƴفьƠƨᲢ Უŵ+. Х ນƠƨ6 ኬᏘǵȖǻȃȈưƷ +.4 ƷႆྵƸŴ ଐႸư 9%ᲥኬᏘƕኖ ưƋǔƷƴݣƠŴ9%ȸኬᏘƸ ኖ ưƋƬƨŵƜƷƜƱƔǒŴ9%Ქ WC1+JGT⣽⬊ WC1䠉JGT⣽⬊ Con A-FITC 25.3% 7.9% ᅗ JGT ⣽⬊䝃䝤䝉䝑䝖䛾 㻯㼛㼚㻭 ⤖ྜ⬟㻌 CD4 CD8 JG CD8䠇JG WC1䠇JG WC1㻙JG 0 day 1 day 3 day 7 day 0 20 40 60 80 100 ྜ (% ) 䠆 䠆 䠆 䠆 䠆 n=3 䠆䠖p<0.05 ᅗ 㻟㻌 㻵㻸㻙㻞 ่⃭䛻䜘䜛JG䠰⣽⬊䝃䝤䝉䝑䝖䛾ㄏᑟ㻌 図 2 γδT 細胞サブセットの ConA 結合能 図 3 IL-2 刺激によるγδT 細胞サブセットの誘導
－ 112 － 日本家畜臨床感染症研究会誌 ５巻３号 2010 ウシの免疫機能と乳腺免疫 （イ）mIEL のサイトカイン産生と乳腺上皮細 胞との相互作用 乳 汁 中 で は、CD4+T 細 胞 は 乾 乳 期 に、 CD8+T 細胞は泌乳期に多く存在した。MACS 法で得られた T 細胞サブセットはサイトカイ ン発現が泌乳期と乾乳期で異なり、CD4+T 細 胞は乾乳期で、CD8+T 細胞は泌乳期でサイト カイン発現が高かった。CD8+T 細胞で高発現 し た TGF- β、TNF- α、c-kit、IL-2R は γ δ T 細胞でさらに増強した。γδ T 細胞は IL-10、GM-CSF、IFN- γ、TGF- β、TNF- α、 c-kit、FasL、IL-2R を発現することが確認さ れた。一方、培養乳腺上皮細胞（BMEC）は stem cell factor (SCF) を発現した。c-kit は SCF のレセプターであり、泌乳期ではγδ T 細胞は乳腺上皮細胞由来の SCF で活性化され、 増殖あるいはサイトカイン産生を増加する。こ のように、乳腺上皮内では mIEL と上皮細胞間 にサイトカイン - サイトカインレセプター情報 伝達（イントラネット）機構が存在し、これら 細胞間相互作用で乳腺上皮細胞ならびに mIEL の分化ならびに機能が制御される可能性が考え られる。
（ ロ ） 乳 腺 上 皮 細 胞 の Toll like receptors (TLRs) の発現と TLRs を介する LPS と Pam3CSK4の作用
BMEC で の Toll like receptor (TLR) -2、 -4、-9 の発現を、また TLR-2、TLR-4 のリ ガンドである Pam3CSK4と LPS の TLRs で の認識とそのシグナル伝達、さらには TLRs 依存性のサイトカイン産生を解析し、乳房炎の 起炎菌による乳腺上皮細胞の活性化と乳房炎に 伴う免疫応答に対する関与を検討した。 BMEC は TLR- １、-2、- ３、-4、-6 ( 図 4) と MD-2、CD14、IL-1 β、IL-6、TNF- α の mRNA を恒常的に発現した。LPS 刺激の 1 時間後に新たに IL-8 の発現が認められ、TNF-αと TLR-4 の mRNA 発現が増強した。刺激 3 時間後には IL-1 β、6 時間後に IL-6、IL-8 の mRNA 発現が増強し、IL-1 αが新たに発現 した。泌乳期の正常ホルスタイン牛の乳腺では、 TLR-2、-4、の発現が確認され、実験感染乳 房炎牛の乳腺では、これらの発現が増加した。 一方、SEC 刺激では、BMEC のサイトカイン 産生ならびに TLRs 発現は影響されなかった。 このことから、SEC と LPS の乳腺上皮細胞へ の作用は異なり、LPS の TLR-4 を介する乳腺 上皮細胞でのサイトカイン産生が示された。こ の知見は、黄色ブドウ球菌と大腸菌の感染に伴 う乳房炎発症機序の相違を示すものであり、乳 腺上皮細胞の感染性を解明する上で重要である。 LPS 刺激による NF κ B の活性化に関して、 無刺激の BMEC では、I κ B αの明確な発現 が認められたが、リン酸化 I κ B αの発現は弱 かった。LPS 刺激後、30 分後にはリン酸化 I κ B の発現が増強され、I κ B αがリン酸化さ れて NF κ B が活性化されることが示された。 また、免疫組織染色法で、LPS 刺激後 30 分 に NF κ B が核内へ移行することが確認され た。CD14 は TLR4 の LPS 認識に必要であり、 CD14 抗体はその機能をブロックする。LPS 刺激前に抗 CD14 抗体（10 μ g/ml）で 1 時 間処理し、LPS で 30 分間刺激した。その結果、 NF κ B は核内へ移行せず、無刺激と同様に核 の周囲に強い陽性反応が観察された。このこと より、BMEC に発現している TLR-4 は CD14 فࢍƠƨŵХນ ᧓ࢸƴƸ +.Ŵ ᧓ࢸƴ +.Ŵ+. Ʒ O40# ႆྵƕفࢍƠŴ +.ƕૼƨƴႆྵƠƨŵඣʐƷദࠝț ȫǹǿǤȳཅƷʐᐄưƸŴ6.4ŴŴ ƷႆྵƕᄩᛐƞǕŴ᬴ܱज़௨ʐ໒ཅƷʐ ᐄưƸŴƜǕǒƷႆྵƕفьƠƨŵɟ૾Ŵ 5'% ХນưƸŴ$/'% ƷǵǤȈǫǤȳင ဃƳǒƼƴ 6.4U ႆྵƸࢨ᪪ƞǕƳƔƬ ƨŵƜƷƜƱƔǒŴ5'% Ʊ .25 Ʒʐᐄɥ ႝኬᏘǁƷ˺ဇƸီƳǓŴ.25 Ʒ 6.4 ǛʼƢǔʐᐄɥႝኬᏘƷǵǤȈǫǤȳ ငဃƕᅆƞǕƨŵƜƷჷᙸƸŴ᰾ᑥȖȉ ǦྶᓏƱٻᐂᓏƷज़௨ƴˤƏʐ໒ႆၐೞ ࡀƷႻᢌǛᅆƢNjƷưƋǓŴʐᐄɥႝኬᏘ Ʒज़௨ࣱǛᚐଢƢǔɥưᙲưƋǔŵ .25 ХນƴǑǔ 0($ Ʒࣱ҄ƴ᧙Ơ ƯŴХນƷ $/'% ưƸŴ+$ƷଢᄩƳ ႆྵƕᛐNJǒǕƨƕŴȪȳᣠ҄ +$Ʒႆ ྵƸࢊƔƬƨŵ.25 ХນࢸŴ ЎࢸƴƸ Ȫȳᣠ҄ +$ ƷႆྵƕفࢍƞǕŴ+$ƕ Ȫȳᣠ҄ƞǕƯ 0($ ƕࣱ҄ƞǕǔƜ ƱƕᅆƞǕƨŵLJƨŴβ၃ኵጢ௨ᑥඥưŴ .25 Хນࢸ Ўƴ 0($ ƕఋϋǁᆆᘍ ƢǔƜƱƕᄩᛐƞǕƨŵ%& Ƹ 6.4 Ʒ .25 ᛐᜤƴ࣏ᙲưƋǔƱƞǕŴ%& ৴˳ ƸƦƷೞᏡǛȖȭȃǯƢǔŵ.25 ХນЭƴ ৴ %& ৴˳Ტ IONᲣư ᧓ϼ ྸƠŴ.25 ư Ў᧓ХນƠƨŵƦƷኽௐŴ 0($ ƸఋϋǁᆆᘍƤƣŴХນƱӷಮƴ ఋƷԗƴࢍƍࣱᨗӒࣖƕᚇݑƞǕƨŵƜ Ʒ Ɯ Ʊ Ǒ Ǔ Ŵ $/'% ƴ ႆ ྵ Ơ Ư ƍ ǔ 6.4 Ƹ %& ǛʼƠƯŴೞᏡႎƴ˺ဇ ƢǔƜƱƕᅆƞǕƨŵ ɟ૾Ŵ2CO%5-ХນƸ $/'% ưƷ໒ ၐࣱǵǤȈǫǤȳƱDZȢǫǤȳƷ O40# ႆྵƕஊॖƴفࢍƠƨŵƜƷƜƱƔǒŴǦ ǷʐᐄɥႝኬᏘƸ 6.4 ǛʼƠƯŴᓏ˳ᐏ ЎǛᛐᜤƠŴ໒ၐࣱ׆܇Ʒᛔݰƴ᧙ɨƢ ǔƜƱƕᅆƞǕƨŵ2CO%5-ХນƠƨ $/'% ƷؔɥฌƸŴชь ЎࢸƔǒ᫄ ቩྶƷᢂឥࣱǛᛔݰƠŴƦƷࣱƸ ЎࢸLJưஊॖưƋƬƨŵƜƷƜƱƔǒŴ 2CO%5-ХນƴǑƬƯŴ$/'% ƕငဃ Ƣǔ෩ࣱ׆܇ƕŴ᫄ቩྶƴჺ᧓ư˺ဇƠŴ ƦƷᢂឥᏡǛفࢍƢǔƜƱƕᅆƞǕƨŵ ˌɥǑǓŴǦǷƷʐᐄƴƓƍƯŴO+'. ƱʐᐄɥႝኬᏘ᧓ƷǵǤȈǫǤȳȷǵǤȈ ǫǤȳȬǻȗǿȸǤȳȈȩȍȃȈƕʐᐄɥ ႝኬᏘƷೞᏡƞǒƴƦƷᐏɥƴႆྵƢǔ 6.4Ŵ+. ǛʼƢǔʐ໒ឪ׆ᓏƷЎ܇ ನᡯƷᛐᜤƴ᧙ɨƠŴʐᐄβ၃ƷࣖሉǛࡽ ƖឪƜƢƜƱƕᅆƞǕƨŵ Bovine TLRs TLR1 :421bp TLR2 :274bp TLR3 :327bp TLR4 :237bp BMEC PBMCBovine TLRs TLR6 :679bp TLR7 :180bp TLR8 :393bp TLR9 :408bp TLR10: 303bp BMEC PBMC Bovine TLRs TLR1 :421bp TLR2 :274bp TLR3 :327bp TLR4 :237bp BMEC PBMCBovine TLRs TLR6 :679bp TLR7 :180bp TLR8 :393bp TLR9 :408bp TLR10: 303bp BMEC PBMC ᅗ 㻠㻌 㻮㻹㻱㻯 䛷䛾 㼀㻸㻾㼟 䛾Ⓨ⌧㻌 図 4 BMEC での TLRs の発現
－ 113 － Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Diseasein Farm Animals Vol.5 No.3 2010 Immune function and mammary gland immunity in cows
を介して、機能的に作用することが示された。 一方、Pam3CSK4刺激は BMEC での炎症性 サイトカインとケモカインの mRNA 発現を有 意に増強した。このことから、ウシ乳腺上皮 細胞は TLR2 を介して、菌体膜成分を認識し、 炎症性因子の誘導に関与することが示された。 Pam3CSK4刺激した BMEC の培養上清は、添 加 10 分後から顆粒球の遊走活性を誘導し、そ の活性は 45 分後まで有意であった。このこと は、Pam3CSK4刺激によって、BMEC が産生 する液性因子が、顆粒球に短時間で作用し、そ の遊走能を増強することを意味する。 以上より、ウシの乳腺において、mIEL と乳 腺上皮細胞間のサイトカイン - サイトカインレ セプターイントラネットが乳腺上皮細胞の機能 さらにその膜上に発現する TLR2、IL-4 を介 する乳房炎起因菌の分子構造を認識し、乳腺免 疫応答の制御に関与することが示された。 Immunefunctionandmammaryglandimmunityincatele Takahiro Yamaguchi
Graduate School of Agriculture Science, Tohoku University (Sendai, 981-8555.JAPAN)
