進行・再発大腸癌に対する新規腫瘍抗原遺伝子と腫瘍新生血管抗原遺伝子由来HLA-A24拘束性エピトープぺプチドワクチンカクテルとUFT/LV併用療法の臨床効果と免疫応答の検討

全文

(1)進行・再発大腸癌に対する新規腫瘍抗原遺伝子と腫瘍新生血管抗原遺伝子由来. 博士学位論文. 拘束性エピトープペプチドワクチンカクテルと HLA-A24. 進行・再発大腸癌に対する新規腫瘍抗原遺伝子と腫瘍新生血管抗原遺伝子由来 H L A - A 2 4 拘束性エピトープペプチドワクチンカクテルと. 併用療法の臨床効果と免疫応答の検討 UFT/LV. UFT/LV 併用療法の臨床効果と免疫応答の検討. 井上. 近畿大学大学院. 啓. 医学研究科医学系専攻. 介. 井. 上. 啓. 介.

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(4) 博士学位論文. 進行・再発大腸癌に対する新規腫瘍抗原遺伝子と腫瘍新生血管抗原遺伝子由来 H L A - A 2 4 拘束性エピトープペプチドワクチンカクテルと UFT/LV 併用療法の臨床効果と免疫応答の検討. 平成 25 年 12 月. ۙ‫ـ‬େֶେֶӃҩֶ‫ڀݚ‬Պ ҩֶ‫ܥ‬ઐ߈ ʢࢦಋɿԞ໺ਗ਼ོ‫ڭ‬तʣ 井. 上. 啓. 介.

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(6) 進行・再発大腸癌に対する新規腫瘍抗原遺伝子と腫瘍新生血管抗原遺伝子由来 HLA-A24 拘束性エピトープペプチドワクチンカクテルと UFT/LV 併用療法の臨床効果と免疫応答の検討近畿大学医学部外科学教室井上啓介，杉浦史哲，奥野清隆（指導：奥野清隆教授） Study of the clinical effect and immune response of a new tumor antigen gene and tumor angiogenesis antigen gene-derived HLA-A24 restricted epitope peptide vaccine cocktail and UFT / LV combination therapy for advanced or recurrent colorectal cancer Keisuke Inoue, Fumiaki Sugiura, Kiyotaka Okuno Department of Surgery, Kinki University School of Medicine （Director : Prof. Kiyotaka Okuno）抄録標準化学療法不応となった進行再発大腸癌患者に対して，網羅的遺伝子解析により同定された，大腸癌に高発現し正常組織にはほとんど発現しない新規腫瘍抗原 Ring finger protein 43（RNF43），Translocase of outer mitochondrial embrane 34（TOMM34），Maternal embryonic leucine zipper kinase（MELK），Forkhead box M1（FOXM1），Holliday junction recognition protein（HJURP）由来の HLA-A24（タンパク質）拘束性エピトープペプチドと腫瘍新生血管関連遺伝子 Vascular �� Endothelial Growth Factor receptor 1�� （�� VEGFR1�� ），�� Vascular Endothelial Growth Factor receptor 2（VEGFR2）由来の HLA-A24（タンパク質）拘束性エピトープペプチドを用いるペプチドワクチンカクテルと，Tegaful-uracil（UFT）/Leucovorin（LV）の併用療法を行い，その安全性と免疫応答能及び臨床効果について評価を行った．治療方法は，7 種類のペプチドワクチンを毎週投与し，同時に UFT 300 mg/m2/day + LV75 mg/day を 4 週間服用，1 週間休薬とした．5 週を 1 クールとし，2 クール施行し効果判定を行った．その後，患者が希望する時は治療を継続した．登録された 30 例のうち 26 例が 2 クールを完遂した．有害事象は 25 例（83%）に Grade 1 の発赤・硬結を認めた以外，特に重篤なものはなく，安全に施行可能であった．Grade 3 の痙攣発作，高カルシウム血症，高ビリルビン血症を各 1 例に認めたが，それぞれ各病巣の増悪（脳転移，骨転移，肝転移）によるものと考えられた．2 クール終了時点での効果判定では，Partial response（PR）が 3 例に認められ，stable disease（SD）が 15 例，progressive disease（PD）が 8 例であった．生存期間中央値（MST）は 10.8 ヶ月，無増悪生存期間（PFS）は 3.1 ヶ月であった．当教室で以前施行した 2 種ペプチドワクチン + UFT/LV 併用療法と比較すると，抗腫瘍効果において良好な成績が得られた．7 種ペプチドワクチン + UFT/LV 併用療法は，進行再発大腸癌に対する副作用の少ない治療の一つとして期待できるものと考えられた． Key words : 進行再発大腸癌，ペプチドワクチン，UFT/LV. ─1─.

(7) 緒言現在，癌の治療には手術療法，化学療法，放射線療法が，エビデンスに基づく治療として確立している．その中，免疫療法はこれらに続く第 4 の治療として期待されながらも十分なエビデンスが得られていない状況にある．癌免疫療法にはワクチン療法，細胞免疫療法，サイトカイン療法，生体応答調節療法（BRM: biological response modifiers），抗体療法，遺伝子療法などが存在するが，その中でワクチン療法，特にペプチドワクチン療法は，抗原特異的免疫療法に属し，近年注目されている治療法である．2011 年 10 月 FDA（Food and Drug Administration: 米国食品医薬品局）が，がんペプチドワクチン療法について承認申請に向けた基本的考え方を示すガイダンスを公表し 1 ，現在がんペプチドワクチン療法は，世界各国で臨床試験が進んでいる．このガイダンスの中には，がんワクチン療法臨床試験を実施する上で重要となる，既存の抗がん剤の評価方法と異なる基本的な考え方が示されている．これは今までの臨床試験で得られた知見と一致し，がんワクチン療法は副作用が少なく，治療後期に生存に寄与する可能性のある新規治療法として，大きな転換期を迎えつつある．腫瘍抗原ペプチドを用いたペプチドワクチン療法は，先ず悪性黒色腫を中心に腫瘍抗原が同定され，この腫瘍拒絶抗原ペプチドを用いた臨床試験と，症例報告が行われた 2 ．その後も，腫瘍抗原は種々の手法により同定が試みられ報告されているが，腫瘍細胞に高発現するものの正常細胞には発現せず，強い免疫原性を有する等の理想的な条件を満たす腫瘍抗原の例は少ない . しかし cDNA マイクロアレイ法の開発により，腫瘍における数多くの遺伝子発現を網羅的に探索できるようになり 3−5 ，腫瘍の性質，特徴が遺伝子レベルで解析できるようになった 6 ．この手法を用いて，大腸癌では RNF43 と TOMM34 が同定され，腫瘍抗原であることと免疫原性があることが証明され，日本人に最も頻度が高い（60%）HLA-A24（タンパク質）拘束性エピトープペプチドが同定された 7 ．その後も細胞傷害性 T 細胞（CTL）によって認識される腫瘍抗原が発見され，腫瘍特異的抗原が次々と同定され，これらを標的とする抗原特異的免疫療法であるエピトープペプチドを用いたがんワクチン療法の臨床試験が進行している．しかし，腫瘍抗原を標的とするペプチドワクチン療法は，腫瘍細胞における HLA Class Ⅰ発現の低下や消失，標的分子の欠落などが原因で CTL の抗腫瘍効果が無くなってしまうことがあり，また現在同定されている腫瘍抗原ペプチドはある種の腫瘍には存在するが，全ての腫瘍を網羅できるものではない . そこで考えられたのが，CTL の標的細胞を腫瘍細胞自身ではなく腫瘍新生血管とし，腫瘍新生血管由来分子を標的としたワクチン療法である．標的分子として，腫瘍特異抗原と同様正常細胞にはほとんど発現がなく，新生血管に高発現し，新生血管の増殖に不可欠な血管内皮細胞増殖因子受容体である Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1（VEGFR1）と Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2（VEGFR2）に注目した．VEGFR1 及び VEGFR2 が免疫療法の標的となり得るか否かに関しては， VEGFR1 ，VEGFR2 タンパク及び DNA をワクチンとした基礎的研究の結果，腫瘍の種類に関わらず，腫瘍新生血管を抑制することで抗腫瘍効果を認め，この抗腫瘍効果は VEGER1 及び VEGFR2 に特異的な細胞傷害性 T 細胞が担っていることが確認された．ヒトにおける基礎的解析の結果，VEGFR1 及び VEGFR2 を認識し傷害する CTL クローンが存在することが証明され，強力な CTL を誘導できる数種類の HLA-A24（タンパク質）拘束性のエピトープペプチドが同定された．さらにマウス in vivo 抗腫瘍効果の検討で，VEGFR1 及び VEGFR2 由来エピトープペプチドを用いたがんワクチン療法により，強い抗腫瘍効果が確認された．また本臨床試験に用いるペプチドで，癌患者末梢血からも CTL が誘導できたことより，CTL 前駆細胞ががん患者に. ─2─.

(8) おいても存在することが明らかになった 8−10 ．以上より，本ペプチドを投与し VEGFR1 及び VEGFR2 特異的 CTL を誘導することで，腫瘍血管新生を阻害し，腫瘍効果が得られることが期待できる 11 ．当教室では以前 2 種ペプチドワクチ（RNF43 ，TOMM34）+ UFT/LV の臨床試験を行った経験がある 12 ．その中で，長期間安定（ Long SD）となる症例は認めるものの，PR を得られた症例は認められなかった 12 ．そこでさらなる良好な結果を得るため上記 2 種に加えて 3 種類の新規腫瘍抗原（FOXM1 ，MELK ， HJURP）と 2 種血管新生関連分子（VEGFR1 ，VEGFR2）由来エピトープペプチドを加えた 7 種ペプチドワクチン + UFT/LV 併用療法の臨床試験を計画した．. 目的と方法本研究は第Ⅰ / Ⅱ相臨床試験として Umin Clinical Trials Registry に登録し（臨床試験番号 UMIN000007801）， 2011 年 10 月～ 2012 年 5 月に至るまでに計 30 名を登録した．本臨床研究は近畿大学医学部倫理委員会の承認の下（承認番号 23−059 ，承認日 2011 年 9 月 7 日），東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターとの共同研究として実施した．. １．目的：切除不能進行再発大腸癌に対して，大腸癌ペプチドワクチンと UFT/LV 併用療法に関する第Ⅰ / Ⅱ相臨床試験を行う . 主要評価項目（primary endpoint）安全性の評価（Common Terminology Criteria for Adverse Events（CTCAE）v3.0）全生存期間 overall survival（OS）無増悪生存期間 progression free survival（PFS）副次的評価項目（secondary endpoint）免疫学的評価（ELISPOT 法によるペプチド刺激による特異的 IFN- ɤ 産生細胞誘導能）腫瘍縮小効果に関する情報（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors（RECIST）1.1 に従う）腫瘍縮小効果に関する情報. ２．対象症例ａ . 適応症例 ①切除不能進行再発大腸癌で 5-FU ，塩酸イリノテカン（CPT-11），オキサリプラチン（L-OHP）を含む標準化学療法（一次，二次治療）13 が施行され，不応となっていること . あるいは一次，二次治療中に，有害事象を含む何らかの理由で，一次・二次治療を続けることが困難な場合 . ② Performance status 0 ～ 2 ③年齢は 20 歳以上 80 歳未満 ④治療前に CT/MRI を含む画像検査などで原発あるいは転移巣の存在を確認できること . ⑤前治療（手術，化学療法，放射線療法，温熱療法，他の免疫療法など）から 4 週間以上経過していること . ⑥骨髄機能（白血球数 2000 個 /ul 以上，血小板 5�� 0000 �� 個 /ul 以上），肝機能（�� Glutamic Oxalocetic Trans-. ─3─.

(9) aminase（GOT）150 IU/l 以下，Glutamic pyruvic transaminase（GPT）150 IU/l 以下，Total bilirubin （T-bil）3.0 mg/dl 以下），腎機能（Creatinine（Cr）3.0 mg/dl 以下）が保たれていること . ⑦ HLA-A*2402 を有すこと . ⑧本人の同意を文書で得られること .. ｂ．除外症例 ①妊婦 ②授乳中の女性（ただし授乳中止すれば適応とする） ③妊娠の意思のある患者（試験期間中は適切な避妊をする） ④ 3 ヶ月以上の生命予後が見込めない症例 ⑤制御困難な活動性感染症をもつ症例 ⑥試験中に以下の薬剤を投与する必要性があるもの : 副腎皮質ホルモン剤の全身投与，免疫抑制剤の全身投与. ３．ペプチド及びワクチンの作成 7 種類のペプチドは Multiple Peptide System（San Diego ，CA ，USA）または BCN Peptide（Barcelona ， Spain）にて Good Manufacturing Practice（GMP）グレードで合成した．これらのペプチドを個別に dimethyl sulfoxide（DMSO）または生理食塩水で溶解，1mg/ml のペプチド溶液とした後，同量の不完全フロイントアジュバント（Montanaide ISA-51VG : Seppic ，Paris ，France）と混和，エマルジョン化してペプチドワクチンとした．以下に今回使用した新規腫瘍抗原遺伝子と腫瘍新生血管抗原遺伝子を述べる． RNF43：RNF43（ ring finger protein 43）は大腸癌で高発現を認める新規遺伝子として同定された 783 アミノ酸残基から成るタンパク質である 14 ．成人正常組織には発現せず，大腸癌臨床検体では 69% に高発現を認める遺伝子 . 内田らは RNF43 タンパク由来の HLA-A24 に結合能を持つペプチド（NSQPVWLCL）を用いて CD8 陽性 T 細胞を刺激したところ，ペプチドをパルスした標的細胞に対し細胞傷害活性を有する CTL クローンを樹立することができた．この CTL クローンは RNF43 を内因性に発現し，かつ HLA-A*2402 を保持している腫瘍細胞株を認識し，細胞傷害活性を示した 14 ．以上の知見より，RNF43 由来ペプチド（NSQPVWLCL）は免疫原性を有しており，RNF43 を認識する CTL を誘導するがんワクチン療法に応用できるエピトープペプチドであることが判明した．. TOMM34：TOMM34（translocase of outer mitochondrial membrane 34）309 アミノ酸残基から成り，細胞増殖に関与しているタンパク質である．正常臓器では精巣で高発現を認める一方，大腸癌臨床検体では 92％（11/12）に高発現を認める 15, 16 ．RNF43 と同様に処理して樹立した CTL クローンは，TOMM34 を内因性に発現しかつ HLA-A*2402 を保持している腫瘍細胞株を認識し，細胞傷害活性を示した 15, 16 ．以上の知見より， TOMM34 由来ペプチド（KLRQEVKQNL）は免疫原性を有しており，TOMM34 を認識する CTL を誘導する. ─4─.

(10) がんワクチン療法に応用できるエピトープペプチドであることが判明した．. FOXM1：FOXM1（Forkhead box M1）は 801 アミノ酸残基から成り，細胞増殖に関与しているタンパク質である．正常臓器では精巣で高発現を認める一方，大腸癌臨床検体では 59％（17/29）に高発現を認める 17, 18 ．RNF43 と同様に処理して樹立した CTL クローンは，FOXM1 および HLA-A*2402 を共発現した標的細胞を認識し，CTL 活性を示した 18 ．以上の知見より，FOXM1 由来ペプチド（IYTWIEDHF）は免疫原性を有しており，FOXM1 を特異的に認識する CTL を誘導するがんワクチン療法に応用できるエピトープペプチドであることが判明した．. MELK：MELK（maternal embryonic leucine zipper kinase）は 651 アミノ酸残基から成り，細胞増殖に関与しているタンパク質である．正常臓器では精巣以外では発現を認めず，大腸癌臨床検体では 73％（11/15）に高発現を認める 19 ．RNF43 と同様に処理して樹立した CTL クローンは，MELK を内因性に発現しかつ HLA-A*2402 を有する癌細胞株を認識し，細胞傷害活性を示した 19 ．従って，MELK 由来の改変ペプチド（EYCPGGNLF）は MELK を特異的に認識・傷害する CTL を誘導するがんワクチン療法に応用できるエピトープペプチドであることが判明した．. HJURP：HJURP（Holliday junction recognition protein）は 748 アミノ酸残基から成り，細胞増殖に関与しているタンパク質である．正常臓器では精巣で高発現を認める一方，大腸癌細胞株では 85％（11/13）に高発現を認める 20 ．RNF43 と同様に処理して樹立した CTL クローンは，HJURP および HLA-A*2402 を共発現した標的細胞を認識し，CTL 活性を示した 20 ．以上の知見より，HJURP 由来ペプチド（KWLISPVKI）は免疫原性を有しており，HJURP を特異的に認識する CTL を誘導するがんワクチン療法に応用できるエピトープペプチドであることが判明した．. VEGFR1：VEGFR1（Vascular Endothelial Growth Factor receptor 1）は，1338 アミノ酸残基からなる新生血管の増殖に不可欠な血管内皮細胞増殖因子受容体である細胞膜タンパク質であり，固形腫瘍の腫瘍新生血管内皮細胞で高発現している．VEGFR1 も同様に，免疫原性を有しており，VEGFR1 を特異的に認識・傷害する CTL を誘導するがんワクチン療法に応用できるエピトープペプチドである 21 ．本臨床試験では，HLAA*2402 遺伝子産物に提示される VEGFR1-A24-1084（SYGVLLWEI）を用いる．. VEGFR2：VEGFR2（Vascular Endothelial Growth Factor receptor 2）は，1356 アミノ酸残基からなる細胞膜タンパクである．乳癌，大腸癌，腎癌，悪性黒色腫，肺癌など多くの固形腫瘍の腫瘍新生血管内皮細胞に高発現しており，それぞれ，腫瘍新生血管の構築，及び，腫瘍血管内皮細胞の増殖と遊走に関与している．また VEGFR2 の発現が，癌細胞の増殖と強く関連していることも明らかになっている．VEGFR2 も同様に，免疫原性を有しており，VEGFR2 を特異的に認識・傷害する CTL を誘導するがんワクチン療法に応用できるエピトープペプチドである 10 ．本研究では， HLA-A*2402 遺伝子産物に提示される VEGFR2-A24-169 （RFVPDGNRI）. ─5─.

(11) を用いる．. ４．ペプチド特異的 interferon-gamma（IFN-ɤ）産生細胞数の測定ペプチド特異的 IFN- ɤ 産生細胞数の測定のため IFN- ɤ を用いた enzymed-linked immunospot assay （ELISPOT 法）を行った．各被験者よりワクチン投与前と各クール終了後に末梢血を採取し，FicollPaque Plus（GE Healthcare ，Uppsala ，Sweden）を用いて密度勾配遠心法で抹消血単核球（Peripheral blood mononuclear cells: PBMC）を分離し，分離後速やかに凍結した．各患者の PBMC は同時に解凍し， recombinant IL- 2 を含む培地の中で培養した．この培地には negative control として HIV 特異的ペプチド（ILKEPVHGV ，10 µg/ml）と，positive control として CMV 特異的ペプチド（RYLRDQQLL ，10 µg/ml）が含まれ，day 1 と day 8 の 2 回ペプチド刺激が加えられた．ELISPOT 法はヒト IFN-ɤ ELISPOT PLUS kit （Mabtech ， Nacha Stand ， Sweden）を用いて行われた．スポットは自動解析システム（ImmunoSPOT S4 （Cellular Technology Ltd））で計測された．抗原特異的 T 細胞反応は，異なった responder / stimulator 比におけるペプチド特異的スポット数によって 4 段階（- ，+ ，++ ，and +++）に分類された．抗原特異的 T 細胞反応が + ， ++ ，or +++ を示したとき，抗原特異的 T 細胞反応陽性と判断した 22. ５．投与方法前述した RNF43 ，TOMM34 ，FOXM1 ，MELK ，HJURP 由来の腫瘍関連抗原エピトープペプチド及び VEGFR1 ，�� VEGFR2 �� 由来の腫瘍新生血管抗原エピトープペプチド各 1mg のペプチドカクテルと �� IFA�� （�� MONTANIDE ISA51）1ml を混合したエマルジョンを患者腋窩あるいは鼠径部付近に 1 回 / 週で皮下投与し，また平行して UFT 300 mg/m2/day + LV 75 mg/day を 4 週間服用，1 週間休薬の 5 週間を 1 クールとし，2 クールの治療を行った．2 クール終了後は患者の希望に応じて治療を継続した．治療開始後，1 クール終了毎に，血液・生化学検査，腫瘍マーカー検査，画像検査，免疫学的検査を行い，効果判定を行った．. ６．安全性の評価，治療の毒性及び投与量，投与方法の変更について安全性の評価，ペプチド投与による有害事象の有無，程度は，CTCAE ver3.0 で判定した．Grade 3 の非血液学的毒性，または Grade 4 の血液学的毒性が出現した場合治療を休止し，前者は Grade 1 まで，後者は Grade 2 まで回復を待つこととした．また，明らかに UFT + LV が原因と考えられる有害事象が発生し， UFT + LV の投与継続が困難な場合，UFT + LV を中止あるいは減量することができ，その場合もペプチドは継続して投与できることとした．. ７．臨床試験の中止基準Ａ . 規定を超える有害事象が出現した場合第Ⅰ相試験の評価対象症例 6 症例中，ワクチン投与が原因と考えられる Grade 3 以上の非血液学的毒性（嘔気，嘔吐は除く）もしくは Grade 4 以上の血液学的毒性が 2 例出現した時点で本臨床試験は中止とする．Ｂ . 病院長，倫理委員会，臨床研究審査委員会等から中止勧告がでた場合. ─6─.

(12) Ｃ . 責任医師が試験の継続を不適切と判断した場合. ８．臨床的有用性の評価全生存期間 Overall survival（OS）は 1. 登録日を起算日として，あらゆる原因による死亡日までの生存期間とした．2. 最終追跡調査時の生存者は最終生存確認日を持って打ち切りとした．3. 追跡不能例では追跡不能以前で生存確認された最終日で打ち切りとした．無増悪生存期間 Progression free survival（PFS）は，1. 登録日を起算日とし増悪か死亡の早い方までの期間とした．2. 最終追跡調査時の治療継続者については最終確認日で打ち切りとした．3. 各コース毎に診察し画像評価を実施とした．腫瘍縮小効果については，RECIST Ver.1.1 に従って臨床効果を判定評価とした．. ９．免疫学的評価ペプチド刺激による in vitro CTL 誘導能を評価した．末梢血単核球をワクチンとして用いたペプチドにて刺激し，ペプチド特異的 IFN- ɤ 細胞産生数を測定した．観察項目として，ワクチン前後での IFN- ɤ 産生量・産生比の変化を試験開始前，各クール毎に評価し解析した．. １０．統計学的評価生存率は Kaplan-Meier 法で分析し，log-rank 検定を用いて群間比較を行った．いずれの検定においても p < 0.05 を有意差ありとした．. 結果１．患者背景 2011 年 10 月～ 2012 年 5 月にかけて計 30 例の進行再発大腸癌患者が本臨床試験に登録された．平均年齢は 61.8 歳（ 46~78 歳），性別は男女それぞれ 12 例と 18 例，performance status 0~2 であった．このうち 4 症例は病状が進行したことにより 2 クール完遂できずに試験終了となった．30 例中 20 例において，1 次及び 2 次治療として標準化学療法の治療歴を有していた（表 1）．. ─7─.

(13) 表１．患者背景. ─8─.

(14) ２．安全性，有害事象現段階での 7 種ペプチドワクチン + UFT / LV 併用療法に関する全ての有害事象を表に示す（表 2）．血液学的にも非血液学的にも Grade 4 以上の有害事象は出現しなかった．Grade 3 の有害事象として，痙攣発作，高カルシウム血症，高ビリルビン血症，アナフィラキシーショックが各 1 例が認められた．病勢の進行した症例が多く，それぞれ痙攣発作は脳転移に起因し，高カルシウム血症は骨転移に起因し，高ビリルビン血症は肝転移に起因するものであると考えられた．アナフィラキシーショックは発症後迅速に処置したことで，速やかに症状改善した．しかしその後のワクチン継続は中止とした．Grade 2 の有害事象として，深部静脈血栓症が認められた．その他 Grade 1 の全身倦怠感，食欲不振，咳嗽，嘔気，貧血など UFT / LV 単独治療でも認められる有害事象が認められたが，ペプチドワクチンを併用することで有害事象が増悪することはなく，また特別な治療を必要としなかった．最も多く認められた有害事象として，ワクチン投与部位に一致した発赤，硬結を 25 例の患者で認めたが，同様に治療は必要としなかった．表２．有害事象. ３．全生存期間，無増悪生存期間全生存期間，無増悪生存期間共に，30 名全ての症例で解析を行った（表 3）．全生存期間は MST 10.8 ヶ月であり，無増悪生存期間は中央値で 3.1 ヶ月であった．. ─9─.

(15) 表３．免疫反応，結果. ４．腫瘍縮小効果，免疫学的評価腫瘍縮小効果判定は，RECIST ver1.1 に基づいて行った．2 クール終了後の治療効果判定では 3 例で partial response（PR），15 例で stable disease（SD），8 例で progressive disease（PD），4 例は 2 クール後の効果判定まで到達しなかった（表 3）． PR 症例中の一つで，多発肺転移が縮小している例を示す（図 1）．奏効率. ─ 10 ─.

(16) Overall response rate（CR+PR）は 10% ．病勢コントロール率 Disease control rate（CR+PR+SD）は 60% であった．免疫学的評価は ELISPOT 法にて抗原特異的 IFN-γ 産生細胞数を測定した．RNF43 では，17 例でペプチド特異的 IFN-γ 産生が誘導され，MST を比較するとペプチド特異的 IFN-γ 産生の誘導例では 18.3 ヶ月に対し，未誘導例では 6.9 ヶ月であった．これは Log-rank 検定で，p = 0.0115 であった（図 2）．その他 6 種のペプチドでも同様に比較を行い，図に示す（図 3 ～ 8）．同一母集団での 7 つのパラメータで多重比較をしているので， Bonferroni 補正を行い，補正後のα7（0.05）＜ 0.0073 で有意差ありとした．. 図１．症例提示. 図２．RNF43 特異的 IFN- ɤ 産生反応の有無と全生存期間（OS） ─ 11 ─.

(17) 図３．TOMM34 特異的 IFN- ɤ 産生反応の有無と全生存期間（OS）. 図４．FOXM1 特異的 IFN- ɤ 産生反応の有無と全生存期間（OS）. ─ 12 ─.

(18) 図５．MELK 特異的 IFN- ɤ 産生反応の有無と全生存期間（OS）. 図６．HJURP 特異的 IFN- ɤ 産生反応の有無と全生存期間（OS）. ─ 13 ─.

(19) 図７．VEGFR1 特異的 IFN- ɤ 産生反応の有無と全生存期間（OS）. 図８．VEGFR2 特異的 IFN- ɤ 産生反応の有無と全生存期間（OS）. ─ 14 ─.

(20) ５．ペプチド特異的 IFN- ɤ 産生反応の程度と生存期間ペプチド特異的 IFN- ɤ 産生細胞誘導の出現数で解析を進めると，30 例中 9 例は 7 種類全てのペプチドで抗原特異的 IFN- ɤ 細胞産生反応が誘導されている．2013 年 9 月の時点で，この 9 例中 7 例が生存しており，死亡となった 2 例もそれぞれ全生存期間 490 日，551 日と良好な結果を得ている（図 9）．. 図９．ペプチド特異的 IFN- ɤ 産生反応の程度と全生存期間（7 種陽性）. ６．標準化学療法の不応 / 不耐例と全生存期間全症例を検討し直すと今回の臨床試験参加患者は，標準化学療法不応患者と化学療法の副作用が強く継続困難であった症例（不耐例）が混在している．そこで，大腸癌に対する化学療法の key drug である 5-FU ，塩酸イリノテカン（CPT-11），オキサリプラチン（L-OHP）の 3 種類が使用されており，かつ分子標的治療薬である Bevacizumab ，Cetuximab ，Panitumumab のいずれかが併用されて 1 次治療，2 次治療が完遂された症例に限定すると，該当する標準療法不応症例は 30 例中 20 例であった．一方，副作用で継続困難であった症例， CPT-11 もしくは L-OHP のどちらかしか使用していない症例，分子標的治療薬を使用していない症例など不耐例は 10 例であった．これらを MST で比較検討すると，前者が 12.5 ヶ月，後者で 9.7 ヶ月と両群間に有意差を認めなかった（p = 0.31）（図 10）．. ─ 15 ─.

(21) 図１０．ペプチドワクチン前治療の程度と全生存期間. 考察本第 Ⅰ / Ⅱ 相臨床試験は，HLA-A*2402 を有する進行再発大腸癌患者に対して RNF43 ，TOMM34 ， FOXM1 ，MELK ，HJURP 由来の腫瘍関連抗原エピトープペプチド及び VEGFR1 ，VEGFR2 由来 HLA-A24 （タンパク質）拘束性エピトープペプチドのペプチドカクテルと UFT / LV との併用療法である．この併用療法の安全性と，臨床効果を評価し，大腸癌に対して副作用が少なく臨床的有用性の高い新規治療を開発するのが目的であった．本臨床試験で標準化学療法不応となった進行再発大腸癌に対して施行した 7 種ペプチドワクチン + UFT / LV 療法の Disease control rate は 60% であった．また 7 種ペプチド全てに対してペプチド特異的 IFN- ɤ 産生反応が認められた症例では長期生存を得ることができた．当教室で以前施行した 2 種ペプチドワクチン + UFT / LV 併用療法では，2 種ペプチドに対してペプチド特異的 IFN- ɤ 産生反応が見られた症例は，反応が 1 種もしくは反応がなかったものに比べて長期生存を得ることができた．しかし PR となる症例を認めることはなかった．今回と以前の二つの臨床試験を比較すると，ペプチド特異的 IFN- ɤ 産生反応が多種のペプチドに出るほど良好な臨床結果を得られると考えられた．腎癌に対するペプチドワクチン治療に対しても，多種ペプチドを使用し，同様に良好な成績を残した報告が行われている 23 ．これらの結果を考えると，ペプチドワクチン治療前に，抗原特異的 IFN- ɤ 産生反応が出現する症例を予見できれば臨床的意義は極めて大きい．しかしながら，ペプチドワクチン開始前の全白血球数，末梢血リンパ球数，治療開始前の抗原特異的 IFN- ɤ 産生状態などは，ペプチド特異的 IFN- ɤ 産生反応に関連しなかった（データには示さず）．それに加えて，長期生存を得るために 7 種ペプチド全てに対し抗原特異的 IFN- ɤ 産生反応が必要なのかどうか，もしくは 7 種類のペプチドの中にいくつかの不可欠なペプチドがあるのかなど，今後解析すべき課題も多い．これらの疑問点については今後継続して解析を進めていく必要がある．. ─ 16 ─.

(22) 全症例を検討し直すと，今回の臨床試験参加症例は，標準療法全てを尽くした不応症例と有害事象のため二次治療，三次治療で本臨床試験に参加した化学療法不耐症例が混在していたが，前述の如く両群間に生存期間の有意差は認められなかった．しかし，症例数が十分でなく，また上記比較についての報告もまだ見られていない . このことより化学療法不耐症例が，全症例における生存期間に影響を与える可能性は低いと考えられるものの，引き続き症例集積が必要と考えられた．現在，標準化学療法不応となった進行再発大腸癌に対する治療は，唯一 Regorafenib があるのみである． Regorafenib は新規経口マルチキナーゼ阻害薬であり，腫瘍形成（KIT ，RET ，RAF1 ，BRAF ），腫瘍血管新生（VFGER1 ，VFGER2 ，VFGER3 ，TIE2）や腫瘍微小環境形成（PDGFR ，FGFR）に関わるチロシンキナーゼを阻害することにより薬効を示すとされている．Grothey らのプラセボ対照多施設，ランダム化比較試験（CORRECT trial）24 によると，Regorafenib 群は MST 6.4 ヶ月，Placebo 群で MST 5.0 ヶ月と報告されている．CORRECT 試験は，標準治療後に進行した転移を有する大腸癌患者が対象となっており，本臨床試験で施行した 7 種ペプチドワクチン + UFT / LV 併用療法と対象患者の背景が比較的似ている．ただし，我々の試験では厳密な標準化学療法不応例のみではなく，標準療法を完遂せずに登録された不耐例が含まれるため，それらの症例が生存期間に影響を与える可能性は否定できない．そこで CORRECT 試験と背景因子が共通である標準療法を完遂し，不応であった症例に限ると 20 例が該当したが，それらの MST は 12.5 ヶ月と良好であった．もちろん我々の研究は単アームである上，症例数も少ないため単純な比較はできないものの，今後さらに検討を進める価値のあるものと考えられた．今後は多施設共同プラセボ対照ランダム化比較試験によって，本療法の化学的検証を行う予定である．. 結語今回の臨床試験を通じて，進行・再発大腸癌に対する新規腫瘍抗原遺伝子と腫瘍新生血管抗原遺伝子由来 HLA-A24（タンパク質）拘束性エピトープペプチドワクチンカクテルと UFT / LV 併用療法は安全に施行可能と考えられた．今回の臨床試験は，標準化学療法不応患者という患者背景があるため，当院で過去施行した 2 種ペプチドワクチン＋ UFT / LV 併用療法と単純な比較はできないが，過去認められなかった腫瘍縮小症例が認められており腫瘍縮小効果において前回を上回る成績を残せたと考えられ，また全生存期間についても改善を期待できる治療であると考えられた．. 謝辞稿を終えるにあたり，本研究の進行にご協力をいただきました近畿大学腫瘍免疫等研究所助川寧先生，東京大学医科学研究所吉田浩二先生，オンコセラピー・サイエンス社角田卓也先生，シカゴ大学中村祐輔教授に深甚なる謝意を捧げます．. ─ 17 ─.

(23) 文献１．Guidance for industry. Clinical Considerations for Therapeutic Cancer Vaccines. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Center for BiologicsEvaluation and Research, October 2011 ２．Rosenberg SA, et al.（1989）Experience with the use of high-dose interleukin-2 in the trearment of 652 cancer patients. Ann Surg 210 : 474-484 ３．�� Okabe H, et al.�� （�� 2001�� ）�� Genome-wide Analysis of Gene Expression in Human Hepatocellular Carcinomas Using cDNA Microarray : Identification of Genes Involved in Viral Carcinogenesis and Tumor Progression. Cancer Res 61 : 2129-2137 ４．�� Lin Y-M, Furukawa Y, Tsunoda T, Yang K-C, NakamuraY�� （�� 2002�� ）�� Molecular diagnosis of colorectal tumors by expression profiles of 50 genes ewpressed differentially in adenomas and carcinomas. Oncogene 21 : 4120-4128 ５．�� Hasegawa S, et al.�� （�� 2002�� ）�� Genome-Wide Analysis of Gene Expression in Intestinal-Type Gastric Cancers Using a Complementary DNA Microarray Representing 23,040 Genes. Cancer Res 662 : 7012-7017 ６．Bienz M, Clevers H（2000）Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell 103 : 311-320 ７．�� Suda T, Tsunoda T, Daigo Y, Nakamura Y, Tahara H�� （�� 2007�� ）�� Identification of human leukocyte antigen-A24-restricted epitope peptides derived from gene products upregulated in lung and esophageal cancers as novel targets for immunotherapy. Cancer Sci 98 : 1803-1808 ８．�� Niethammer AG, et al.�� （�� 2002�� ）�� A DNA vaccine against VEGF receptor 2 prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth. Nat Med 8 : 1369-1375 ９．Li Y, et al.（2002）Aactive immunization against the vascular endothelial growth factor receptor flk1 inhibits tumor angiogenesis and metastasis. J Exp Med 195 : 1575-1584 １０．Wada S, et al.（2005）Rationale for antiangiogenic cancer therapy with vaccination using epitope peptides derived from human vascular endothelial growth factor receptor 2. Cancer Res 65 : 4939-4946 １１．Matushita N, et al.（2013）Phase clinical trial of a peptide vaccine combined with tegaful-uracil plus leucovorin for treatment of advanced or recurrent colorectal cancer. Oncol Rep 29 : 951-959 １２．奥野清隆，杉浦史哲，塩崎均；（2010）標準療法抵抗性の再発大腸癌に対するがんペプチドワクチン免疫化学療法の安全性と臨床効果日臨外会誌 71 : 2249-2254 １３．大腸癌治療ガイドライン医師用（2010）年版，大腸癌研究会編，金原出版，東京１４．Uchida N, et al（2004）Ring Finger protein 43 as a new target for cancer immunotherapy. Clin Cancer Res 10 : 8577―8586 １５．Shimokawa T, et al.（2006）Identification of TOMM34, which shows elevated expression in the majority of human colon cancers, as a novel drug target . Int J oncology 29 : 381-386 １６．Nakamura Y, Furukawa Y, Tahara H, Tsunoda T, Matsushima S（2007）Coloncancer related gene TOM34. PCT WO 2007/013576 A1. ─ 18 ─.

(24) １７．Yokomine K, et al.（2010）The forkhead box M1 transcription factor as a candidate of target for anticancer immunotherapy. Int J Cancer 126 : 2153-2163 １８．Tsunoda T, Ohsawa R, Yoshimura S, Watanabe T（2010）FOXM1 peptides and vaccines containing the same. PCT WO 2010/095428 A1 １９．Nakamura Y, Tsunoda Y, Ohsawa R, Yoshimura S, Watanabe T（2011）Modified MELK peptides and vaccines containing the same.PCT WO 2011/089921 A1 ２０．�� Nakamura Y, Tsunoda T, Ohsawa R, Yoshimura S, Watanabe T�� （�� 2011�� ）�� HJURP peptides and vaccines including the same.PCT WO 2011/111392 A1 ２１．Ishizaki H, et al.（2006）Inhibition of tumor growth with antiangiogenic cancer vaccine using epitope peptides derived from human vascular endothelial growth factor receptor 1. Clin Cancer Res 12 : 58415849 ２２．Kono K, et al（2012）Multicenter, phaseⅡclinical trial of cancer vaccination for advanced esophageal cancer with three peptides derived from novel cancer-testis ant ２３．igens. J Trans Med 9;10 : 141 ２４．Steffen W, et al.（2012）Mulipeptide immune response to cancer vaccineIMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival. Nature Med 18 : 1254-1265 ２５．Grothey A, et al ;CORRECT Study Group.（2013）Regorafenib monotherapy for previously treated metastatic colorectal cancer（CORRECT）: an in ternational, multicenter, randomised,placebo -controlled,phase 3 trial. Lanset 381 : 303-312. . ─ 19 ─.

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(26) 論受付番号. 文. 医第号. 目氏. 録. 名. 井上啓介. 学位論文題名進行・再発大腸癌に対する新規腫瘍抗原遺伝子と腫瘍新生血管抗原遺伝子由来 HLA-A24 拘束性エピトープペプチドワクチンカクテルとUFT/LV 併用療法の臨床効果と免疫応答の検討近畿大学医学雑誌第 39 巻第 1 号平成 26 年月掲載予定. 副. 論. 文. 題名１．大腸癌に対するペプチドワクチン療法の臨床試験杉浦史哲，井上啓介，奥野清隆 Biotherapy 第 25 巻第 6 号 871 頁∼ 875 頁平成 23 年 11 月掲載２．進行下部直腸癌に対する S-1 併用術前化学放射線療法木谷光太郎，岡嶋馨，佐藤克明，磯野小百合，木村浩基，池田光憲，井上啓介，岩間密，辻江正徳，中山剛之，藤原由規，村田賢，湯川真生，太田善夫，井上雅智癌と化学療法誌第 38 巻第 12 号 2122 頁∼ 2124 頁平成 23 年 11 月掲載.

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