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東京都臨床検査技師会

第8回微生物検査研究班研修会

菌

東京医科大学 微生物学分野

大楠 清文

E‐mail: ohkusu@tokyo‐med.ac.jp

2017年1月6日

菌力アップトレーニング「菌トレ」

～基礎的な細菌編～

分類・命名・同定の概念

① 分類 classification

② 命名 nomenclature

③

同定 identification

類似性に基づいて菌株を秩序正しく配列する

①のグループの単位に学名をつける

分離菌株が①と②によって定義・命名された

グループ(菌種)のどれに属するかを決定する

分類の対象となる最小単位は「菌株」Strain

同定キット 価格500円台～800円台 ＡＰＩ20Ｅ ＩＤテストＨＮ-20ラピッド ミニテックＹＹシステム エンテロチューブⅡ

同定キットや自動同定機器（数値同定）

MALDI Biotyper メインスペクトル(MSP)コンセプト

ピークの位置、強度、出現頻度の情報からパターンママッチングを行う． その際にノイズを減算し質量補正も実施される． 2.0 < Score Value < 3.0 Strain 1 Strain 2 Strain 3 Strain 4 Strain 5

Rank Matched Pattern Score_Value 1 Pseudomonas aeruginosa DSM 1117 DSM 2.188 2 Pseudomonas aeruginosa 8147_2 CHB 2.179 3 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 THL 1.983 4 Pseudomonas aeruginosa_{A07_08_Pudu FLR} 1.943 5 Pseudomonas aeruginosa_{19955_1 CHB} 1.821 6 Pseudomonas aeruginosa_{DSM 50071T HAM} 1.78 7 Pseudomonas indica_{DSM 14015T HAM} 1.55 8 Pseudomonas jinjuensis_{LMG 21316T HAM} 1.49 9 Pseudomonas resinovorans_{LMG 2274T HAM} 1.417 10 Pseudomonas citronellolis_{DSM 50332T HAM} 1.393

起炎菌同定の思考フレーム

臨床情報

染色像

集落＆五感

使用培地

検体種

培養環境・期間

検体採取のタイミング

起炎菌はどれか？

同定まで？

感受性試験も？

簡易同定 or フルID

報告のタイミング

追加試験・検査は？

疫学的視点・アウトブレイク？

培地の追加・培養環境変更

臨床情報の入手・反映はどのタイミング？

検

体

の

到

着

確

認

塗

抹

・

培

地

塗

布

塗

抹

鏡

検

培

地

の

観

察

・

同

定

パ

ネ

ル

選

択

菌

種

の

判

定

薬

剤

感

受

性

試

験

の

判

定

菌

種

と

薬

剤

感

受

性

試

験

最

終

報

告

ここです！

①

ここです！

②

ここです！

③

ここです！

④

ここです！

⑤

臨床サイドとの緊密なコミュニケーションが重要

ハーモナイゼーション；相互理解と「協働」

30代 男性

感染性心内膜炎

血液培養液のグラム染色像

菌トレ ①

サブカルチャー 血液寒天培地

コアグラーゼ試験

陰性

クランピングファクター

陽性

さて，この菌なんだろう？

① Staphylococcus aureus

② Staphylococcus intermedius

③ Staphylococcus schleiferi

④ Staphylococcus hyicus

⑤ Staphylococcus lugdunensis

Staphylococcus lugdunensis

1988年 フランスのリヨンLyonで初めて分離された。

リヨンのラテン語；

Lugdunumに由来。

菌トレ ①

2013 ASM WS-13テキストより引用

コアグラーゼ/クランピングファクター試験

菌種（亜種）

コアグラーゼ_試験 クランピング_{ファクター}

S. aureus

subsp. aureus

＋

＋

S. hyicus

d

－

S. intermedius

＋

d

S. pseudintermedius

＋

－

S. lugdunensis

－

＋

S. schleiferi

subsp. schleiferi

_－

_＋

コアグラーゼ/クランピングファクター試験陽性の菌種

ＰＹＲ オルニチン

－

－

＋

＋

＋

＋

－

－

－

ND

＋

－

＊Kocuria kristinae

_＋

淡いクリーム色/オレンジ色

ｄ

M100-S26

Table 2C

鼻腔にS. lugdunensisがいると

S. aureus保菌率が有意に低下！

A Zipperer et al. Nature 535, 511–516 (2016) doi:10.1038/nature18634 A Zipperer et al. Nature 535, 511–516 (2016) doi:10.1038/nature18634

S. lugdunensis が産生する

l

ugdunin

が

S. aureusの定着を抑制する！

80代 男性

市中肺炎＆敗血症

菌トレ ②－1

さて，この菌なんだろう？

80代 男性

市中肺炎＆敗血症

菌トレ ②－2

さて，この菌の血清型はなんだろう？

Streptococcus pneumoniae

ムコイド型

(mucoid type)

血清型３

(serotype 3)

写真は西神戸医療センター 山本剛先生のご厚意による 血清型3の肺炎球菌は莢膜が厚く白血球に貪食されにくいため病原性が強い

耳鼻科医はムコイド型を

すぐに知りたい！

Otol Jpn 10(2):89‐94, 2000

ムコーズス中耳炎

ムコイド型肺炎球菌が起炎菌の

急性中耳炎（難治性中耳炎）

 臨床的に

セフェム系薬は効果が低い

（pbp2xの変異）

 初期治療にセフェム系抗菌薬を使用した例では重症化

することがある

 一方，

ペニシリンGに対する感受性が良好

である

 ムコーズス中耳炎は，小児に比べ成人に多い

 激しい

耳痛や頭痛，噴出する耳漏，両側性への進行，

内耳障害，急速に進行する難聴

などを呈し，頭蓋内合

併症での死亡例もある

 早期の診断と治療開始が不可欠（ペニシリン系抗菌薬，

鼓膜切開，プレドニゾロンの投与）

13価肺炎球菌結合型ワクチン（PCV13)

4 6B 9V 14 18C 19F 23F Carrier protein CRM‐197 1 3 5 6A 7F 19A

7種の血清型（PCV7）

6種の追加血清型

陰性

陽性

IASRVol. 34 p. 67-68

さて，この反応はなんだろう？

Quellung反応；

莢膜膨化

陰性

陽性

スライドグラス上にて肺炎球菌，型特異抗血清，メチレンブルー溶液を混 合し、光学顕微鏡（×1,000倍）で検鏡する。肺炎球菌の莢膜抗原と抗 血清に反応が起こらなければ，メチレンブルーで染色された菌体のみが 見られる。莢膜抗原と抗血清が反応している場合，莢膜に型特異抗体 が結合することによって莢膜の膨化（Quellung反応）が見られる IASRVol. 34 p. 67-68 IASRVol. 35 p. 234-236

血清型35B

血清型15A

胆汁溶解試験

陽性 対照

写真は那覇市立病院 大城健哉先生のご厚意による

Lindsey Bomar et al. mBio 2016; doi:10.1128/mBio.01725-15 Lindsey Bomar et al. mBio 2016; doi:10.1128/mBio.01725-15 トリオレイン リノレイン

Corynebacterium accolensがヒトの中性脂肪を分解して

生じた遊離脂肪酸が肺炎球菌の増殖を抑制する

日齢8 女児

細菌性髄膜炎

菌トレ ③

血液培養陽性

グラム染色像

S.aureus

さて，この菌なんだろう？

この反応なんだろう？

β溶血レンサ球菌の主な種類と性状

S. pyogenes

S. agalactiae

Species

Lancefield_group(s)

PYR; Pyrrolidonyl aminopeptidase

CAMP

VP

その他

S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae S. dysgalactiae subsp. equisimilis

S. canis

S. anginosus

S. porcinus

S. equi subsp. zooepidemicus

A

B

C,(L)

A,C,G,L

C

G

A,C,G,F

E,P,U,V

＋

－

－

－

－

－

－

＋

宿主

ヒト

ヒト,ウシ

動物

ヒト

動物

イヌ

ヒト

ブタ

－

＋

－

－

－

＋/－

－

＋

－

－

－

－

－

－

＋

＋

馬尿酸水解（＋） ソルビトール（＋） 集落が小さい ソルビトール（＋）

PYR

バシトラシン感受性

こんな色の

GBSもいるよ！

さて，この色素は？

PNAS vol. 101(40): 14491–14496, 2004

Streptococcus pyogenes

A群溶血レンサ球菌

β溶血性レンサ球菌

 咽頭炎 ・扁桃炎

 猩紅熱

 丹毒

 膿痂疹

 劇症型

A群レンサ球菌感染症

 急性糸球体腎炎

(AGN)

 リウマチ熱

(ARF)

続発症

”溶レン菌“

化膿性レンサ球菌

苺舌

β溶血レンサ球菌の主な種類と性状

S. pyogenes

S. agalactiae

Species

Lancefield_group(s)

PYR; Pyrrolidonyl aminopeptidase

CAMP

VP

その他

S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae S. dysgalactiae subsp. equisimilis

S. canis

S. anginosus

S. porcinus

S. equi subsp. zooepidemicus

A

B

C,(L)

A,C,G,L

C

G

A,C,G,F

E,P,U,V

＋

－

－

－

－

－

－

＋

宿主

ヒト

ヒト,ウシ

動物

ヒト

動物

イヌ

ヒト

ブタ

－

＋

－

－

－

＋/－

－

＋

－

－

－

－

－

－

＋

＋

馬尿酸水解（＋） ソルビトール（＋） 集落が小さい ソルビトール（＋）

PYR

バシトラシン感受性

PYRテスト

PYR（Ｌ-ピロリドニル-β-ナフチルアミド）で菌の産生するＬ-ピロリドニル

ペプチダーゼを検出する。

陽性 陰性

陽性：Streptococcus pyogenes, Enterococcus spp., Citrobacter spp.

陰性：その他のStreptococcusspp.，Salmonella spp., Proteus spp. リドザイムPYRテスト （LSIメディエンス） 希望納入価：200円／1本

70代 女性

敗血症

菌トレ ④

さて，この菌なんだろう？

写真は西神戸医療センター 山本剛氏のご厚意による

Enterococcus casseliflavus

Etymology: 

N.L. gen. n. casseli, of Cassel 

(Cassel yellow); L. adj. flavus, yellow; 

N.L. masc. adj. casseliflavus, yellow‐colored. 

黄色

黄色

黄色

２

E. gallinarum

E. casseliflavus

E. mundtii

＋

＋

－

＋

＋

＋

－

＋

＋

運動性

黄色色素

_産生

リボース

E. casseliflavusと類縁菌種の鑑別性状

いま知りたい MALDIバイオタイパーを用いた菌種同定実践ガイドより引用 耐性遺伝子耐性遺伝子_{の存在部位} 感受性（MIC μg/ml ） 菌 種 VCM TEIC vanA プラスミド 64 － >1,024 16 － 512 E. faecalis E. faecium E. avium vanB プラスミド /染色体 4 － 1,024 ≦0.5 －128 E. faecalis E. faecium E. gallinarum vanC 染色体 2 － 32 ≦0.5－1 E. gallinarum E. casseliflavus E. flavescens

バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)

遺伝子型と薬剤感受性の特徴

vanC1 vanC2/3

感染症法おける5類感染症 VRE； VCMのMIC値が16μg/ml以上

E. casseliflavusの薬剤感受性パターンとして

適当な組み合わせは次の①～⑤のどれか？

①

②

③

④

⑤

VCM

TEIC

>256

128

16

8

0.5

>256

2

>256

1

0.5

MIC（μg/ml）

VREと誤同定（誤判定）しやすい菌は？

Lactobacillus

Pedicococus

Leuconostoc

Weissella

e.g., L. casei, L. rhamnosus,

L. gasseri, L. crispatrus

LAP

6.5% NaCl

PYR

Enterococcus

Pedicococus

Leuconostoc

Weissella

＋

－

－

－

＋

＋

－

＋

＋

＋

＋

＋

α溶血レンサ球菌の主な種類と性状

Enterococcus

属名/菌種

PYR; Pyrrolidonyl aminopeptidase

LAP

NaCl

その他

＋

＋

＋

－

－

－

＋

＋

－

＋

＋

－

＋

－

＋

＋

－

＋

バンコマイシン耐性

PYR

Pairs, chains

Clusters, tetrads

Lactococcus Vagococcus Facklamia languida Aerococus sanguinicola Abiotrophia Granulicatella

Gemella Gemella haemolysans Globicatella Aerococus viridans

Aerococus urinae

Pediococcus

Viridans group streptococci

Weisella Leuconostoc バンコマイシン耐性 ガス産生(+), アルギニン(－) ガス産生(－), アルギニン(＋) エスクリン(+), アルギニン(＋)

80代 女性

市中肺炎

菌トレ ⑤

喀痰のグラム染色像

（ニトロセフィン法）β-ラクタマーゼ陽性

さて，この菌なんだろう？

集落を取ろうとすると

ズリズリ

ん

Moraxella catarrhalis

Branhamella catarrhalis

Neisseria catarrhalis

菌トレ ⑤

さて，あなたの施設ではM. catarrhalisの

同定をどのようにやって報告しますか？

① 同定キット

②

グラム染色像＆触感＆β-ラクタマーゼ試験

③

上記②の例外あり＆同定キット

④

上記②＆DNase産生性

⑤ その他

千葉県こども病院感染症科 小児感染免疫 2013 Vol. 25 (2) :151-155

喀痰

のグラム染色像

髄液

のグラム染色像

Moraxella catarrhalis

（

Neisseria meningitidis

Neisseria gonorrhoeae

尿道分泌物

のグラム染色像

80代 女性

院内肺炎

＆敗血症

菌トレ⑥

喀痰のグラム染色像

さて，この菌なんだろう？

Acinetobacter baumannii

A. baumannii‐calcoaceticus complex

Acinetobacter baumannii

Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter genomic species 3

Acinetobacter genomic species 13TU

A. pittii

A. nosocomialis 

2011年に新種として記載

A. seifertii 

2015年に新種記載

ハウスキーピング遺伝子の塩基配列クラスター解析

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2016), 66, 4105–4111 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2016), 66, 4105–4111

第32回日本環境感染学会での発表ポスターより引用

60代 女性

肝膿瘍

菌トレ ⑦

西神戸医療センター 山本 剛 先生のご厚意による

眼内液

血液培養液

過粘稠性の確認

Hypermucoviscosity

ネバネバの度合

い

さて，この試験は何とよばれていますか？

Klebsiella pneumoniae

_{String Test}

ストリング・テスト

 高い粘稠性は

magA

（染色体性）と

rmpA

（プラスミド性）の

2つの遺伝子に関係する

（Clin Infect Dis. 2006 May 15;42(10):1351-8.）

 magA は血清型

1型（K1）の莢膜合成に関与する

Nadasy, A. at al. Clin Infect Dis. 2007;45:e25-28

Klebsiella pneumoniae

K. pneumoniae

subsp. pneumoniae

３亜種

K. pneumoniae

subsp. ozaenae

K. pneumoniae

subsp. rhinoscleromatis

＋

－

－

VP

尿素分解

＋

－

－

問１ K. oxytoca との鑑別性状は？

問２ Raoultella ornithinolytica

(K. ornithinolytica） との鑑別性状は？

カルバペネム耐性腸内細菌科細菌(CRE)

Ａ．β-ラクタマーゼ産生量の増加とポーリンの変化

Ｂ．カルバペネム分解酵素（カルバペネマーゼ）の産生

→

カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌(CPE)

 染色体性の誘導型AmpCセファロスポリナーゼを大量に産生し，細菌の外膜に存在する 薬剤の透過孔となっているポーリンが減少あるいは欠失したEnterobacter属菌  プラスミド媒介性のDHA型クラスCセファロスポリナーゼやCTX-M型ESBLを多量に産生し， 同時にポーリンが減少したり欠失した肺炎桿菌など

 ClassA

KPC

，SME，NMC‐A，IMI，PER，

GES

，SFO，SFC，IBC

 ClassB

IMP，VIM，NDM，

SPM，GIM，SIM

 ClassD

OXA

，PSE

染色体 プラスミド IMPの遺伝子 CLSI M100‐S26, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing 

CIM vs. mCIM

2016 asm microbe 336 - AST Update: Clinical and Laboratory Impact

CHROMagar

ＴＭ

_ESBL

CHROMagar

ＴＭ

_{ESBL CHROMagar}

_CHROMagar

ＴＭＴＭ

_MDRP

_MDRP

CHROMagar

ＴＭ

_MDRA

CHROMagar

ＴＭ

_MDRA

CHROMagar

ＴＭ

_ESBL/KPC

CHROMagar

ＴＭ

_ESBL/KPC

KPC分画 KPC分画 ESBL分画 ESBL分画 P. mirabilis K. pneumoniae ESBL E. coli オリエンタシオン分画 CRE産生の K. pneumoniae ESBL E. coli ESBL分画

耐性菌スクリーニング培地の活用

日本臨床微生物学雑誌 Vol. 25 No. 4 2015. クロモアガーオリエンタシオン /ESBL分画培地（関東化学） オリエンタシオン ESBL

10代 男性

集団食中毒

ブドウ糖:分解 リジン：陽性 乳糖＆白糖 陰性 ｲﾝﾄﾞｰﾙ：陰性 ：非分解 運動性：陰性 TSI SC LIM BTB乳糖加寒天培地 血液寒天培地 写真は川村千鶴子氏のご厚意による

菌トレ ⑧

Rapid ID 32ｷｯﾄでの同定結果

Hafnia alvei ：同定確率91.5%

さて，この菌なんだろう？

Escherichia albertii

下痢症状を呈するバングラデイッシュの小児から分離 Albertらにより1991年に初めて報告

Escherichia albertii の

生化学的性状と従来の分類

*生物型を1および2に分類したのはNataro （2007） インドール リジン 脱炭酸 該当する生化学的性状を示す菌株 が従来分類されていた菌種 報告者

E. albertii

生物型

1*

陰性

陽性

Hafnia alvei

あるいは

大腸菌

Huys et. al. 2003

E. albertii

生物型

2*

陽性

陰性

Shigella boydii

血清型13

Hyma et. al. 2005

E. albertii

生物型

3

陽性

陽性

大腸菌

Lindsay Oasks

et. al.2010 Ooka et. al. 2012

病原微生物検出情報Vol.33 No5；2012.5より引用

Escherichia albertii の生化学的な鑑別性状

生化学的性状が非定型的な大腸菌

（運動性なし，ラクトース陰性，キシロース陰性）

eae 陽性

→ EPEC → E. albertii eae

+

stx2f 陽性

→ EHEC → E. albertii stx2f

EPEC(eae+)またはEHEC(stx2f+)と登録して，生化学的性状

の項にE. albertiiと記入する

E. albertii に特徴的遺伝子

(E. albertiiの病原因子）

TSI LIM SIM BTB XLD SIB

TSI LIM SIM BTB XLD SIB

キシロース陽性の株もあるようです！ 白糖陽性や

非定型的なEscherichia albertii 株もあるよ！

天草地域医療センター 磯崎将博氏のご厚意による

下痢原性大腸菌の分類

分類

発症機序 主な病原 因子

定義

腸管出血性 EHEC

毒素

stx1, stx2 Stx産生性あるいはStx遺伝子が確認されたもの (保菌者も含む） 毒素原性 ETEC

毒素

LT, ST 易熱性エンテロトキシン（LT)、耐熱性エンテロトキ シン（ST)のどちらかあるいはその両者の産生性 あるいは毒素遺伝子が確認されたもの 腸管侵入性 EIEC 侵入性 invE, ipaH 組織侵入性プラスミドを保有、あるいは組織侵入 性遺伝子が確認されたもの 腸管病原性 EPEC 細胞局在 付着性 eae, bfpA, EAF 培養細胞への局在付着性、またはそれに関連す る遺伝子が確認されたもの。stx, LT, ST,侵入性 が確認されたものは除く 腸管凝集付着性 EAggEC 細胞局在 付着性 aggR, CVD432 培養細胞への凝集付着性、またはそれに関連す る遺伝子が確認されたものStx,LT,ST,侵入性が 確認されたものは除く その他の下痢原性 不明 afa, astA, CDT, cnf 上記５つに該当しないが胃腸炎の原因菌と考え られるもの

下痢原性大腸菌の病原因子

凝集接着因子 stx1 stx2

70代 女性

髄膜炎

菌トレ ⑨-1

西神戸医療センター 山本 剛 先生のご厚意による 髄液のグラム染色像 培養翌日 血液寒天培地の集落

70代 女性

髄膜炎

菌トレ ⑨-2

さて，この菌なんだろう？

血液培養液のグラム染色像 サブカルチャー 血液寒天培地 BTB寒天培地

Listeria monocytogenes

 グラム陽性桿菌

 β溶血

 カタラーゼ試験 陽性

 BTB寒天培地に発育

 細胞内寄生性

 低温増殖性（冷蔵庫；4℃以下でも増殖）

 セフェム系抗菌薬に耐性

ファゴゾーム膜を傷害（hly; Listeriolysin O) して細胞質へ脱出，増殖する

高齢者，免疫不全者，乳幼児は髄膜炎や敗血症等などの重篤な

症状に陥ることもあり，死亡率も20-30%と非常に高い。

また，妊婦は流産，早産や死産の原因となる。

髄液 ×1000 髄液 ×1000

S. pneumoniae

L. monocytogenes

感度90%

感度30%

西神戸医療センター 山本 剛 先生のご厚意による 20 0 40 60 80 100 (%) Percentage of s m ear pos iti ve

≦10

3

₁₀

4

_{～ 10}

5

_＞10

5 (n=8) (n=20) (n=35) concentration (CFU/ml)

髄液中の菌数と塗抹検査の陽性率

25%

60%

97%

薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料より引用

市販食品のリステリア菌汚染状況①

薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料より引用

市販食品のリステリア菌汚染状況②

市販食品のリステリア菌汚染状況③

微生物・ウイルス評価書 食品中のリステリア・モノサイトゲネス（案） 平成25 年1 月17 日 第38 回微生物・ウイルス専門調査会 薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料より引用

食品内のリステリア菌の増殖状況

食品健康影響評価のためのリスクプロファイル：食品安全委員会(2012年1月）より引用

食品健康影響評価のためのリスクプロファイル：食品安全委員会(2012年1月）より引用 いま知りたい MALDIバイオタイパーを用いた菌種同定実践ガイドより引用

30代 女性

子宮頸癌手術後 膿瘍形成

FMOX,IPM/CSを使用するも解熱せず

菌トレ ⑩

集落のグラム染色像

膿汁培養

３日目

（炭酸ガス）

MALDIバイオタイパーによる測定

さて，この菌なんだろう？

さて，この菌なんだろう？

① Gardnerella vaginalis

② Ureaplasma urealyticum

③ Mycoplasma genitalium

④ Mycoplasma hominis

⑤ Chlamydia trachomatis

Mycoplasma hominis

グラム染色に染まらない(

細胞壁なし

)

血液寒天培地に微小集落形成(2～4日)

膿汁(子宮,卵巣,帝王切開創部ほか),

関節液,髄液,羊水など

初代は嫌気培養が発育良好

術後感染症；腹部,胸部(縦隔炎),PID,

関節炎,髄膜炎のケースもあり

EM(R),AZM(R),CLDM(S)

菌トレ ⑩

(X 100)

PPLO培地上の集落 (Dienes染色)

① Staphylococcus lugdunensis

② Streptococcus pneumoniae

③ Streptococcus agalactiae

④ Enterococcus casseliflavus

⑤ Moraxella catarrhalis

⑥ Acinetobacter baumannii

⑦ Klebsiella pneumoniae

⑧ Escherichia albertii

⑨ Listeria monocytogenes

⑩ Mycoplasma hominis

菌

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