博 士 （ 薬 学 ） 高 橋 弘 樹
学 位 論 文 題 名
原 索 動 物 マ ボ ヤ の 細 胞 性 防 御 シ ス テ ム に 関 与 す る 抗 原 レ セ プ タ ー 様 分 子 に 関 す る 研 究
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
系 統発 生 学的 に脊 椎動 物と 無 脊椎 動物の中間に位置する 原索動物ホヤ類が、脊椎動物 に 存在 する 細 胞性 免疫 シス テム の 原型 を有していると考えら れるので、原索動物の免疫担 当 細胞 に存 在 する 膜蛋 白質 が進 化 的に 保存されて脊椎動物の 免疫システムで機能している 可能性が 考えられる。マポヤの体液（ 喃乳類の血液に相当する） では傷口などの局所におい て 凝集 塊を 形 成す る。 この 時、 血 球が 互いに接着することで 細胞間のシグナルを伝達し、
血 球の 活性 化 が引 き起 こさ れて い る可 能性があり、マボヤの 血球の凝集機構の解析は細胞 性 防 御 シ ス テ ム の 初 動 反 応 を 捕 え る 手 掛 か り を 与 え る と 考 え ら れ る 。 初 めに 、 マボ ヤ血 球の 凝集 を 定量 的に測定することによ り、マボヤから体液をシリン ジ で採 取す る と採 取の 刺激 によ る 局所 的な血球凝集の活性化 がおきること、マポヤ血球の 凝 集に 金属 イ オン 、ペ プチ ド性 物 質、 プ口テアーゼ、チロシ ンキナーゼ、アクチンフアラ メントお よび糖鎮が関与することを明 らかにした。
次 に、 マ ボヤの血球凝集に対 する阻害作用を指標にしてモ ノクローナル抗体(A74)を作 製 した 。A74抗 体は、マボヤ血球に よる食作用をも阻害するこ とから、血球‐血球間あるい は 血球 ・異 物 間の接着を阻害する と考えられる。マポヤ血球膜 画分からA74抗原蛋白質(A74 蛋白質） を精製し、N末端部分アミノ 酸配列を決定した。A74蛋白 質はシアル酸を含む分子量 160Kの 糖 蛋 白 質 で 、 約70%の 血 球 群 の 細 胞 膜 に 存 在 す る こ と も 明 ら か に し た 。 マ ボヤ の 細胞 性防 御シ ステ ム にお ける 細胞 間 接着 に関 与す るA74蛋白質の分子構造を 明 らか にす る ため に、 そのc‑DNAク 口一 ニングを行った。決定 されたN末端部分アミノ酸配 列 をも とに プ ライマーを作製し、 それを用いてマボヤ血球c‑DNAライブラリーを鋳型にして PCR産 物を 得た 。そ れ を、 プロ ープ とし て 用い 、マ ボヤ 血球c‑DNAライプラリーからA74蛋 白 質を コー ド するD DNAク ロー ンを 得た 。A74 c‑DNAク 口ー ンは 全長3390bpでポリAテイル を含み、722アミノ酸をコードしてい る。蛋白質から決定されたN末端アミノ酸配列を含み、
1つ の 膜貫 通領 域を 有 する 新規 膜蛋 白質 である。細胞外ドメイ ンに5つのN‑グリコシド型糖 鎖 のコ ンセ ン サス 配列 と5つの シス テイ ン 残基 があ り、 細胞 内 ドメインにチロシンリン酸 化 を介 する シ グナ ル伝 達に 働く と 考え られる複数のモチーフ 構造が存在することが明ぢか に な っ た 。 ま た 、A74蛋 白 質のmRNAは血 球 特異 的に 発現 し てい るこ とも 明ら か にし た。
A74蛋 白質 に存 在する細胞内ドメイ ンのモチーフ構造として、 第一に、哺乳類由来の抗原レ セプタ― に特徴的なAntigen Recognition Activation Motif (ARAM)が、膜貫通領域のすぐあと に 、2回 繰 り 返 し て 存 在 す る。 脊椎 動物 以 外の 免疫 担当 細 胞に おけ るARAMモ チ ーフ 含有 分 子の 存在 は 本研究で初めて明ら かにされた。哺乳類由来の1細胞レセプター(TCR)、B細胞
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レ セ プ タ ー(BCR)あ るい はFcレ セプ ター(FcR)に おい て、 抗 原刺 激の シグ ナ ル伝 達にARAM が 必須であることがミュータン トを用いた実験などから明らかにされている。．第二のモチー フ 構 造は 、細 胞内 ドメ イ ンの 中央 部に 位 置す るSH3ド メイ ン結 合配 列 と2つ のSH2ドメイ ン 結 合 配列 であ る。SH2/SH3ドメ イ ンを持っシグナル分子（チ ロシンキナーゼ、ホスファタ ー ゼ あ るい はア ダプ ター 分 子） がSH2/SH3ドメイン結合配列に 結合し、シグナルを下流に伝 え て い る可 能性 が考 えら れ る。 第三 のモ チ ーフ 構造 はrrrモ チ― フで 、C末端 近傍 に2っ存 在 す る。1XH胞の接着分子LFA‑1と 抗原提示細胞のIくニAM‑1と が接着することにより抗原シグナ ル を増強するようなシグナル(costimulatory signal)を細胞内に伝えるモチ―フで、インテグリ ンB鎖(LFA‑1)の細胞内ドメイン に存在するふ
A74蛋 白 質の 機能 をさ ぐる 目 的で 、A74抗 体を 用い た免 疫沈降実験を行った結果、主 に 分 子 量105K,75Kお よび56Kの蛋 白 質がA74蛋白 質と 一緒 に沈 降 し、A74蛋白 質が 細胞膜近 傍 で 複 数の 蛋白 質と 複合 体 を形 成し てい る こと が明 らか にな った。免疫沈降物を用いて抗 ホ ス ホ チ口 シン 抗体 によ る ウエ スタ ンプ 口 ッテ ィン グを 行い 、分子量160K, 90Kおよび75Kの 3本 の バ ン ド が チ ロ シン リン 酸 化さ れる こと を 明ら かに した 。分 子 量160Kの バン ドはA74 蛋 白 質に 由来 する と考 え られ る。 次に 、 血球 凝集 に伴 う蛋 白質のチ口シンリン酸化の経 時 変 化 を解 析し た結 果、 凝 集刺 激後10分 に 分子 量260Kお よび160Kの蛋白質がチロシンリン 酸 化 さ れ、30分 後に 分子 量90Kと75Kの蛋 白 質が チ口 シン リン 酸化されることが明らかにな っ た 。 分 子 量160Kの 蛋白 質はA74蛋白 質由 来で 、90Kと75Kの蛋 白質 はA74蛋 白 質と 複合 体を 形 成 し 、 か つ 、 チ 口 シ ン リ ン 酸 化 さ れ る 蛋 白 質 と 分 子 量 が 一 致 し た 。 哺 乳 類 由 来 のTCRを 介す る 抗原 提示 のシ グ ナル は、Srcファ ミリ ーキ ナ ーゼ によ って TCRのARAMの チ ロ シ ン 残 基 が り ン 酸 化 さ れ るこ とで 下流 に 伝え られ る。 こ のチ ロシ ンリ ン 酸 化 さ れ たARAMにZAP‑70(分 子量70Kのキ ナー ゼ） が2つのSH2ドメ イン を 介し て結 合す る と 、そ れ自 身がSrcファ ミリ ー キナーゼによってりン酸化 され活性型キナーゼとなり、 次 の タ ーゲ ット 蛋白 質を り ン酸 化す ると考えられている。A74蛋白質のモチーフ構造および 血 球 凝 集に 伴う チロ シン リ ン酸 化の 解析 結 果を ふま えて 、抗 原提示のシグナル伝達機構と の ア ナ ロ ジ ー で 、1℃RのARAMに 対 し て マ ポ ヤA74蛋 白 質 のARAMが 対 応 し 、ZAP‑70に 対 し て マ ポヤ75K蛋白 質が 対応 する と 考え ると 、マ ボヤ の 血球で は、凝集の刺激によってA74蛋 白 質 のARAMの チ ロ シン 残基 がり ン酸 化 され 、次 に、A74蛋白 質と 複 合体 を形 成す る75K蛋 白 質 が、 チ口 シン リン 酸 化さ れたARAMに 結合 する と、 それ 自身もチ口シンリン酸化され 、 シ グ ナル をさ らに 下流 に 伝え ると いう 機 構が 考え られ る。 この機構の検証が今後必要で あ る 。
A74抗 体 によ る機 能阻 害実 験 から 、A74蛋 白質 の細 胞外 ドメインが、血球が互いに接 着 す る 血球 凝集 と、 血球 が 異物 を取 り込 む 食作 用に 機能 して いると考えられる。一方、74蛋 白 質 の 細 胞 内 ド メ イン に抗 原レ セプ タ ーの シグ ナル 伝達 に 特徴 的なARAMモ チー フが 存在 し 、 さら に、A74蛋白 質が 血球 凝 集に 伴っ てチ ロシ ン リン酸 化される。A74蛋白質は、細 胞 外 からのシグナル（血球・血球間接着あるいは血球‐異物間認識）を受容する細胞外ドメインと シ グ ナル を内 部に 伝え る 細胞 内ド メイ ン がー つの 分子 とし て合体した形をとっている。 そ れ に 対し て、喃乳類由来の抗原レ セプターは、抗原特異性を 決定するサブユニット(r細胞 、 B細胞 の各 ク 口― ンに 特異 的な 構 造を持つ）と細胞内へのシ グナル伝達を行うサプュニッ ト
（ クローン間で共有されるモチ ーフ構造を持つ）に機能分化している。両者の比較の上に、ホ ヤ 型 のプ ロト タイ プか ら 、哺 乳類 型の 抗 原レ セプ ター への 進化に伴って抗原特異性と多 様 性 を獲得したという仮説が提案 できる。
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学位 論文審査の要旨 主 査 教 授 横 沢 英 良 副 査 教 授 長 沢 滋 治 副査 助教授 高橋 和彦 副査 助教授 沢田 均
学 位 論 文 題 名
原索動物マボヤの細胞性防御システムに関与する 抗 原レセプター様分子に関する研究
原 索 動 物 は 系 統 発 生 学 的 に 脊 椎 動 物 と 無 脊 椎 動 物 の 中 間 に 位 置 し て お り 、 免 疫 の 進 化 を 考 え る 上 で 重 要 な 動 物 で あ る 。 抗 体 や 補 体 を 持 た な い 原 索 動 物 の 生 体 防 御 シ ス テ ム は 血 球 が 行 う 細 胞 性 防 御 反 応 が 中 軸 を 成 し 、 そ の 細 胞 性 防 御 シ ス テ ム の 解 明 は 脊 椎 動 物 の 高 度 に 発 達 し た 免 疫 シ ス テ ム の よ り 深 い 理 解 に 役 立 っ と 考 え ら れ る 。 そ し て 、 原 索 動 物 の 血 球 に 存 在 す る 生 体 防 御 蛋 白 質 が 進 化 的 に 保 存 さ れ て 脊 椎 動 物 の 免 疫 シ ス テ ム で 機 能 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。
本 論 文 提 出 者 は 、 原 索 動 物 マ ボ ヤ の 細 胞 性 防 御 シ ス テ ム の 中 で 、 血 球 凝 集 に 着 目 し 、 そ の 反 応 に 関 与 す る 分 子 に 関 す る 一 連 の 研 究 を 展 開 し 、 以 下 の 成 果 を お さ め た 。
（1） マ ボ ヤ の 血 球 凝 集 を 定 量 的 に 測 定 す る 方 法 を 開 発 し 、 局 所 的 刺 激 に 伴 い 血 球 凝 集 の 活 性 化 が お き る こ と 、 血 球 凝 集 に 金 属 イ オ ン 、 ペ プ チ ド 性 物 質 、 プ ロ テ ア ー ゼ 、 チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 、 ア ク チ ン フ ィ ラ メ シ ト お よ び 糖 鎖 が 関 与 す る こ と を 明 ら か に し た 。
（2） マ ボ ヤ の 血 球 凝 集 に 対 す る 阻 害 作 用 を 指 標 に し て モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体A74を 作 製 し 、 そ の 抗 体 が マ ボ ヤ 血 球 に よ る 食 作 用 を も 阻 害 す る こ と を 明 ら か に し た 。 さ ら に 、 そ の 抗 原 蛋 白 質 （A74蛋 白 質 ） を マ ボ ヤ 血 球 膜 画 分 か ら 精 製 し 、 ￣ 本 蛋 白 質 が シ ア ル 酸 を 含 む 分 子 量160Kの 糖 蛋 白 質 で あ る こ と を 明 ら か に し 、 N末 端 部 分 ア ミ ノ 酸 配 列 を 決 定 し た 。
（ 3）A74蛋 白 質 の 分 子 構 造 を 明 ら か に す る た め に 、 そ のcDNAク ロ ー ニ ン グ を 行 い 、 単 離 さ れ た A74 cDNAク ロ ー ン が 全 長3390bpで 722ア ミ ノ 酸 を コ ー ド し て お り 、 蛋 白 質 か ら 決 定 さ れ たN末 端 ア ミ ノ 酸 配
