マウスの造血機構とその調節因子に関する研究

マウスの造血機構とその調節因子に関する研究

著者 小川 峰太郎

発行年 1992‑03‑25

URL http://hdl.handle.net/2297/30611

マウスの造血機構とその調節因子        ○

    に関する研究

      ぐ

小川峰太郎 平成3年10月

①

博士論文

マウスの造血機構とその調節因子      に関する研究

金沢大学大学院自然科学研究科

小川峰太郎

目  次

第1章 序章 ・・・・・・・・・・・・・・・・…

第2章 骨髄造血における。一〃の役割・・・・・・…

第3章 造血系の個体発生 ・・・・・・・・・・…

第4章胎生期造血における。一〃の役割 ・・・・…

第5章 総括 ・・・・・・・・・・・・・・・・…

   謝辞 ・・・・・・・・・・・・・・・・…

   引用文献 ・・・・・・・・・・・・・・…

頁

1

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第1章序論

1．細胞分化モデルとしての造血システム

 哺乳類細胞の分化がどのように決定され、制御されているのかを解明すること は医学生物学の中心的課題のひとつである。なぜなら、細胞分化は一般生物学的 には生物の発生現象に直接結びついており、また医学的には発癌や様々な遺伝病 の原因に密接に関連しているからである。一般的に哺乳類細胞の分化を実験的に 取り扱うモデルを考えた場合、それはつぎの4点を満たすことが必要である。

 第一は、目的とする細胞の分化が成熟個体において恒常的に行なわ札ているこ とである。哺乳類動物の個体発生は母体の胎内で起きるために、発生過程におけ る細胞分化を直接取り扱うことは困難である。その点、生後も細胞の決定（Com．

mitment）と分化が常に幹細胞から繰り返されているような系では、個体発生をさ かのぼることなく成熟個体から安定的に材料を得ることができる。

 第二は、分化段階に応じて細胞を識別できる特定のマーカーが存在することで ある。細胞を生かしたままこのマーカーを認識することができるならば、特定の 分化段階にある細胞を検出しこの細胞のその後の運命をたどることが可能となる。

 第三は、細胞分化を加γ伽。で再現できることである。筋細胞の分化誘導遺伝子 である抑。Dの発見は、細胞分化の遺伝子レベルの解明に加y伽。の細胞分化システ

ムが非常に重要であることを示している（Daviseta1．，1987）。

 第四は、細胞分化に異常を示す突然変異体が存在することである。哺乳類以外 の生物では、このような遺伝学的解析が進んでおり、特にショウジョウバエや線 虫では細胞の決定と分化を制御する遺伝子が次々に単離されている（Schnabe1．

1991；Sched1．1991；Stein and Stevens，1991；Small and Levine，1991；Ingham，1991；

H前㎝，1991；Dessainand McGinnis，1991）。

 本研究ではマウスの血液細胞をモデルとして選んだ。生体内には赤血球、白血 球、リンパ球など、それぞれに異なった機能を持つ種々の血液細胞が存在する。

これら血液細胞は、すべて造血組織である骨髄に存在する多能性血液幹細胞に由

来する（Ke11ereta1．，1985；Lemischkaet創．，1986）。成熱個体の骨髄内では、多能性

一1一

る。つまり、造血反応は幹細胞から成熟細胞への分化が成熟個体においても恒常 的に営まれている系なのである。

 個々の血液細胞はその細胞表面抗原によって識別することが可能である。それ ぞれの種類の血液細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体が多く確立されて いる。これらの細胞表面マーカーは細胞が生きている状態で検出することができ るので、フローサイトメトリー等の手法を用いて細胞を生きたまま分画すること が可能である。

 血液細胞の増殖と分化を加γ伽0で行なわせることは既に可能となっている。特 に、半固形培地中で細胞をクローンレベルで培養する系では、血液の前駆細胞を 刺激して成熟した血液細胞のコロニーを形成させる種タのコロニー形成刺激因子

（col㎝ystimulatingfactor，CSF）が同定されている。これらのCSFを用いて血液幹

 マウスには貧血を呈する突然変異が多く存在する。なかでもwおよび∫臆伝子

座はその変異によって血液幹細胞が影響を受けるので特に興味深い（Russe11．1979）。

最近、血液幹細胞と肥満細胞に対して増殖誘導活性を持つ細胞成長因子SLF（Stee1 faCtor）がクローニングされ、∫臆伝子座がこれをコードすることが見いだされた

（Nochaet吐，1990a；Wmiamseta1．，1990；Cope1andeta1．，1990；F1anaganandLeder，

1990；Zsebo etaL，1990a；Malてin etal．，1990；Zsebo et a1．，1990b；Huang eta1．，1990；

Andersoneta1．，1990）。SLFのレセプターは。一〃癌原遺伝子産物であるが、これが W遺伝子座にコードされていることがすでに明らかにされていた（Qiueta1．，1988；

Chaboteta1．，1988；Geiss1ereta1．，1988）。遺伝学的な解析から、恒常的な造血を支 えている分子のひとつのセットとして。一はtタンパクとそのリガンドSLFが既に明

らかにされているという点は、造血システムを理解するうえで非常に有利である。

2．血液幹細胞の加vル。における検出

血液細胞は、それぞれに異なった機能を持つ多様な細胞種から成り立っている。

正常な個体の発生と成長に、これらの多様な血液細胞はなくてはならないもので ある。一般に成熟した血液細胞は限られた寿命しか持たない。したがって個体の 生涯を通じて多能性の血液幹細胞が自己再生と分化をくり返すことにより成熟し た血液細胞を産生することが必要である。哺乳類の場合このような恒常的な造血

反応は主に骨髄内で行なわれている。

 高線量のX線を照射されたマウスでは、増殖している血液細胞（血液幹細胞も 含めて）が死滅するために造血が起こらなくなりやがて貧血のため死亡する。し かし、遺伝的に同等なマウスの骨髄細胞を静脈内注射することでこのマウスを救 うことができる。X線が照射されても骨髄内の造血に必要な環境は破壊されない ので、供与者由来の血液幹細胞が増殖分化して正常な造血を行なうことができる。

染色体マーカーをもつマウスを供与者として用いることにより、血液幹細胞の多 能性と自己再生能が実際に示された（Fordeta1．，1956）。現在でもこの骨髄造血の 再構築（reConS耳tudOn）は、最も未熟な多能性血液幹細胞を機能的に検出する有効 で最終的な手段とされている。

 TmとMcCu11ochは、X線を照射され骨髄細胞を移殖されたマウスの脾臓の表層に 供与者由来の血液細胞からなるコロニーが生じることを指摘した（Tmand

McCu11och，1961）。これらのコロニーはそれぞれ単一の幹細胞に由来し、複数の 系列の血液細胞を含むものも存在する（Beckereta1．，1963）。いくつかのコロニ

ーはさらに別のマウスの脾臓にコロニーを生じさせる活性があり、血液幹細胞の

自己再生を示すと考えられている。この脾コロニー（Co1onyfomingunit−S，CFU−S）

は血液幹細胞を加γル。で計数する手段として確立された。しかし、CFU−Sはある 均一な血液幹細胞集団を反映するものでは決してなく、多能性を持っ未熟な幹細 胞から一定の系列に分化が決定された幹細胞までを反映している。現在では移植 後8日目までに検出されるCFU−Sは、赤血球系幹細胞など分化段階の進んだ幹細 胞を反映し、移植後13日目に検出されるCFU−Sは、より未熟な多能 性幹細胞を反

映するとされている（Hodgs㎝andBradley，1979；Mag1ieta1．，1982）。

3．血液幹細胞の加γ伽。における検出

 血液細胞を加物。でクローナルに増殖させる培養法は、Metca工fら、およびSachs らのグループによって最初に開発された（P1uznikandSachs，1965；Brad1eyand Metca1f，1966）。この方法は、寒天あるいはメチルセルロースを含む半固形培地中 で細胞を培養し、成熟した血液細胞からなるコロニーを形成させるものである。

形成されるコロニーは穎粒球やマクロファージなど単一の系列の細胞だけを含む ものから、2つ以上の系列の細胞を含むものまで種々あり、若干のCFU−Sも含ま

○ぺ

幽州

IL−1 IL・2 IL−3 IL．4 1L・5 IL・6 IL−7

         幽

       IL・3

       単◎→⑱幽        κ隻…◎幽

        州⑬幽

         Iレ3IL．4

㎜… ⑱幽

        GM・CSF

       ⑧

⑧・1舳

⑱幽

囚1−1血球分化の模式図

BFU−E（burstformi㎎㎜it，erythroid）；前期赤芽球系前駆細胞、CPU−E（co1onyfomi㎎unit，

卯hroid）；後期赤芽球系前駆細胞、CFU−GM（gram1ocyte−macrophageco1onyfomingunit）；穎 粒球およびマクロファージに分化しうる前駆細胞、CFU−Meg（megakaryocytecol㎝yfomi㎎

㎜it）；巨核球系前駆細胞、Epo（erythropoiedn）；エリスロポエチン、IL−3（inter1eukin3）；インタ ーロイキン3，GM−CSF（GM−co1㎝y sdmu1ati㎎factor）；穎粒球一マクロファージコロニー刺 激因子、G−CSF；穎粒球コロニー刺激因子、M−CSP；マクロファージコロニー刺激因子。

れるものの一般に自己再生能には乏しい（Metca1feta1．，1979；Humphrieseta1．，1979；

Sudaeta1．，1983a；Sudaet吐，1983b）。したがってこの培養法で検出される幹細胞

 加γ伽0コロニーを形成させるためには何らかの液性因子が必要である。初期に は腎細胞や胎児細胞などを支持細胞として用いたり（P1uznikandSachs，1965；

Brad1eyandMetc砒，1966）、脾細胞の培養上清などが用いられたが（Johns㎝and Metca1f，1977）、現在では種々のCSFが同定され遺伝子のクローニングも進み、リ

コンビナントのCSF標品を得ることができるようになった（図1−1） （Kawasakiet

a1．，1985；Tsuchiyaeta1．，1986；Wongetaし，1985；Fungeω．，1984；Yokotaeta1．，1984）。

例えば、CSF−1／M−CSFはマクロファージの前駆細胞を、G−CSFは穎粒球の前駆細 胞をそれぞれ刺激してコロニーを形成させる。GM−CSFは、これらの細胞に加え

てマクロファージと穎粒球の共通の前駆細胞をも刺激して、2つの系列を含むコ

ロニーを形成させる。インターロイキン3（Interleukin−3，IL−3）はmu肘i−CSFとも

るというものである（Instmctivemode1） （Sachs，1987；Metcalf，1989）。もうひと

つは血液幹細胞の分化は無作為的に起こり、特定の系列に分化した細胞をCSFが

増殖させるというものである（Stochas此mode1） （Sudaeta1．，1984）。近年、各造

より具体的な細胞内シグナル伝達経路の問題として議論されてきている。各CSF により生じるシグナルは、増殖と分化のバランスをそれぞれに違った度合いで調 節するが、分化の決定それ自体は無作為的に起きるとする新しいモデルはその1 例である （Hyb㎡dmode1） （Justeta1．，1991）。

4．長期骨髄細胞培養法（Long−tembonemarrowcu1ture）

 上述した種々の造血因子を用いても、加γ伽Oで長期にわたって造血を維持する ことは困難である。実際に造血が行なわれている骨髄中には細網細胞、脂肪細胞、

血管内皮細胞、マクロファージなど種々の細胞や細胞外マトリックスが存在し、

これらによって形成される造血微小環境が造血の維持に重要な役割を持つと考え

一4一 一5一

i

られる（Bent1ey，1982）。造血微小環境を加〃帥で再現する培養法はDex倣らによ って最初に開発された（Dex倣eω．，1977）。この方法は骨髄の内容物を小塊状に ほぐして適当な液体培地で培養するものである。Dexげ培養は、ストロマ細胞と呼 ばれる基質接着性の間質支持細胞層とその上で増殖する血液細胞から成り立って いる・この血液細胞中には血液幹細胞も含まれており、CFU−Sの増殖も観察され

る（DexterandTesta，1980）。しかしながらリンパ球はこの培養中には存在しない。

Bリンパ球の産生を維持する培養系はWhi口。ckとWit屹により開発された（Whi口。ck andWit胞，1982）・Whid㏄k−Witte培養もDe池r培養と同様に、ストロマ細胞層が造 血の維持に必須の役割を果たしている。初代培養中のストロマ細胞層はマクロフ

ァージや脂肪細胞などを含んだ雑多な細胞層である。そこでストロマ細胞クロ

ーンが相次いで樹立された（Kod㎝aeta1．，1982；Co11insandDorshkind，1987；H㎜tet

造血に必要な全ての分子を発現しているものと考えられる。この分子が何である か，この分子は実際に骨髄での造血を制御しているか等の点が解決すべき重要な課

題として残された。

 ストロマ細胞株の樹立は、血球の増殖と分化に関する研究に新たな道を開いた。

Bリンパ球産生を支持するストロマ細胞株を用いることで、ウイルス感染に頼る ことなくBリンパ球クローンを樹立することが可能になり、Bリンパ球のがん化

機構の解析にも優れた材料を与えた（Whi口㏄keta1．，1984；Schwartzeta1．，1986；

Tomimgaeta1．，1989；Ogawaeta1．，1989）。また、ストロマ細胞が産生する造血因子 の解析から、インターロイキン7（Inter1eukin−7，IL−7）がBリンパ球のストロマ細

デルが提出された（Nishikawaet刮．，1988；Sudoet副．，Ig8g；Hayashieta1．，1ggo；Eraet

a1．，1991）。

  5．血液幹細胞の純化

  血液幹細胞が脾コロニー形成や造血の再構築などのように機能的にのみ検出さ

・ れるものである限り、それは概念的なものと言えるかも知れない。血液幹細胞は  全血液細胞10万個に1個の割合で存在すると考えられているが、これを純化する

試みがなされてきた・Weissmanのグループは、マウスから成熟血液細胞の表面マ ーカーを発現せずTリンパ球抗原であるThy−1を弱く発現し、Sca−1抗体で認識さ れる細胞（Thy−1−ow，Lh，Sca−1＋）をフローサイトメトリーを用いて分画した

（SpangmdeetaL，1988）。この細胞は形態的には芽球でり大部分はG0〜G1期に ある・加γル。のアッセイで・この細胞は移殖12日後に検出されるCFU−S（day12 CFU−S）そのものであり、30個の移殖で致死量の放射線を照射されたマウスの50

％を30日間生存させることがわかった。この結果は、day12CFU−S自体が均一な 幹細胞ではないことを示唆している。純化さ札た幹細胞を個々に移殖することに

より血液幹細胞の多能性が最も直接的に示されたが（Smitheta1．，1991）、同時に、

脾コロニー形成のメカニズムなど幹細胞の機能を分子的に問いなおす必要性が改

めて強調されはじめた。

6．造血の個体発生

 マウスの胎生期で最初に造血が観察されるのは胎生7．5日齢の卵黄嚢においてで ある。この時期の卵黄嚢に胚型の有核赤血球から成る血島（b1oodis1and）が形成

される。胚型のヘモグロビンを産生するこの未熟な赤血球は胎生9日に胎仔側へ 循環するようになる（Barker，1968）。卵黄嚢造血は胎生13日あたりまで続くが、

活発な造血部位はそれより前に胎仔肝に移行している。胎仔肝造血は胎生10日に 始まり、生後もユ週齢程度まで続く。無核の成熱型赤血球は造血部位が胎仔肝に 移行した後に作られる。さらに、胎生後期になると造血部位は脾臓と骨髄に移行 する。骨髄造血は胎生16日に初めて観察される。

 このような造血部位の移行は、血液幹細胞の移動（migradon）を反映している のだろうか。血液幹細胞は実際に卵黄嚢に由来するのだろうか。鳥類においては ニワトリの卵黄嚢とウズラの胚のキメラを用いた実験から、卵黄嚢の造血は一時 的なもので成鳥の造血を支える血液幹細胞は胎仔側の大動脈に由来することが示

されている（Die敏1eローLievre，1975）。一方でマウスの血液幹細胞の個体発生につ

れている（Hanisoneta1．，1979；S㎝odaeta1．，1983）。幹細胞が卵黄嚢で発生すると

7．遺伝的貧血マウスの解析

 マウス第5染色体のW（domin㎝tspo血ing）遺伝子座の突然変異は、皮膚色素細 胞の欠損、生殖細胞の欠損および大球性貧血を引き起こす（Russe11．1979）。囎 伝子座には多くの対立遺伝子が知られており、そのほとんどが半優性である。ホ モ接合体、および対立遺伝子同士の接合体は、白毛（目は黒色）、不妊、重篤な 貧血症状を示し、胎任期あるいは生後すぐに死ぬことも多い。正常遺伝子とのヘ テロ接合体は自いスポットを持つが、妊娠可能であり貧血症状も軽い。w遺伝子 座の突然変異とほぼ同じ症状が第10染色体の∫7（s肥e1）遺伝子座の突然変異によ

っても引き起こされる（Russe11．1979）。∫臆伝子座にも多くの対立遺伝子が存在 する。皮膚や骨髄の移殖実験から、w遺伝子座の突然変異は色素細胞と血液細胞 のそれぞれの前駆細胞に何らかの欠損をもたらし、∫臆伝子座の突然変異は、こ れらの細胞にとって必要な環境側因子の欠損をもたらすことが示された。

 w〃マウスと∫〃戸マウスは成獣になるまで生存するので、研究に多く供されて いる・W以マウスは加γル。で肥満細胞を欠損しているが、骨髄細胞をIL−3存在下

に培養することでIL−3依存性肥満細胞株を樹立することができる（Kiωmura，1989）。

正常マウス由来肥満細胞株を、正常マウス胎仔から樹立した繊維芽細胞株の上で 培養するとIL−3なしで増殖する。しかし、W〃マウス由来肥満細胞株はこの繊維 芽細胞株の上で増殖することができない。同様に、∫〃戸マウス胎仔から樹立した 繊維芽細胞株は、正常な肥満細胞株の増殖を支持できない。これらの結果は、繊 維芽細胞などのストロマ細胞は、∫猶伝子座にコードされる何らかの増殖因子を 発現しており、この増殖シグナルを受け取るためにはw遺伝子産物が必要である

ことを示唆した。

 これら突然変異マウスの分子的な解明はまずW遺伝子座でなされた。W遺伝子

座は癌原遺伝子である。批をコードしている（Chaboteta1．，1988；Geiss1ereta1．，

1988）。c一雌遺伝子産物は受容体型チロシンキナーゼであり、血小板由来成長因 子（PDGF）受容体やM−CSF受容体（c一価8癌原遺伝子産物）と同じ受容体型チロ

シンキナーゼのサブファミリーに属している（Qiueta1．，1988；Majumdereta1．，1988）

（図1−2）。W遺伝子座の対立遺伝子のそれぞれが。一火並遺伝子のいかなる突然変異

1990；Hayashietal．，1991）。最近になって肥満細胞の増殖に活性を持つ成長因子

ードしていることが示された（Nochaeω．，1990a；Wi11iamseta1．，1990；Cope1andet a1．，1990；F1anagan and Leder，1990；Zseboeta1．，1990a；Martineta1．，1990；Zsebo eta1．，

1990b；Huangeta1・・1990；Andersoneta1・，1990）・この分子はMGF，KL（kjtligand）、

SCF（stemce11曲。tor）という呼称でそれぞれ同時に報告されたが、ここではSLF

（stee1factor）という呼称を用いる。SLFは肥満細胞のみならず未熟な血液前駆細 胞に対しても増殖活性を持つ。SLFは細胞膜結合型と遊離型の2つの型があるが 両者とも活性に差はない。SLFの受容体は。一〃遺伝子産物（以下、c−kit分子と表 記する）そのものである。wおよび∫峡然変異マウスの解析結果と考えあわすと、

c一㎞t分子とそのリガンドであるSLFが血液細胞、色素細胞、生殖細胞に重要な役 割を持つことが示唆される。しかし、このような遺伝学的な解析からはその実際 の機能を明らかにすることはできない。したがって、 R体を用いるなどして、こ れらの分子の機能を任意に阻害したときに、生体にどのような影響が及ぼされる か解析することが必要となる。

    I    II    III   IV    V

       S

       S＼  ノ  、、、、、

NH2

    s   −s       ATP

I1：Xtm㏄11㎜量蛆dOmaim       I山『a㏄11㎜1町d0㎜aim

図1−2c−k鑓伝子産物の構造

。−kit分子は免疫グロブリンスーバーファミリーに属し、細胞外領域に5つの免疫グ ロブリン様ドメインを持つ（I−V）。細胞質領域のキナーゼドメインはATP縞合部 と燐酸化部位とに分けられる。（Mψmdereω．，1988より）

一8一 一9一

8．本研究の目的

 血液細胞の分化を決定する分子メカニズムを解明するうえで、血液幹細胞を純 化し加物0で分化を再現させ、そこで起こる分子的事象を追跡することは有益な 手段のひとつであろう。そのためには血液幹細胞の増殖を自由に操作する必要が ある。そこで本研究では、血液幹細胞の増殖を調節する分子を明らかにすること を主な目的とした。最初に、モノクローナル抗体の投与により。−kit分子の機能を

阻害することで恒常的な骨髄造血における。−kit分子の役割を解析した（第2章）。

次に、造血システムが個体発生する動的な過程をストロマ細胞株を用いて解析し た（第3章）。最後に、胎生期造血を。−kit分子と他の分子がどのように制御して いるカ＼抗体の投与と分子生物学的手法を用いて解析した（第4章）。

第2章 骨髄造血における。−k並の役割

1．はじめに

 造血は骨髄内の多能性血液幹細胞が恒常的に自己再生しながら多様な系列の血 液細胞を産生する過程である◎この構成的骨髄造血に対して、生体に侵入した異 物に抵抗するために特定の血液細胞の産生を増強し、炎症局部に動員する誘導的 造血も存在する。構成的造血を支える分子を探る試みは、加y他0コロニー培養法 の確立から始まった（P1uznikandSachs，1966；Brad1eyandMetc山，1966）。このな かで十種類を越える造血因子が同定されたが、これらの因子のうちのどれが実際

に構成的造血に関与しているのか不明である。IL−3とGM−CSFは多能性幹細胞を増 殖させる活性を有しており、その候補としてあげることができる（Sachs，1987；

Metca1f，1989）。しかし、いくつかの点はこれら2つの因子が構成的造血に関与す ると考えることを困難にしている。第一に、IL−3は骨髄中で検出されない・第二 に、IL．3とGM−CSFのいずれをも発現しないストロマ細胞株が血液幹細胞の増殖を 支持する。IL−3とGM−CSFがTリンパ球から産生されることから、これらの造血因 子は誘導的造血に関与するものと考えられる。

 遺伝的に貧血を呈する∫燦然変異マウス、およびw突然変異マウスの解析から、

造血因子SLFと、その受容体である。−kit分子が、構成的造血に少なくとも何らか の役割を担っていることが明らかにさ札た（Russe11．1979；Kitamura，1989）・SLF は骨髄から多種の血液細胞を含むコロニーの形成を単独で誘導することができる

（Andersoneta1．，1990；Zseboeta1．，1990a；M㎞neta1．，1990）。しかし、これら突然 変異マウスを用いた遺伝学的解析と純化された因子の加γ伽Oでの解析のみでは・

成熟個体の構成的造血におけるこれらの分子の役割を明らかにし得ない。なぜな ら、c．kit分子を欠損したWWマウスは生後1週程度しか生存しないので成獣骨髄 中でのこの分子の機能を知ることができないからである。また、SLFは血液幹細 胞といくつかの系列の血液前駆細胞に対して増殖活性を有しているが・このこと から直ちにこれらの細胞の骨髄中での増殖がこの分子によって支持されていると 結論できないことは1L−3の例からも明らかである。c一雌は脳においても発現が認 められるが、現在までW突然変異マウスに脳の障害は報告されていない（Geiss1er

eta1．，1988；Nockaeta1．，1989）。したがって受容体分子の発現と機能は必ずしも相

関しない。

 以上のことから、本研究では次の2点について明らかにすることを目的とした。

1）骨髄の中でどの細胞が実際に。一雌を発現しているか。2）c一雌を発現する細 胞においてこの分子は実際に機能しているか、またその機能は何か。このために、

抗C一㎞tモノクローナル抗体をアンタゴニストとして利用し、C一〃依存性の造血を 加vル。で任意に阻害することでこの分子の役割を解析することとした（0gawaet

a1．，1991）。

2．材料と方法

2−1．マウス

 C57BL／6マウスおよびWB−W件マウスは日本SLC（静岡）から購入した。

WB−WWおよびWB一十〃マウスはWB−W件マウスの交配により得た。

2−2．モノクローナル抗体と細胞の染色

 本研究では以下のモノクローナル抗体を用いた。抗B220抗体RA3−6B2（Bリン パ球マーカー） （Coffman，1986）、抗μb抗体MB86（免疫グロブリンμ鏡アロタ

イプ） （Nishikawaeta1．，1986）、抗Mac−1抗体M1ρO（穎粒球、マクロファージマ

（Spangmdeetal．，1988）、抗CD4抗体GK1．5（Tリンパ球マーカー）（Dia1ynaset a1．，1983）、抗CD8抗体53−6．72（Tリンパ球マーカー） （LedbetterandHerzenberg，

1979）、抗赤血球抗体TER−119（此utaeta1．，1990）。

 抗。−kit抗体は、以下に示すようにWB一十／十マウス由来IL−3依存性肥満細胞株をラ

ットに免疫して作製された（Nishikawaeta1．，1991）。WB一≠ルおよびWB−W年マウ

髄から樹立された（Nakanoeta1．，1987）。WB一≠〃由来肥満細胞株2x107個をWister

ラットに2回免疫し、脾臓細胞をX63，653．Ag8ミエローマ細胞と融合させた

（Nishikawaeta1．，1986）。得られたハイブリドーマのうち、WB一〃≠由来肥満細胞

長期骨髄培養に添加された場合に増殖阻害活性を示した（結果参照）。

 細胞の抗体による染色は、FITCまたはAPCで標識された精製抗体か、ハイブリ ドーマの培養上清をそのまま用いた。培養上清の場合は2次抗体としてFITCで標

識された抗ラットκ鎖抗体MAR−18．5（Laniereta1．，1982）を用いた。染色された細 胞の解析にはEpics肝。me（Cou1胞rE1㏄tro㎞csInc．，Hi創eah，FL）とFACS㎡i㎎

（Becton−Dichn1onl㎜unocytome岬Sy1tem1，Sanlo1e，CA）を用いた（Haya1hiet

a1．，1990；Moo肥and Kautz，1986）。

2−3．抗体の投与

 1日おきに1mg、あるいはO，1mgの精製された抗体をC57BL／6雄マウスの尾静 脈内に投与した。それぞれの回数の抗体投与を受けたマウスを頚椎脱臼により屠 殺し、骨髄細胞を採集し後述の方法で解析した。

2−4．加舳。コロニー形成法

 直径3．5cmのシャーレあたり2x104個の骨髄細胞を1m1の半固形培地中で培養し た。半固形培地はα一MEM（GibcoLaboratodes，GrandIs1and，NY）に1．2％メチルセ ルロース（Me血。ce1A4M、室町化学工業、東京）、30％牛脂仔血清（FCS）

（HyC1one，LotNo．1115741，HyC1one騎㎞ratodes Inc．，Logan，UT）、1％牛血清ア ルブミン（BSA） （SigmaChe㎞ca1Co．，St．Louis，M0、脱イオン化したもの）、

50μMβ一メルカプトエタノール（2ME）およびサイトカインを添加して用いた

（Sudaeta1．，1989）。サイトカインはリコンビナントのIL−3（200U／m1）、IL−7

（20U／m1）、GM−CSF（100U／m1）をそれぞれ用いた（Hayashietal．，1990；Sudaet

00。インキュベーター内で7日間培養した後、40個以上の細胞から成るコロニ ーを計数した。

2−5．脾コロニー形成法

 24時間前に9GyのX線を照射されたC57BL！6雌マウスに、5x104個ないしは 2．5x105個の骨髄細胞を尾静脈注射した。8日後あるいは13日後に脾臓を摘出し、

ホルマリン／酢酸／エタノールで固定しコロニーを肉眼的に計数した（Hodgson

一12一 一13一

量

andBrad1ey，1979；Magheta1．，1982）。生理食塩水のみを注射した場合のバックグ

2−6．ストロマ細胞株による骨髄細胞培養法

 ストロマ細胞株MC3T3−G2／PA6（PA6）は、Kodamaらによりマウス新生行頭骨 から樹立された（Kod㎝aeta1．，1982）。PA6はCFU−Sなどの血液幹細胞やマクロ

ファージ、骨髄球系細胞の増殖を単独で支持することができる。また、IL−7共存

下でBリンパ球の増殖も支持する（Sudoeta1．，1989）。

 PA6をT25フラスコにうえこみ、α一MEM、工O％仔牛血清（CS） （HyC1oneLot No．2151765）で飽和に達するまで培養した。培養液をRPM11640（Gibco）、5％

CS，50μM2MEに交換し、1x105個の骨髄細胞をPA6細胞層と供培養した。一部 のフラスコにはさらに抗。一㎞抗体10μ9／m1を添加した。1O日間の培養の後にピペ

ッテインクにより細胞を回収し、血液細胞数を計測した。

2−7．骨髄細胞からの。−kit陽性細胞の除去

 C57BL／6マウスの骨髄細胞1x107個を、ACK4抗体、ないしは抗B220抗体（RA3

−6B2，Bリンパ球マーカー）で処理した後、1m1のイーグルMEM，5％PCSに浮 遊させた。抗ラットIgGでコートされた磁気ビーズ（DynabeadsM−450，Dyna1，

Os1o，Norway）4x108個を1m1の同じメディウムに浮遊させ、細胞浮遊液と混合し た。氷上で30分間インキュベートした後、磁石に磁気ビーズを固定し、抗体に結 合しない細胞を含む上清を回収した（V航daleta1．，1987）。細胞の回収率はおよそ 30％であった。回収された細胞の一部を抗ラットκ鎖抗体（MAR18．5）で染色し

て陽性細胞の混入率を調べ、残りの細胞のコロニー形成能を解析した。

3．結果

3−1．抗。−kitモノクローナル抗体

 マウスの骨髄細胞をIL−3存在下で培養することによりIL−3依存性肥満細胞株を樹

立することができる（N吐ameta1．，1987）。IL−3依存性肥満細胞株は、c一〃を強く 発現している（Nockaeω．，1ggoa；Wi11i㎝seta1．，lggo；Zseboeta1．，1ggoa）。WW

昌ω

o。

一_θ 崖』 言

z

、巳

凶的

竜 銘

スは。−kit分子の細胞膜貫通領域をコードするエクソンのスプライスドナー部位に 点突然変異を有している（Hayashieta1．，1991）。そのために引き起こされる異常 なスプライシングによってこのマウスは膜貫通領域を欠損した。−kit分子しか産生 することができない。したがってWWマウス由来の肥満細胞株はその細胞表面に C地分子を発現しないと考えられる。そこで、正常マウス由来の肥満細胞株をラ

ットに免疫し、正常肥満細胞株を認識するが〃Wマウス肥満細胞株を認識しない

モノクローナル抗体が樹立された（図2−1）。この抗体は。−kit蛋白の分子量に一致

十／十

W／W

      Log F1凹。rescence Imtemsity

図2−1流。一㎞tモノクローナル抗体による肥満細胞株の染色

正常マウスおよびWWマウスから樹立した1L−3依存生肥満細胞株をACK2とACK4で染 色した（太い実線）。対照には枕CD4抗体を用いた（細い実線）。

する145㎜および160kDの分子を認識する（Nockaeta1．，1989）。また、c一〃遺伝 子を導入されたCOS7細胞がこの抗体で認識されるようになることからも、樹立さ

れた抗体が。−kit分子の細胞外領域に結合すると結論された。

 正常マウス骨髄細胞をストロマ細胞株PA6土で2週間培養し、増殖した血液細 胞を抗。也t抗体で染色した結果を図2−2に示した。ストロマ細胞上で増殖する血液

。岩

一 1

り

↑

ノ

、 ^○

一一

rMac−1

図2．2PA6細胞層上で増殖した血液細胞における。地の発現

正常マウス骨髄細胞をストロマ細胞PA6土で2週間培養し、増殖した細胞をACK4と Mあ．1で2重染色した。それぞれの軸は相対的蛍光強度を対数で示した。2o％の細胞

が。一㎞t分子を細胞表面に発現しており、そのほとんどはMac−1陽性である。

細胞のおよそ20％が。−kit分子を表面に発現していた。Wぴマウスの骨髄細胞が PA6細胞上で増殖できないことから骨髄細胞培養は。−ht分子に依存していると考

えられる。ストロマ細胞上での血液細胞の増殖が抗C−ht抗体によって抑制される か否かを検討するために、骨髄細胞をPA6細胞上で抗体の存在下に10日間培養し 細胞数を計測した（図2−3）。樹立された4種の抗体のうちACK2とACK45の2種 が明らかな抑制効果を示した。ACK4とACK30は対照と比べて顕著な抑制を示さ

なかった。ACK2とACK4は相互に。舳秀子への結合を阻害しない。抗体の認識部

一16一

Nome

8 ACK30

弓

O ACK4θ

0

く

ACK2

104  105  106  107

   No．ofce㎜s per掘ask

図2−3 マウス骨髄培養系に対する抗。一㎞航体の影響

正常マウス骨髄細胞1x105個を抗。−1d航体の存在下にPA6土で一0日間培養し、細胞数を 計測した。

位の相違により、前者はSLFの。−kit分子への結合を阻害するが、後者は阻害でき ないものと考えられる。後述する骨髄造血の阻害実験にはACK2を用いることとし

た。

3−2．骨髄細．胞における。一雌の発現

 正常のC57BL／6マウスの骨髄細胞における。一砒の発現をACK2と他のマーカーを 用いて解析した。図2−4に示すように、骨髄中には。一雌を強く発現する細胞と弱く 発現する細胞が共に存在した。c一批を強く発現する細胞はB220，CI）4，CD8，

TER119，Gr−1，Mac−1など成熟血液細胞のマーカーを発現していない。この細胞 は全骨髄細胞中の3．3±0．3％を占めていた。c一雌を弱く発現する細胞はGト1と Mac−1を発現していた、しかし、c地陽性、B220陽性細胞、あるいは。・kit陽性、

皿三R119陽性細胞はほとんど検出されなかった。6一雌を弱く発現する細胞を含める

一17・

と。−kit陽性細胞は全骨髄細胞中の7．8±O．6％を占めていた。

（

o

き。。。。例。。）

ミ

Gト1⑰ITC）

｝

一慶1一

・σ

寺）

ヨー． O一 念ε

、8−

o

TER119四ITC）

Mac−1（FITC）

・一一上伸⊥控L」≡望］・腰⊥」一・

       ㍗

、＿ 1

1      i●         1●0       −      1・         二■

Lh．（FITC）     Gト1（FITC）

図2−4 マウス骨髄細胞における。一〃と血液細胞マーカーの発現

C57BL／6マウスの骨髄細胞を正常ラット血清でインキュベートした後、それぞれの抗 体で染色した。細胞を洗った後propidiumiodide（PI）で染色し、フローサイトメトリー

で解析した。P1で染色される死細胞はゲートから除外した。

3−3．血液前駆細胞による。一雌の発現

 骨髄中の血液前駆細胞がC一雌を発現しているか否かを次に検討した。正常マウ スの骨髄細胞を抗。−kit抗体ACK4あるいは抗B220抗体6B2で処理し、抗ラットIg抗

体をコートした磁気ビーズを用いて抗体が結合した細胞を除去した。この操作で それぞれの陽性細胞の90％以上が除去された。陽性細胞を除いた分画中の血液前

駆細胞の頻度を調べた結果を表2−1に示す。c−kit陽性細胞を除いた場合、IL−3，

GM−CSF，M−CSFに応答するコロニー形成細胞とCFU−Sの頻度が著しく減少した が、IL−7に応答するBリンパ球前駆細胞は減少しなかった。これに対してB220陽 性細胞を除いた場合は、この抗原を発現しているBリンパ球前駆細胞（CFU−IL−7）

のみが減少し（Sudaeta1．，1989；Leeeta1．，1989）、他の血液前駆細胞は減少しなか

く）の細胞表面に。−kit分子が発現されていることを示している。

D・p1・d㎝・f・一kiナC・11・E1imi・・肥・H・m・p・i・d・P・・g・・it…f・・mB…M㎜・w・fB6Mi・・

      N。．。fCFU／105。、u。§

Bone Man．ow  Ce11S＊

        CFU−S  CFU−IL3  CFU−GM   CFU−M

^CFU−IL7

  Con血〇五  18．0±6．0 616．7土44．3 403．4土31．0 326．7土五5．2

  ．十。−k1t dep1eted  O．2±0，2  15．0土10，0 20．0土8．7  3．3土5．8

B22♂d・p1・t・d20．0±5．5818．4土59．1548．4土345476フ土49．3

93．3＝土2．9

78．3＝ヒ11．5

5．O土5．0

＊理磁、：脇農鵜鵠鵠鵠欄膿蝋買撚、、、、

were incubatedin1ml ofsemiso1idmedium containing various cytokines for

鎌鐵驚繍；鱗懲曇撚灘鷺灘犠繍㍍

The sp1eenwas肥moved㎜d五xed8days afterinjection a皿d the co1onies was counted．

§M、㎜・S・1。、耐。1i、。帆

表2−1c−kit陽性細胞を除去したマウス骨髄細胞中における血液幹細胞の頻度

▼

3−4．抗。−kit抗体の投与による貧血の誘発

 前節で述べたように、骨髄中の血液前駆細胞はC一〃を発現しているが、これら

の細胞において、実際に。−kit分子が加γル。で何らかの役割を果たしているのかを

を利用した（Nishikawaet早1．，1991）。すなわち、もし血液前駆細胞が発現する

。一㎞t分子が㎞vル。で機能しているならば、ACK2のマウスヘの投与により重篤な貧

血が誘発されるはずである。

 1mgの精製されたACK2を1日おきに正常C57BL／6マウス静脈内に注射し、骨 髄細胞をMay−GmenwaldGiemsa染色、フローサイトメトリー等の方法により調べ た・抗体サブクラスが一致した対照としてMac−1を同様に投与した。抗体の投与 開始12日後の骨髄細胞の形態を図2−5に示した。Mac−1を投与されたマウスの骨髄

細胞の形態は、抗体を投与されないマウスのそれと顕著な差は認められず、輪状 の核を有する好中球、前骨髄球、芽球、マクロファージ、リンパ球などが観察さ れた。一方、ACK2を投与されたマウスの骨髄中には骨髄球系細胞やマクロファ ージが観察されず、ほとんどがリンパ球で占められていた。フローサイトメトリ ーによる解析から、ACK2を投与されたマウスの骨髄細胞のおよそ90％がB220陽 性のBリンパ球であり、Mac−1陽性の骨髄球マクロファージ系細胞、不服119陽性 の赤血球前駆細胞は検出さ札なかった（図2−6）。Bリンパ球のうち16％はIgM陽 性であった。

A        正

A      B      C

・φ◆  参・    w ○

      少．

㌻

、紛一 、

○灘、

ゆ約

ミ書

M3c・1

6B2

TER119

Comt

Mac．1

6B2

TER119

図2−5抗体を投与されたマウスの骨髄細胞の形態

抗体を投与されないマウス（A）、lmgのACK2（B）およびMac−1（C）を6回投与さ れたマウスの骨髄細胞標本をMay−Gruenw刻d染色した。スケールは20μmを示す。

Log F1㎜orescence Intensity

Comt

図2−6ACK2を投与されたマウスの骨髄細胞における各血液細胞マーカーの発現

抗体を投与されないマウス（A）、lmgのACK2を6回投与されたマウス（B）の骨髄 細胞を6B2（B220）、Mac−1，TER119で染色し、フローサイトメトリーで解析した。

陽性率は図2−7（12日目）に示す。

 ACK2を投与されたマウスの骨髄中におけるB220，Mac−1，TER119陽性細胞の 割合の経時的変化を図2−7に示した。Mac−1陽性細胞とB220陽性細胞は投与開始後

一20一 一21一

1

幸

e』 畠

；

畠

畠

．目

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o^易

畠 亭

1④0

80

60

40

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一十一 B220

一→｝一 Mac−1

＋ TER119

0      5     10     15

1）ayS

図27ACK2を投与されたマウスの骨髄中における各マーカ…陽性細胞の経時的    変化

1日おきにlmgのACK2を投与されたマウスの骨髄細胞における各血液細胞マーカー の陽性率をフローサイトメトリーを用いて解析した。

4日までは顕著な変化を見せないが、その後、Mac−1陽性細胞が急速に減少し、

同時にB220陽性細胞が増加した。全骨髄細胞数は8日目で対照の約半数に減少し たが12日めには正常値に回復した。このことはB220陽性細胞がACK2の存在下で 活発に増殖したことを示唆する。TER119陽性細胞はMac−1陽性細胞より早く減少

した。以上の結果から、ACK2の投与によりBリンパ球以外の成熟血液細胞が骨髄

から消失することが示された。

3−5．抗。−kit抗体の投与による血液前駆細胞の消失

。一雌が血液前駆細胞で機能←ているかを検討するために、ACK2を投与されたマ ウスの骨髄中におけるコロニー形成細胞の頻度を調べた（図2．8）。

〉150

看 100

ち

目

oθ

＄ 50

0

（627）     （547）

一÷一 IL．7

一一揶鼈?IL−3 一一｡一一 GM−CSF

一一O− M−CSF

0      5      10     15

DayS

図2−8ACK2を投与されたマウスの骨髄中におけるコロニー一形成細胞の    経時的変化

1日おきに1mgのACK2を投与されたマウスの骨髄細胞における各造血四手に応答性 のコロニー形成細胞の頻度を、正常マウスを100として規格化して表した。8口日及 び12日目のCFU−IL−7の値は括弧内に示した。

IL−3，GM−CSF，M−CSFにそれぞれ応答する血液前駆細胞は成熱血液細胞に比し て速やかに減少した。1mgのACK2を1回投与するだけで2日後にはこれらのコ ロニー形成細胞は骨髄から消失した。一方、IL−7に応答するBリンパ球前駆細胞 は5〜6倍に増加した。これは、ACK2存在下でBリンパ球が増殖した前節の結果 を裏付けると考えられる。コロニー培養時にACK2を添加してもコロニーの形成は 影響されないので（図2−9）、上述した血液前駆細胞の消失は抗体の培養系への持 ち込みによるためではないと考えられる。

 図2−8で注目すべき点はCFU−IL−3，CFU−GM，CFU−Mのいずれもが同時に消失 することである。この結果は、これらのコロニー形成細胞の維持に。−kit分子が等

しく機能していることを示唆する。これらのコロニー形成細胞のACK2に対する感

 り  ㊥ り 岬θ

一  』 o

 o

 ω⊇ 呂。  0一  6z

600 500 400 300 200 100 0

Comlro1

ACK2

CFU．IL3CFU−GM CFU−M CFU−IL7 図2−9 コロニー培養系に対するACK2の影響

．Iド常マウス性髄細胞中のコロニー形成細胞の頻度をACK2存イビ化および非存在化に 測定した。

受性が異なるか否かを検討するために、ACK2の投与量を0．1mgに下げてコロニ ー形成細胞への影響を調べた（表2−2）。O．1mgのACK2を2回投与した場合にも コロニー形成細胞は減少したが、減少率は1mg投与時に比べて小さくそれぞれの コロニー形成細胞間で大きな差は認められなかった。従って、血液前駆細胞の ACK2に対する感受一性には顕著な差がないと考えられる。ACK2は精子形成を阻害 するが、その場合にはO．1mgで十分な効果を示すことから、c一㎞t分子が機能して

いる臓器間ではACK2に対する感受 性が異なるものと考えられる（Yoshinagaetal．，

i・p・e・・）。

3−6．抗。−kit抗体の投与によるCFU−Sの消失

 骨髄における血液幹細胞の維持が。一〃に依存しているか検討するために、1mg

E脆。ts ofACK2Administration on CFCs in the Bone Mlm・ow ofB6Mice       5

       No．of CFC／1x1O ce11s      ＊

Treatment

CFU−IL7   CFU−IL3   CFU−GM CFU−M

 COnt「01    188．3±20．2  485．O±34．6  358．3±41．3 ACK2（O．1mg） 335．O±43．3  100．O±25．9  125．0±11．9

ACK2（1mg）  228．3±1O．4   6．7±2，9   16．7±7．6

268．3ニヒ29，3 66．6±8．1  3．3±5．8

＊B6mice were given2shots ofO．1or l mg ACK2on alterate days．

ThenumberofCFCsinb㎝emamwwasdeteminedasdescribed

心鵜終1ニニ11．

表2−2 ACK2を投与されたマウスの骨髄中におけるコロニー形成細胞の頻度

E脆。ts ofAntibody Administration on CFU−S in the Bone Man ow of        B6Mice

    、  N。．。fCFU−S／1．105。。・。§

AnObody

Day8      Day13

Contro1       19．3±3．1     11．7±2．3

ACK2      0．4土0．4    1．5±O．4

M。。．1  20．0±6．0  ND¶

＊ B6mice were given6shots of1mg antibodies on every other day．

Fifty thousands bone ma血。w ce11s from the control mouse or Mac−1  treated mouse，or2．5x1O bone ma∬ow ceus ofACK2treated mouse  were injected into irradiated recipients．The sp1eens were removed  and fixed8or13days after the injection and the co−onies were counted．

§

Mean±SD的rquadruplicates．

¶N．td㎝。．

        表2−3ACK2の投与によるCFU−Sの消失

一24一

一25一

のACK2を6回投与されたマウスの骨髄中のCFU−Sの頻度を調べた。骨髄細胞を X線照射マウスに移殖してから脾コロニーを計数するまでの期間を8日間と13日 間の両方で検討した結果を表2−3に示す。Day8−CFU−Sの頻度は正常の2％に減少

していた。同様に、Day13−CFU−Sの頻度も減少したが、正常の10％以上のコロニ

ーが残存し、その大きさは対照群のものと区別することができなかった（図2−1O）。

㈱鰯＝ 鋤・

§③鮒構   職1徹

        図2−1O ACK2の投与によるCFU−Sの消失

抗体を投与されないマウス、およびlmgのACK2を6回投与されたマウスの骨髄中の CFU−Sの頻度を解析した。ACK2投与群は対照群の5倍量の骨髄細胞をX綴照射マウスに

移才直した。

4．考察

4−1．骨髄細胞における。一雌の発現

 抗。−kitモノクローナル抗体による染色結果から、骨髄中には。−kit弱陽性細胞と

。．kit強陽性細胞が存在することが示された。c−kit弱陽性細胞は穎粒球・マクロフ

ァージのマiカーであるM・・一1および・・一1を発現していた。おそら／Bリンパ球マ

TER119を。一〃Cと共に発現する細胞は存在しない。一方で。−kit強陽性細胞は成熟血

従って、c−kit強陽性細胞は未熟な前駆細胞であり、分化成熱するにつれて。．k〃の 発現量が低下し・ついには発現しなくなるものと考えられる。Ok，d、らは。．kit強

を示した（0kadaeta1・，inpress）。本研究の結果から、CFU．Sのみならず、

CFU−Mまで含めた広い範囲の血液前駆細胞が。一〃を発現していることが明らかで ある。今後・C一〃は血液幹細胞を純化するための優れたマーカーになると思われ

る。

4−2．抗。−kit抗体の投与による貧血の誘発

 C−k立は種々の血液前駆細胞で発現が認められるが、実際にこの分子はこれらの 細胞で機能しているだろうか。C−ht分子を細胞表面に発現することができない

WWマウスで骨髄造血が非常に抑制されていることから、血液前駆細胞の中のい

ずれかにとって。一〃が機能的に必要であると考えられる。c−kitのキナーゼ活性が

コロニー形成細胞は存在することが知られている（HarrisonandR，sse11，1972）。

この事実は、未熟な血液幹細胞の維持にはC一㎞t分子が必要であるが、分化の進ん だ前駆細胞はC一〃に依存しないことを示しているようである。この点を解明する ために・抗。一㎞抗体ACK2の。−kit分子に対する機能阻害作用を利用した。ACK2を 投与されたマウスの骨髄中では、CFU−SのみならずCFU−IL．3，CFU．GM，CFU．M が速やかに消失することが観察された。これらの血液前駆細胞の消失は、Bリン パ球以外の成熟血液細胞の消失をまねいた。この結果に対する可能なひとつの説 明は、抗体が細胞毒性を有しており、c−kit陽性の前駆細胞が死滅するために貧血 が誘発される・というものである。しかしながら、以下に述べる理由によりこの 説明は成り立たないと考えられる。第一に、腹腔肥満細胞は強くC．〃を発現して

一26一 一27一

いるが・ACK2の腹腔内投与は肥満細胞の数に何ら影響を与えない。第二に、精原 細胞と卵細胞は両者とも。一雌を発現しているが、ACK2の投与により精原細胞のみ が阻害される（Yoshinagaeta1．，inpress）。第三に、ACK2と同じIgG2bクラスの

Mac−1抗体も血液細胞を染めるが、Mac−1を投与されたマウスの造血は正常である。

第四に・IgG2bクラスの抗体をアンタゴニストとして用いた他の報告は抗体の効 果が細胞寮性によるものではないことを示している（Zuniga−Pnueckereta1．，1989）。

 別の可能性として、ACK2がリガンド類似の作用を有し幹細胞を刺激して分化さ せるために枯渇することも考えられる。しかし、ACK2を投与されたマウスにおい て成熟血液細胞の一時的な増加は観察されなかった。ACK2は加γ伽。において血液 前駆細胞に対するいかなるリガンド類似作用も認められない。以上より、ACK2は

アンタゴニストとして。−kit分子の機能を阻害するものと結論できる。ただし、

ACK2が。−kit分子とSLFの結合を実際に阻害しているか否かについては現在のとこ

ろ確かめられていない。

4−3．骨髄造血における。一〃の役割

 ACK2の投与による骨髄造血の阻害実験から、血液前駆細胞の維持に。．kit分子が 役割を担っていることが示された。SLFは多能性の前駆細胞を増殖させる活性を 持つことが報告されている（Andersoneta1．，1990；Zseboeta1．，1990a；Martineta1．，

1990）。多能性血液幹細胞の自己再生のみがACK2により阻害されても、より分化 した前駆細胞であるコロニー形成細胞の消失とそれに続く貧血が引き起こされる と予想される・しかし、ACK2の投与によりCFU−IL−3，CFU−GM，CFU．Mが同時 に消失した事実は考察すべき重要な点である。もし多能」性血液幹細胞のみが阻害 されたならば、未熟なCFU−IL−3の消失と分化したCFU−Mの消失との間に時間的な 差が生じるはずである。したがって、上記の結果は多能 性血液幹細胞のみならず 分化方向が決定された前駆細胞においても骨髄中で維持されるためには。．kit分子 が必要であることを強く示唆している。

 血液幹細胞の維持にも。一㎞t分子が役割を担っていることは、ACK2を投与された マウスでCFU−Sが減少したことからも明らかである。しかし、Day13−CFU−Sの一 部は残存していた。CFU−Sは一般には単一の幹細胞集団ではなく、多能性を持つ 未熟な幹細胞から一定の方向に分化が決定された幹細胞まで含むと考えられてい

る（HodgsonandBrad1ey，1979；Mag1ieta1．，1982）。Day13−CFU−Sはより多くの多

（Spangmde，1989）。ほとんどのCFU−Sが骨髄中で。−kit分子に依存して維持され

ている（P1㏄macherandBr㎝s，1989；Joneseta1．，1990）。X線に対して抵抗性を示

し、移殖後ある程度の期間を経たのちに長期にわたって骨髄造血を再構築する最 も未熟な多能性血液幹細胞（pre−CFU−S）は、いくつかの方法でCFU．Sとは異な

M皿1Φot㎝tstem㏄11s

ユ

pre・CFU−S

u㎜eagecommitted

       Mat㎜re㏄11s

工 工 ^1翻

CFU・S（曲y8）

CFU・S（day13）

C・肋dep㎝d㎝tgmWth

図2−11血液幹細胞の骨髄内増殖における。一〃の役割   成熟血液細胞は一般に｝〃を発現しないが、一部例外がある。肥満細胞は成熟して    も徴〃を発現しSLFに応答する。

る分画に分離することができる。Day13−CFU−Sの一部が残存したことのひとつの

説明として、Pre−CFU−Sが。−kit分子に依存していない可能性があげられる。ただ

し・c−kit陽性細胞をソーティングすることでこのような未熟な血液幹細胞が濃縮

一28一 一29一

ト