海生研研報，第 7 号 ， 1 ‑ 3 3 ，2004
R e p . Ma r . Eco l . R e s . I n s ， . t No.7 ， 1 ・ 3 3 ， 2004
二酸化炭素が海産魚卵および仔稚魚に与える影響
吉川￨貴志*
E f f e c t s o f CO
2on t h e e a r l y d e v e l o p m e n t a l s t a g e s o f m a r i n e f i s h T a k a s h i Kikkawa *
要約:二酸化炭素 ( C 0
2)海洋隔離が海洋生態系に及ぼす影響評価の一環として CO
2が海産魚卵・仔 稚魚に与える影響について研究を行った。
CO
2海洋隔離の生物影響予測を行う際に考慮しなければならないのは，海中に放出された CO
2は時空 間的に非定常状態であること，および CO
2放出により直接的な影響を受けるのは放出点近傍に生息する 深海生物であるという 2 点である
O現段階では深海生物の入手が困難であることから，本研究ではま ず入手可能な浅海生物を対象として，前者の非定常 CO
2影響を明らかにするための基礎的知見を得るこ とを目的として定常 CO
2暴露に対する影響把握に着手した。定常 CO
2暴露に対する致死影響については 高 CO
2および酸性水の毒性比較を行い，魚種や発育段階による高 CO
2耐性の違いを明らかにした。また 亜致死影響の調査では低濃度長期間の CO
2暴露による成長への影響を観察した。
従来 CO
2海洋隔離の生物影響予測のために塩酸や硫酸等の強酸を用いた低pH 海水に対する海産動物 の毒性試験データが用いられてきた。しかし CO
2と強酸では生物に対する生理学的作用メカニズムが異 なることが予測されたため，両者の毒性を比較する目的でマダイの卵と仔魚について C0
2と酸に対する 耐性比較試験を行った。 pH を等しく ( 6 . 2・ 5 . 9 ) した高 CO
2海水 (5・ 10%) と塩酸添加による酸性海 水中での死亡率は，卵・仔魚ともに CO
2区の方が有意に高い死亡率を示した ( p H 6 . 2: CO
2区 >60% ， 塩 酸 区 < 10% ， pH5.9: CO
2区 >90% ， 塩 酸 区 < 10%)0 CO
2海洋隔離の影響評価に酸性水の影響につい ての情報を適用することは影響の過小評価をもたらすことから不適当であり CO
2そのものを用いた耐 性試験が必要で、あるとの結論に至った。
マダイ，シロギス，ヒラメおよびスマを用いて初期発育段階における高 CO
2耐性実験を行った。瞬化 率・生残率は，全ての CO
2濃度区において暴露時間の増大に伴って低下した。マダイ・シロギスの発育 段階による高 CO
2耐性を調査したところ，発育段階によって高 CO
2耐性は大きく変化し，匹体期や仔魚 期に比べて卵割期と稚魚期は耐性が非常に低いステージであることが明らかになった(マダイ 6h‑LC
50( CO
2%) : 1 . 4 (卵割期)， 5 . 1 (腔体期)， 7 . 4 (前脊索屈曲期)， 4.3 (脊索屈曲期)， 4 . 6 (後脊索屈曲 期)および2 . 6 (稚魚期) ;シロギスも同様の傾向を示した)。また，高速遊泳魚であるスマの卵は他種 の卵と比較して，極めて高い CO
2耐性を有していた ( 6 h‑LC 5 0 : 1 2 . 0% (卵割期))。このように高 CO
2耐性は初期発育段階の中でも暴露時間や魚種・発育段階などの要因によって大きく異なることが明ら かとなった。
C0
2の亜致死影響を把握するため，マダイおよびシロギスを用いて稚魚の成長影響試験を行った。マ ダイ稚魚を 1 .1 %以下の CO
2環境で30 日間飼育したところ成長には影響がみられなかった。しかしシロ ギス稚魚について同様に 1 8 週間飼育した結果， 0.4 および1. 2% のC0
2暴露に対して 1 8 週自の観察におい て対照区よりも有意に低い成長を示した。よって低濃度の CO
2であっても暴露期間の延長により成長が 抑制されることが明らかになった。
また，非定常 CO
2暴露実験の予備実験を行ったところ，定常 CO
2実験結果とは全く異なる結果が得ら れた。シロギス稚魚を 5 %CO
2に 3 時間暴露したところ，死亡率は95% であったが， 1 %C0
2に 3 時間 暴露した後 CO
2濃度を 5 % に上昇し，さらに 3 時間暴露した場合，全供試個体 ( 2 0 個体)が生残した。
このことから CO
2海洋隔離の生物影響調査には非定常実験が不可欠であるとの結論に至った。
これら定常 CO
2暴露に対する致死影響および亜致死影響，さらに今後実施する非定常 CO
2暴露実験の 結果を CO
2海洋隔離技術開発にフィードパックさせることで，より一層環境への影響を抑えた CO
2海洋 隔離技術の開発が可能となるものと考えられる。
( 2 0 0 4 年5 月28 日受付， 2004 年8 月3 日受理)
* 財 団 法 人 海 洋 生 物 環 境 研 究 所 中央研究所(干 299‑5105 千葉県夷隅郡御宿町岩和田 3 0 0 ) E ‑ m a i l : [email protected]
1
また CO ，海洋隔離の生物影響において重要となる「深海生物」の CO 2 影響予測については，供試材 料の入手が困難で、あることから，浅海生物を用いた実験データから CO
2耐性と相関する形態学的指標を 模索し，深海魚類への影響を予測することが有効な手段のひとつと考えられる。ここではイオン輸送 細胞である塩類細胞に着目して，高 CO
2環境が塩類細胞におよぽす形態学的影響について調査を行った。
本研究では，シロギス卵を用いて予備試験を行い，マダイ仔稚魚の塩類細胞について形態の観察を 行った。また CO 2 耐性の種間差を解明するための予備知見を得ることを目的として，非常に高い CO 2 耐 性を有していたスマと同科魚種であるクロマグロの卵および仔魚を用いて塩類細胞の観察を行った。
シロギス卵を 1% CO 2 に2 1 時間暴露したのち，卵黄嚢上皮に存在する塩類細胞の断面積を対照区と比較 したところ CO 2 暴露個体について82% の面積増加が認められた。またクロマグロの塩類細胞は匹体出 現期より後期から出現し，卵黄仔魚期における塩類細胞はヒラメと比較して極めて多数分布している ことから塩類細胞に関する形態学的情報が CO
2耐性の種間差の指標となりうる可能性が示唆された。ま たマダイ仔稚魚を 1 % の CO
2に2 4 時間暴露したところ，仔魚では塩類細胞断面積に増加が観察されなかっ たが，稚魚では32% の有意な増加が見られた。またマダイ稚魚を 0 . 3 ，0 . 6 および1.1% CO 2 環境下で3 0
日間暴露したのち，鯨に存在する塩類細胞の断面積および密度を比較し， 0 . 6 および1.1%C0 2 暴露区に おいて有意な断面積増加を認めた。これらは塩類細胞が高 CO
2環境下において酸性化した体内を正常に 維持するため，何らかの役割を担っていることを示唆する。
今後，塩類細胞に着目して C O
2影響メカニズムについて調査を行い，深海魚の塩類細胞における知見 の充実を図ることで C O
2海洋隔離による深海生物への影響を明らかにする予定である。また深海種に近 縁な種等を用いて低水温・高圧下で CO
2暴露実験を行うなど，できるだけ現実に即した実験も進めてい
く必要がある。
キーワード:二酸化炭素，海洋隔離，海産魚，初期発育段階，毒性，成長，塩類細胞
A b s t r a c t : E f f e c t s o f CO 2 on t h e e a r l y d e v e l o p m e n t a l s t a g e s o f m a r i n e f i s h w e r e i n v e s t i g a t e d t o a s s e s s t h e b i o l o g i c a l i m p a c t o f CO 2 s e q u e s t r a t i o n i n t o t h e d e e p s e a ， w h i c h i s p r o p o s e d a s a p o s s i b l e m e a s u r e t o m i t i g a t e c 1 i m a t e c h a n g e s c a u s e d by i n c r e a s i n g a t m o s p h e r i c c o n c e n t r a t i o n s o f t h e g a s e o u s C 0 2 . Some e a r l i e r s t u d i e s d i s c u s s e d e f f e c t s o f CO 2 o n m a r i n e o r g a n i s m s u s i n g t h e r e s u l t s on t o x i c e f f e c t s o f m i n e r a l a c i d s d u e t o t h e p a u c i t y o f r e l e v a n t d a t a . We f i r s t t e s t e d w h e t h e r t h e u s e o f a c i d d a t a on m a r i n e o r g a n i s m s i s v a l i d by c o m p a r i n g t h e m o r t a l i t y r a t e s o f a m a r i n e f i s h i n s e a w a t e r a c i d i f i e d by e i t h e r HCI o r CO ， t o t h e same p H . S u b s e q u e n t l y ， we s t u d i e d o n t o g e n e t i c c h a n g e s i n C02 t o l e r a n c e ， s i n c e i n d i v i d u a l s i n e a r l y d e v e l o p m e n t a l s t a g e s a r e o f t e n more s u s c e p t i b l e t o e n v i r o n m e n t a l p e r t u r b a t i o n s t h a n a d u t ¥ s . F u r t h e r ， e f f e c t s o f CO2 on f i s h g r o w t h w e r e e x a m i n e d t o u n d e r s t a n d t h e l o n g ‑ t e r m e f f e c t .
A n o t h e r d i f f i c u l t y i n a s s e s s i n g b i o l o g i c a l e f f e c t s o f CO 2 o c e a n s e q u e s t r a t i o n i s t h a t i t i s d e e p ‑ s e a a n i m a l s t h a t wi l 1 b e a f f e c t e d by h i g h CO 2 w a t e r . C o n s i d e r i n g t h e o b v i o u s d i f f i c u l t y a c c o m p a n y i n g t h e u s e o f l i v e d e e p ‑ s e a a n i m a l s i n l a b o r a t o r y e x p e r i m e n t s ， we i n s t e a d h a v e t r i e d t o e s t a b l i s h some m o r p h o l o g i c a l i n d i c e s t h a t c a n b e u s e d t o s t u d y e f f e c t s o f CO ・ ， Wef o c u s e d on t h e i o n ‑ t r a n s p o r t i n g c h l o r i d e c e l l s ， w h i c h a r e known t o b e i n v o l v e d i n i o n ‑ r e g u l a t i o n a n d p r e s u m a b l y a c i d ‑ b a s e r e g u l a t i o n i n m a r i n e f i s h e s .
To c o m p a r e t h e a c u t e t o x i c i t y o f CO 2 ‑a n d H C I ‑ a c i d i f i e d s e a w a t e r ， e g g s a n d l a r v a e o f a m a r i n e f i s h ， J a p a n e s e s e a b r e a m ( P a g r u s m a j o r ) ， w e r e e x p o s e d t o s e a w a t e r e q u i l i b r a t e d w i t h CO2 ‑ e n r i c h e d g a s m i x t u r e s (C02=5% o r 10% ， O2 =20.95% b a l a n c e d w i t h N2 ) o r s e a w a t e r a c i d i f i e d w i t h 1 N HCl a t two pH l e v e l s (pH 6 . 2 (=5% C 0 2 ) a n d 5 . 9 (=10% C 0 2 ) ) f o r 6 h ( e g g s ) o r 24 h ( l a r v a e ) . M o r t a l i t i e s o f e g g s w e r e 85.8%
( C 0 2 ) a n d 3.6% ( H C 1 ) a t pH 6 . 2 ， a n d 9 7 . 4 % ( C 0 2 ) a n d 0.9% ( H C I ) a t pH 5 . 9 ， w h i l e t h o s e o f l a r v a e w e r e 6 1 . 2% (CO ， ) a n d 1 . 6% ( H C I ) a t pH 6 . 2 ， a n d 100% ( C 0 2 ) a n d 5.0% ( H C 1 ) a t pH 5 . 9 . T h u s ， p r e v i o u s r e s e a r c h on t h e e f f e c t s o f a c i d i f i e d s e a w a t e r on m a r i n e o r g a n i s m s ， a s a s u b s t i t u t e f o r CO" h a s l a r g e l y u n d e r e s t i m a t e d t h e t o x i c e f f e c t s o f CO 2
・The CO 2 t o l e r a n c e i s e x a m i n e d u s i n g J a p a n e s e s e a b r e a m ， J a p a n e s e s i l 1 a g o ( S i l l a g o j < 中o n i c a ) ， J a p a n e s e f l o u n d e r ( P a r a l i c h t h y s o l i v a c e u s ) a n d l i t t l e t u n a ( E u t h y n n u s a f f i n i s ) d u r i n g t h e e a r l y d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . The p e r c e n t a g e s o f l a r v a e t h a t h a t c h e d a n d s u r v i v e d w e r e n o t a f f e c t e d by e x p o s u r e t
‑ 2 一 一
海産魚卵仔稚への二酸化炭素影響
Growth p e r f o r m a n c e was i n v e s t i g a t e d i n j u v e n i l e of J a p a n e s e s e a b r e a m a n d J a p a n e s e s i l l a g o ， r e a r e d u n d e r h y p e r c a p n i a . T h e r e was no s i g n i f i c a n t i n f 1 u e n c e on t h e g r o w t h o f J a p a n e s e s e a b r e a m w i t h i n 1 % CO ， f o r 30 d a y s . On t h e o t h e r h a n d ， g r o w t h r a t e was s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d i n j u v e n i l e s o f J a p a n e s e s i l l a g o u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s f o r 1 8 w e e k s . Thus ， f i s h g r o w t h was i n h i b i t e d e v e n by s u b ‑ I e t h a l CO ， l e v e l by p r o l o n g i n g t h e e x p o s u r e .
A p r e l i m i n a r y s t u d y was c o n d u c t e d on t h e c h a n g e s i n c h l o r i d e c e l l morphology i n t h e y o l k ‑ s a c membrane o f J a p a n e s e s i l l a g o embryos e x p o s e d t o 1% CO ， f o r 2 1 h . The c h l o r i d e c e l l s i z e i n c r e a s e d 82% by t h e t r e a t m e n t . The c h l o r i d e c e l l s i z e of t h e g i l l s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d by 34% i n j u v e n i l e J a p a n e s e s e a b r e a m e x p o s e d t o 1% CO ， f o r 24 h ， w h i l e t h e c h a n g e was n o t s i g n i f i c a n t i n l a r v a e of t h e same s p e c i e s . The 30
・d a y e x p o s u r e of j u v e n i l e J a p a n e s e s e a b r e a m t o 0 . 6 a n d 1 . 1 % CO ， r e s u l t e d i n s i g n i f i c a n t i n c r e a s e s i n c e l l s i z e ， w h i l e c e l l d e n s i t y d i d n o t c h a n g e . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t c h l o r i d e c e l l s p l a y a h o m e o s t a t i c r o l e u n d e r h y p e r c a p n i a i n m a r i n e f i s h .
T h e s e r e s u l t s and r e s u l t s o f f u t u r e s t u d i e s s h o u l d b e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e d e v e l o p m e n t of CO ， o c e a n s e q u e s t r a t i o n t e c h n i q u e s i n o r d e r t o m i n i m i z e b i o l o g i c a l d i s t u r b a n c e . To i m p r o v e t h e v a l i d i t y o f e n v i r o n m e n t a l a s s e s s m e n t ， h i g h CO
2e x p e r i m e n t s s h o u l d be c o n d u c t e d u n d e r r e a l i s t i c c o n d i t i o n s s u c h a s h i g h p r e s s u r e a n d low t e m p e r a t u r e .
Keywords : Carbon d i o x i d e ， Ocean s e q u e s t r a t i o n ， M a r i n e f i s h ， E a r l y d e v e l o p m e n t a l s t a g e ， T o x i c i t y ， Growth ， C h l o r i d e c e l l
一 一 3
緒 昌
化石燃料の消費は人間活動の発展とともに年々 増加し，それに伴う CO
2排出量は増加の一途を たどっている
O産業革命以前 280ppm 程度で、あっ た大気中の CO2 濃度は現在370ppml こ達し，毎年 1 . 7ppm 程度ずつ上昇を続けている(I pcc ， 2 0 0 1 )
0CO
2はメタンや亜酸化窒素などと同様に温室効 果ガスの一つであり，これらのガスが引き起こす 地球の温暖化は生物にとって分布や種組成に影響 するだけでなく，種の絶滅に関わる重大な問題で あり (Omorie t a l .
司1 9 9 4; Pounds e t a l .
、1 9 9 9;
Parmesan and Yohe ， 2 0 0 3 ; R o o t e t a l . ， 2003 など)，
温暖化によって 2050 年までに35% の動植物種が絶 滅するという試算もある (Thomase t a l . ， 2 0 0 4 ) 。 また 2003 年 1 2 月にイタリアのミラノで開催された 気候変動枠組み条約第 9 回締約国会議 (COP9) において，世界保健機構 (WHO) は世界の下痢 の2 .4%，マラリアの 2 % は気候変動に原因があ る と い う デ ー タ か ら 気 候 変 動 に よ っ て ， 既 に 2000 年に 1 5 万人の死者が出ており， 2030 年までに 死亡者数は倍増する」とする報告書を公表した (World H e a l t h O r g a n i z a t i o n ， 2 0 0 3 ) 。これまでの 知見から地球温暖化現象の原因の2 / 3 は C02によ る温室効果であるとされており，人為起源、の CO
2削減は地球規模で対処すべき急務課題となっ ている ( H e r z o ge t a l . ， 2 0 0 0 ) 。現在，世界的な省 エネルギーの推進や，太陽電池，風力発電等のク リーンエネルギーの導入が行われているものの，
1 9 9 7 年に京都で開催された気候変動枠組み条約第 3 回締約国会議 (COP3) において取り決められ た温室効果ガスの排出削減目標を達成することは 依然として困難な状況にある。このような本来的 な対策に加え， CO
2の放出棟、からの回収および 処分が検討されており，我が国では CO
2の回収 処分は技術的に可能な段階に来ているとされる
(石坂・大隅， 1 9 9 9 ) 。
回収した CO
2の処分については，地中深層の 帯水層等に注入する地中隔離方式と海洋に処分す る海洋隔離方式が考慮されており，地中貯留に関 してはノルウェー沖合のスライプナー鉱区の洋上 天然ガス採掘プラットホームにおいて既に商業規 模で実施されている。一方海洋隔離については，
M a r c h e t t i ( 1 9 7 7 ) による最初の提案以降 CO2 が海洋生態系へおよぼす影響について議論されて い る 段 階 で あ る (Handa a n d Ohsumi ， 1 9 9 5
Ormerod and A n g e l ， 1996;大森， 1997;下島，
1 9 9 7 ;石坂・大隅， 1999;石坂， 2 0 0 1 ;大隅，
2 0 0 3 など)
0C02を海洋へ隔離する具体的な方法 については，(1)パイプラインを用いて気体状あ るいは液状の CO2 を沿岸の水深 1 ， 000m 付近の固 定点に放出する方法 ( L i r oe t a l . ， 1 9 9 2 ) ， ( 2 ) 液 状 C02を船からパイプを吊り下げ曳航しながら 水深 1 ，000~2 ，000mlこ連続放流する方法 (Üzaki e t a l . ， 1 9 9 5 ) ， ( 3 ) ドライアイスの投入 ( N a k a s h i k i e t a l . ， 1 9 9 1 ) ， (4) 深海底(水、深3 ， 000m 以深) の 窪 地 へ 液 状 CO2を 貯 留 す る 方 法 (Uhsumi
司1 9 9 5 ) な ど が 挙 げ ら れ る
Oこ れ ら の う ち 水 深 1 ，000~2，000m への曳航船による CO 2 隔離方式で は CO
2が海面に向かつて浮上するが，投入時に 十分小さい液滴にしておけば溶解・拡散すると考 えられ，船舶を走行しながら投入することにより さらに広範囲に低い濃度に希釈されるため，環境 や生物への影響を最小限にとどめることが可能で あると考えられる ( N a k a s h i k i e t a l . ， 1 9 9 5 ) 。こ れに対し Omori e t a l . ( 1 9 9 8 ) は，影響範囲を局 限できる点から水深 3 ， 000m 以深での貯留型隔離 方式を提案している。海洋は今後人類が大気に放 出する CO
2のほとんどを吸収できると考えられ ており(坪田ら ，1 9 9 4 ) ，大気中への CO2 放出増 加に対し何も策を講じなかった場合にも CO
2は大気を通じて海洋に溶解し，いずれは平衡に達 する ( C a l d e i r aa n d W i c k e t t ， 2 0 0 3 ) 。大気と海洋 表 面 聞 の CO
2濃 度 は 1年 程 度 で 平 衡 に 達 す る ( B r o e c k e r and Peng ， 1 9 7 4 ) が，海洋の深層水と 表層水が入れ替わるのには 1 ， 000 年以上かかると され，海洋全体が新たな平衡に達するにはこれと 同程度の時間を要する(坪田ら， 1 9 9 4 ) 。これら の CU2 海洋隔離技術は， CO2 を人為的に海洋へ 溶解することによって大気中への放出を抑制する 手段として考えられている ( H o f f e r te t a l . ， 1 9 7 9 ) 。
しかしどのような隔離方式が採用されたとしても 海洋生物および生態系への影響は必至であり，海 洋隔離が実施される前に慎重な生物影響調査を行 う必要がある。海洋隔離の実施が検討されている 深海における生物学的知見は，深海性魚類および プランクトンについての動物相，生物現存量，鉛 直移動に関する記述には富むが，生理学的な知見 は僅かである ( H a e d r i c h ，1 9 9 7 ; Weitzman ， 1 9 9 7 ; Omori e t a l . ， 1 9 9 8 ; N i s h i k a w a e t a l
円2 0 0 1 )。近 年では CO
2海洋隔離が深海生物相に与える影響 を論じた研究もあるが ( S e i b e la n d Walsh 、 2 0 0 1 ;
4 一 一
海産魚卵仔稚への二酸化炭素影響
S e i b e l and Walsh ， 2 0 0 3 ) ，生物そのものを用いた 実験例は現在の所皆無である。
魚類は海洋生物資源の主要構成要素であり，ま た先進諸国の中でわが国の水産業は他国に例をみ ないほどに重要な産業であることからも， CO
2海洋隔離が実施された場合の魚類への影響評価は 極めて重要である。この際に留意しなければなら ないのは，その資源量を左右する卵，仔稚魚といっ た初期生活史への影響である。多くの魚類は大量 に産出された卵から僻化して仔魚，稚魚になり，
さらに成長して極めて僅かな確率で成魚に至る (Houde ， 1 9 8 7 ; R i c e e t a l . ， 1 9 8 7 ; M i l 1 e r e t a l . ， 1 9 8 8 ) 。この初期の成長過程における生残率が資 源量を決定する大きな要因となる。しかし CO
2が魚類に与える影響については，大部分が淡水種 を用いて調べられており，海産魚に関する知見は 乏しい。さらにそれらの知見についても成魚のみ が実験対象となっており，初期発育段階における CO
2影響の知見は極めて乏しい(石松・喜田，
1 9 9 9 ) 。
Auerbach e t a l . ( 1 9 9 7 ) および、C a u l f i e l de t a l . ( 1 9 9 7 ) は，海産仔魚，カイアシ類，軟体類幼生 など，移動能力の低い海産動物の低pH 暴露に関 する既往知見から， C02放出点近傍域における 海産生物の急性致死影響を予測するためのモデル を提示した。しかし彼らの致死影響予測モデ、ルに 用 い ら れ た デ ー タ ( C a l a b r e s e and D a v i s ， 1 9 6 6 ; P o r t m a n n ， 1 9 7 2 ; G r i c e e t a l . ， 1 9 7 3 ; Rose e t a l . ，
1 9 7 7 ; B r o w n e l l ， 1980; Bamber ， 1987; Bamber ， 1 9 9 0 ) は ， C02海洋隔離を前提とした実験では なく，塩酸や硫酸といった強酸を用いて海水pH を低下させた低pH 暴露実験の結果で、あり， C02 そのものを用いていない。水中における CO
2濃 度の増大は，結果として水pH の低下=水素イオ ン濃度の増大を引き起こすが，水素イオン自体と CO
2とは互いに異なる生体膜透過性を有するた め ( H e i s l e r ，1 9 8 6 ; M o r r i s e t a l . ， 1 9 8 9 ) ， 水 生 生 物に対し異なった生理学的作用を持っと考えられ る。渡辺ら ( 2 0 0 1)は動物プランクトンのカイア シ類を用いて同一pH 下における C02および強酸 の毒性を比較し， C02暴露によってpH を低くし た区において死亡率が高くなる結果を示した。こ の報告からも，低pH 耐性に関するデータを CO
2影響予測のためにそのまま用いることは不適当で あると考えられる。しかしながら前述の通り海産 魚における CO
2の致死影響に関する情報は少な
一 一 5 一 一
く，基礎的知見の集積が急務である。またP り r t n e r and R e i p s c h l a g e r ( 1 9 9 6 ) は高 CO2 による酸塩基 調節，呼吸，エネルギー転換および代謝への影響 に関する既往知見から，環境 CO2 分圧 (pC02) の増加によって考慮しなければならない生理学的 問題点について言及し，特に深海種における亜致 死レベルの CO
2が及ぼす長期的影響解明の重要 性について論じている。このように致死影響のみ ならず，亜致死影響についても同様に情報の集積 が必要とされている。
CO
2の海洋隔離が生物へ及ぼす影響について 論ずる場合，次に挙げる点を考慮しなければなら ない。第一に CO
2が海水中に放出されたとき，
その現場に生息する生物が経験する CO
2濃度は，
一定濃度(定常)ではなく常に変化していく「非 定常」状態にある。生物種の移動能力に関わらず，
放出された CO
zの濃度自体が時空間的に変化し てし、く。第二に，海洋隔離による高 C02環境に 直接曝されるのは深海生物であることである。前 者 の 非 定 常 CO
2濃度を実験室で再現することは 可能であるが，まず基本的な高 CO
2に対する急 性 致 死 影 響 を 把 握 す る た め ， 本 研 究 で は 定 常 CO
2環境への暴露実験を実施した。また後者の 深海生物への C02 影響解明は，現時点では深海 生物の供試材料入手が困難であることから，浅海 生物を用いた実験から影響を外挿せざるを得ない。
この場合に用いることのできる手法のひとつとし て，形態学的観察による CO
2影響の予測が挙げ られる。本研究では魚類におけるイオン輸送細胞 である塩類細胞に着目し，高 C02環境が塩類細 胞におよぽす形態学的影響を観察することで，外 部形態と CO
2影響との関係を明らかにし，深海 生物の標本等からその CO
2影響を予測する手法 について検討した。
なお本研究の一部は ，NEDO ( 財 団 法 人 新 エ ネ ル ギ ー ・ 産 業 技 術 総 合 開 発 機 構 ) の 委 託 研 究
「二酸化炭素の海洋隔離に伴う環境影響予測技術 研究開発 J の一環として行われたものである。
定常 C O
2暴露による影響
1.高 C O
zおよび酸性水の毒性比較
従 来 C02 海洋隔離の影響評価に用いられて
きた致死影響に関する既往知見は，大多数が強酸
を用いた暴露実験であり， CO
2自体を用いた実
m C
C M
Embryo
釘蚕窒蚕~ P r e f l e x i o n
白 川 g e
FQ
﹁︿ Q
O
自
(lOOOml) Egg
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conlainer(85ml)
F l e x i o n
袋 震這導嘗 P o s t d 計 州山 f t 州 f F 刊 f 品 l l e 似 叩 X 刈 i
d 怠 緯 紳 醤 尋 J ん加川川 附川…叫 uv v 叩 叫 m e e
伺州 吋 n n 巾 叶 恥 巾 i リ l e e F i g . 2 . A p p a r a t u s a n d a nim a l c o n t a i n e r s u s e d f o r t h 巴
c o mp a r i s o n o f t o x i c i t y b e
れν e e n h y p e r c a p n i a a n d a c i d i f i c a t i o n . PV C b a t h ( 1 0 0 L ) i s u s e d t o s t a n d a r d i z e t h e t e m p e r a t u r e f o r t h e t h r e e PV C t a n k s ( C 0 2 g r o u p ， H C I g r o u p a n d Norm a l s e a wa t e r ; 1 4 L r e s p e c t i v e l y )
F i g . 1 . Th e e a r l y d e v e l o p m e n t a l s t a g e s o f
白s hu s e d f o r t h e c u r r e n t s t u d y . Redrawn 合 o m F u k u h a r a ( 1 9 6 9 ，
1 9 8 5 ) .
( B r a c h i o nu s p l i c a t i l i s ) ， アノレテミア ( A r t e mi a s a l i n a ) ノープリウス幼生を発育にあわせて用い
た
。鮮化後
1O~
12日目の正常に遊泳している前脊
索屈曲期仔魚を試験に供した。供試魚の全長(平 均 値 i : SD ) は 5 . 74 i : 0.51mm で、あった。
シ 験例は極めて少ない。 CO z および強酸の致死的
影 響 を定量化し比較することは ， C O
z海 洋 隔 離 による生物への影響評価を行う点で極めて重要で ある 。 ここではマダイ ( Pa g r u sm a j o r )卵および 仔魚を C O
2および強酸によって作成した同じ pH の海水へ暴露したときの死亡率を比較した。
( 2 ) 試験装置
試験で、は F i g .2 に示した装置を使用した。 この 装置は水温を 一定にするための恒温水槽(約 1 0 0 L 容 ) ， 3 つの暴露水槽 ( CO
z区，塩酸区および
自 然 海 水 区 ; 各 14L 容 ) お よ び ガ ス 混 合 装 置 (Ca meron 社 ， Ga s Mixing Flowmet e r : GF‑3 川町 ) で構成される 。 CO
z区はガス混合装置を用いて CO 2 (5 %および 1 0 % の 2 段階) ， Oz ( 20 . 95 %) お よ び N2 ( b a l a nce ) か ら な る 混 合 ガ ス ( 以 下
i C0 2 混合ガス J )の連続送気により，海水中の ガス濃度組成を 一定に維持できるようにした。塩 酸区では自然海水に塩酸を滴下して pH を調節し ， 連続して空気曝気した。 また，死亡率算 出のため，
自然海水に空気曝気を行う自然海水区を設定した。
水温は各暴露水槽内が 20
0C になるよう調節した。
卵 の 収 容 器 は ， ポ リカ ー ボネイ ト製 沈 殿 管 ( 8 5 r n L )の蓋および底に穿孔し，プランク ト ンネッ ト 地 ( NGG72 :目合い 222 μm) を貼ったものを 用い ，仔稚魚の収容にはポ リ カー ボネイト 製沈殿 管 ( I ， OOOm L)側面に防虫ネッ ト を貼った 1 2 個の 通水孔を備えたものを用 いた。 すべての試験にお 0 . 50 お よ び 0 . 4 5μm フィルタ ー ( Adv a n t e c 1)材料と方法
本研究における発育段階(ステージ)の分類は，
卵に つ いては Oo z e k ia nd Hirano ( 1 9 8 5 ) ，仔稚魚 については K e n d a l l e t a l . ( 1 984 )にそれぞれ準拠 した ( F i g .1) 。 本研究では実験の再現性を考慮 し ， C O
z量の表記を ， % ( v / v ) で表記すること とした 。 なお， 1 % の CO z は p C 02 約 1 kP a (=7. 5mmHg ) に相当する。
いて，
(1)供試材料
2001
年 5 月
21日 ~
22日， (財)梅洋生物環境研 究所中央研究所(海生研 )で飼育しているマダイ 親 魚 の 自 然 産 卵 に よ り 受 精卵 を得た 。 受精卵を 100L パンラ イト水槽で 、 水 温 20
0C ， 自然日長下で 飼 育 し ， 受精後 2 1 時間経過 した時点で 、 卵を パンラ イト水槽より取り上げ， 実体顕微鏡下で正常に心 臓原基形成期まで発育した卵のみを選別し，卵の 試験に供した。 供試卵の大きさ(平均値土 SD ) は卵径が 0 . 8 7 土 O.Olmm ，油球径が 0 . 20 i : O.Olmm であった 。 また 500L パ ンライト水干曹を用いて仔 魚の種苗生産を行った。餌料は S および L 型ワム
6
海産魚卵仔稚への二酸化炭素影響
T a b l e 1 . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s f o r t h e c o m p a r i s o n o f t o x i c i t y o f h y p e r c a p n i a a n d a c i d i f i c a t i o n
C o n d i t i o n A C o n d i t i o n
BG r o u p p H A e r a t i o n A d d i t i v e p H A e r a t i o n A d d i t i v e C O ， 5 % C O ， ー I O % C O ，
6.2 5.9
H C I A i r H C I A i r H C I S e a w a t e r w a s r e g u l a ，d 陪
byC O ， ‑ e n r i c h e d g a s m i x 加 問 s ( 5 % o r 1 0 % CO ， ) ( C O ， g r o u p ) o r I
NH C I ( H C I g r o u p ) 剖 t w op H l e v e l s .
Toyo 社 ， TOCEL: TCW
・05B‑PPS ，TOCEL: TCG
・045SIFN) で櫨過した自然海水を用いた。自然海 水の塩分は3 4 . 5 ，アルカリ度は2 . 2 9 m e q / L ，pH は 8 . 1 3 ， 総 CO2 濃 度 (TC02=[C02] + [ H 2 C03] + [HCO : i ] + [C03 2 . ] ) は1. 7 5 mM/ L であった。また試 験期間中は海水のpH を小数点第 2 位 精 度 で 連 続 監視し，暴露開始時および終了時には小数点第 3 位の精度で、pH 測 定 を 実 施 し た 。 水 質 の 測 定 に は M e t t l e r T o l e d o 社MP125・ポリマー型pH 複 合 電 極 (pH 連続監視)， TOA 社 H M ・ 60G ・複合電極 GST ・ 5721C (アルカリ度およびpH 測定)， Cameron 社 T o t a l c a r b o n a n a l y z e r : C a p n i ‑ C o n 5 (TC02 測定) ， お よ び Yeo‑Kal E n v i r o n m e n t a l E l e c t r o n i c s 社 l n d u c t i v e l y c o u p l e d s a l i n o m e t e r : 6 0 1 M K I I I ( 塩 分測定)を使用した。 pH 条件はA : pH6.2 および B : pH5.9 の 2 段階準備し， C02区では 5 % ある いは 10%CO2 を含む CO2 混合ガスの曝気により pH を調整し，塩酸区では塩酸の滴下により pH を 調節した ( T a b l e . 1)
0CO2 区の海水は試験開始 2 時間以上前に CO
2混合ガスの曝気を開始し ， p H 安定後，試験に用いた。塩酸区海水のpH は試験 前日より次の手法で調節した。水槽内の海水を強 く空気曝気している状態でpH を監視しながら目 標とする pH ( T a b l e . 1) に な る ま で 塩 酸 を 添 加 した。この時，酸性化により海水中に溶解してい た重炭酸イオンおよび炭酸イオンが CO
2に転換 され高炭酸状態となり，空気曝気によって海水中 の過剰な CO
2が除かれることにより pH が上がる ため， pH が安定するまで塩酸を添加した。海水 のpH を調節した後も空気曝気を継続し，翌日にp Hを再調整して実験に用いた。海水への曝気はす べての暴露区において実験が終了するまで継続し た 。
( 3 ) 卵の暴露方法
約4 5 個の供試卵をピペットを用いて卵収容器に 収容し，これを水槽に沈めて 6 時間暴露した後，
収 容 器 を 自 然 海 水 区 水 槽 に 移 し た 。 供 試 卵 数 は
‑ 7 ‑
CO2 区および塩酸区がそれぞれ約2 2 5 粒 ( 卵4 5 個
×収容器 5 本)で自然海水区では約90 粒(卵4 5 個
×収容器 2 本)とした。収容器すべてを移動させ た後，自然海水区の海水を満たした 300mL ビーカ に収容器内の卵を移し，これを恒温水槽内に一昼 夜静置した。
僻化後 1日目に供試個体の観察を行い，死亡率 を次式によって求めた。
死亡率(%)ニ 1 0 0 正常瞬化率
ここでの正常僻化率は，暴露区の正常僻化率を 自然海水区の正常鮮化率で除し，これを百分比で 表したものである。本研究では外見上の異常(脊 索の轡曲，卵黄の収縮，体躯の白濁，旋回，痘撃，
横臥等)が見られない鮮化を「正常僻化」とみな した。なお，算出した正常僻化率が 100% を超え た場合は， 100% として扱った。
( 4 ) 仔魚の暴露方法
正常に遊泳している仔魚を， 500L パンライト 水槽から 5L 計量カップを用いて取り上げ，ハン ドリングのストレスを減じるため約 1 時間曝気し ながら試験温度に設定した恒温水槽内に静置した。
CO
2区 お よ び 塩 酸 区 の 供 試 個 体 数 は 約 60 個 体 ( 約20 個体×収容器 3 個)とし，暴露を開始した。
自然海水区の供試個体数は約20 個体(収容器 1 個) とした。暴露開始から 24 時間経過した時点で次式 により死亡率を求めた。
死亡率(%)=死亡個体数/供試個体数 x 1 0 0
ここでは心拍停止した個体を死亡個体とした。
卵，仔魚ともに暴露実験は 2 回実施し，死亡率 は両実験の平均値を採用した (N=2) 。
2 ) 結果および考察
自然海水区における卵の正常僻化率は9 7 . 7 士0 . 1
%，仔魚の生残率は98 . 4 i : 1.9% で、あった(それぞ
れ平均値士 SD)o 条 件A ( p H 6 . 2 ) では， C02区
の死亡率が卵8 5 . 8 i : 7.7% ，イ子魚6 1 . 2 i : 2 1 . 8% で、あっ
たのに対して，塩酸区では卵3 . 6 士1. 9% ，仔魚が
1 . 6 i : 2.8% であった。条件 B ( p H 5 . 9 ) では， CO2
区の死亡率は卵97 . 4 i :1 . 8% ，仔魚 100% ，塩酸区
では卵0 . 9 士1. 9% ，イ子魚5 . 0 i : 4.8% で、あった。 この
ように同一pH における致死影響は CO
2の方が塩
P a r a m e t e r
Table 2 . S e a w a t e r c a r b o n i c s y s t e m s of CO 2 and a c i d g r o u p s
ヲ ︐
M 一
OJ m
c ‑ l
一γ
A 一 A 一 6
M m
n 一 一
6
0
‑
‑
・l E E I
‑ E
・I
・
‑
J u
‑ ‑
n ‑
‑
nu‑‑
:
・
) E F
t ‑ υ 2
︐ r 5‑6H (
‑ 1
・
q ‑
&
m M C 6 pH
[ H + ] (mmol l L ) pC02αPa) [C02 ] (mmoνkg)*
[HC03 ‑ ] (mmol /k g )
[ c o t ] (mmoνkg)
C o n d i t i o n B CO 2 ( 1 0%) Acid
5 . 8 6 5 . 8 7 1 . 3 8
・I O ‑ { ; 1 . 3 5 ' 1 0
‑‑64 . 9 5 0 . 0 3 7 1 . 5 8 1 . 1 7
・1 0 ‑ 2 2 . 1 6 1 . 7 1 ' 1 0 ‑ 2 2 . 0 5 ' 1 0 ‑ 3 1 . 74
・1 0 ‑
59 . 9 3 . 1 6 2 . 1 6 1 . 0 3
・1 0 ‑
30.037 1 . 1 7
・1 0 ‑
20 . 8 2
・1 0 ‑ 2 4 . 0 0
・1 0
‑‑6pK1 ( 6 . 0 2 6 ) a n d pK 2 ( 9 . 1 8 1 )
仕omM e h r b a c h
etal.( 1 9 7 3 ) . CO 2 s o 1 u b i 1 i t y ( α : 0 . 0 3 2 4 1 m o 1 k g ‑ I a 甘 n ‑ I )
仕omW e i s s ( 1 9 7 4 ) . * i n c 1 u d e s n e g 1 i g i b 1 e c o n c e n t r a t i o n o f H2 C03 ( H e i s 1 e r ， 1 9 8 6 ) . A s s u m i n g a t m o s p h e r i c p r e s s u r e o f 1 0 1 . 3 k P a .
[ C 02 1 = α ・ pC0 2
DHー也KI
[HC03 ‑ 1 = α ・ pC0 2 '
lOp
n‑p
[ C O / ' l = α
・pC0 2 ' 1
げIJMpKI・lOpH‑pK2
pH =p K 1 + l o g ( [ H C 03 ‑ 1 / [ αpC0
，2 ] )
=p K2
+lo g ( [ C 03 2 ‑ 1 / [ H C 03 ‑ ] )
一 吠 } 必 一 一 o h
﹄ O 芝
A B
T e s t group
F i g . 3 . Comparison of l e t h a l e f f e c t between CO 2 and a c i d by mean m o r t a l i t i e s of embryos (N =5) and l a r v a e (N =3) of P a g r u s m a j o r a t two pH l e v e l s ( C o n d i t i o n A: pH 6 . 2 ， C o n d i t i o n B : pH 5 . 9 i n T a b l e 2 ) . Exposure p e r i o d s f o r embryos and l a r v a e were 6 and 24 h ， r e s p e c t i v e l y . A s t e r i s k s show t h e l e v e l of s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e between t e s t g r o u p s ( A : W e l c h ' s t ‑ t e s t ， B : S t u d e n t ' s t ‑ t e s t ， * : P < 0 . 0 5 ， 料 糾 :
P < 0 . 0 0 0 1 ) . Redrawn 企 om K i kkawa e t a l . ( 2 0 0 4 ) .
酸の場合よりも有意に高かった(卵:P <0.0001 ， 仔魚 : P<0.05 … Welch's t ‑ t e s t (条件 A)，卵・仔 魚 :P <0.0001" ' S t u d e n t ' s t ‑ t e s t (条件 B) ， F i g . 3) 。
T a b l e . 2 に試験海水における炭酸物質濃度(計 算値)を示した。 C O
2区と塩酸区の H+ 濃度が両 p H 条件下で同等であるが， C O
2区の炭酸物質濃度 は全ての炭酸物質について塩酸区の約 130 倍(条 件 A) あるいは 260 倍(条件 B) である。 HCO i : お よ ひ eC03 2 ‑ と C O2 を比較すると，非荷電 C O2 分子は生体膜を容易に透過し (Vandenberg e t a l . ，
1994) ， C O2 は細胞区画内に拡散すると，偏在的 な酵素である炭酸脱水素酵素の存在により速やか
に炭酸を形成し，酸は即座に H 十および HCO i : 1 こ解 離する。これにより引き起こされる細胞内アシドー シスは多くの生理学的プロセスに関与し (Roos and Boron ， 1981) ，海洋生物にとって致死的な影 響を与える可能性がある。これらの酸性化による 毒性に加え， C O
2自体も動物細胞にとって毒性 を持つ (Max ， 199 1)。したがって C O2 海洋隔離 の生物影響を室内実験によって検討しようとする 場合，強酸を用いた実験データで、は影響を過小評 価することから ， C O
2を用いた実験が必要であ
ると結論できる。
2 . 卵仔稚魚における高 C O
2耐性
魚類の致死 C02 レベルの把握は C O2 海洋隔離 の影響を検討する上で必須となる調査項目である。
魚類はその生態的特徴および発育段階により生理 機能が異なり，環境ストレスに対する耐性も異な る(石橋ら ， 2003) ことから，高 C O2 に対して も，発育段階によって異なる感受性を示すことが 予想される。初期発育段階は幾つかの連続する発 育段階に分類され ， C O
2感受性の高い発育段階 を明らかにすることは ， C O
2海洋隔離に伴う生 物影響を予測する点において非常に重要で、ある。
ここでは生態的特徴の異なるマダイ，シロギス ( S i l l a g o j a p o n i c a ) ， ヒラメ ( P a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) およびスマ ( E u t h y n n u s a f f i n i s ) を用いて，卵仔 稚魚における高 C O
2急性致死影響試験を実施し，
初期発育段階における高 C O
2耐性の変化を明ら かにすることを目的とした。
‑ 8 ‑
海産魚卵仔稚への二酸化炭素影響
T a b l e 3 . D e v e l o p m e n t a l s t a g e ， s i z e ， a n d t i m e a f t e r f e r t i I i z a t i o n o r h a t c h i n g o f e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s i n t h e CO ，
t o l e r a n c e t e s t s
D i a m e t e r (mm) Days a f t e l S p e c i e s S t a g e Egg s h e I l O i I g l o b u l e T o t a l l e n g t h w W e i e g t h b t o ( d g y ) # H o u r s a f t e r
(mm) w e i g h t ( g ) ' f e r t i l i z a t i o n h a t c h i n g Egg ( c I e a v a g e ) 0 . 8 8 ( 0 . 0 4 3 ) 0 . 2 0 ( 0 . 0 0 7 ) 1
Egg ( e m b r y o ) 0 . 9 0 ( 0 . 0 2 1 ) 0 . 2 0 ( 0 . 0 0 5 ) 2 1
P a g r u s m a j o r L a r v a ( p r e f l
巴x i o n ) 5 . 3 2 ( 0 . 5 3 ) 0 . 0 0 1 4 1 1 0
明1 2 L a r v a ( f l e x i o n ) 6 . 7 5 ( 0 . 4 2 ) 0 . 0 0 3 8 4 1 4
・1 5 L a r v a ( p o s t f l e x i o n ) 8 . 7 2 ( I . I 7 ) 0 . 0 0 7 5 5 2 0 ‑ 2 2 J u v e n i I e 1 4 . 2 9 ( 2 . 1 1 ) 0 . 0 3 5 1 5 2 8 ‑ 3 3 Egg ( c I e a v a g e ) 0 . 6 7 ( 0 . 0 2 2 ) 0 . 1 5 ( 0 . 0 0 7 )
Egg ( e m b r y o ) 0 . 6 8 ( 0 . 0 2 2 ) 0 . 1 5 ( 0 . 0 0 5 ) 1 2 . 5
S i l l a g o j a P I c a L a r v a ( p r e f l e x l o n ) 4 . 5 5 ( 0 . 6 4 ) 0 . 0 0 0 3 4 1 0 ‑ 1 2 omca L a r v a ( f l e x i o n ) 5 . 6 5 ( 0 . 8 2 ) 0 . 0 0 0 6 6 1 1 ‑ 1 3 L a r v a ( p o s t f l e x i o n ) 9 . 0 9 ( 1 . 6 9 ) 0 . 0 0 2 8 8 1 7
・1 9 J u v e n i l e 1 4 . 5 3 ( 2 . 0 0 ) 0 . 0 1 2 2 5 2 4 ‑ 2 8 P a r a l i c h t h y s Egg ( c I e a v a g e ) 0 . 9 4 ( 0 . 0 0 8 ) 0 . 1 6 ( 0 . 0 0 3 ) 2 . 5
o l i v a c e u s J u v e n i l e 7 4 . 4 ( 6 . 2 3 . 5 ( 1 . 0 )
Euthynm ω a L 7 1 n i s Egg ( c I e a v a g e ) 0 . 9 3 ( 0 . 0 2 7 ) 0 . 2 5 ( 0 . 0 0 5 ) 4
V a l u e s i n p a r e n t h e s e s show S D . ' C a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n s g i v e n i n Oikawa e t a l . ( 1 9 9 1 ) ( P . m a j o r ) a n d I m o t o ( 2 0 0 0 ) ( S . j a p o n i c a ) .
1)材料と方法 (1)供試材料
実験に用いた供試材料を Tabe l . 3 に示した。マ ダイの湿重量 W B W (mg) は全長 TL (mm) の値 を用いて Oikawa e t a l . ( 1 9 9 1 ) の 式 (WBW(g)=
1 . 2 6 x 1 0 .
6X TL (mm)
4. 2
01:前脊索屈曲期仔魚およ び脊索屈曲期仔魚， WBW=8.92 X 1 0 .
6X TL
3.113:後 脊索屈曲期仔魚および稚魚)を用い，シロギスの W B W は伊元 ( 2 0 0 0 ) の式 (WBW (mg)=3 . 1 64X 1 0 .
3X TL (mm)
3087)を用いて算出した。
マダイ，シロギスおよびヒラメの供試卵は海生 研で飼育している親魚の自然産卵により得た。採 卵はマダイについて 2000 年 6 月 7 日 " " ' 7 月 20 日お よび 2001 年 5 月 1 5 ' " ' " ' 2 5 日，シロギスでは 2000 年 1 0 月 7 日 ， 2001 年 6 月 2 4 " " ' 2 6 日および同年 10 月 9 " " ' 29 日 ， ヒラメは 1998 年 1 2 月 1 5 日 ' " ' " ' 1 9 9 9 年 3 月 2 日 にそれぞれ実施した。受精後 1' " ' " ' 2.5時間で正常 卵割を開始した卵を卵割期の試験に供した。また マダイおよびシロギスでは，受精卵を 100L パン ライト水槽で砂糖過海水を曝気して飼育し，心臓 原基形成期まで正常発生した卵を睦体期卵として 試験に供した。スマの卵割期卵は， 1999 年 1 1 月 2 ' " ' " ' 1 1 日，東京都葛西臨海水族圏内の循環式飼育水 槽において自然産卵された受精卵を直ちに海生研 へ持ち帰り，正常に発生している卵を選別して供 試した。
マダイおよびシロギスの種苗生産は海生研にお いて 500L パンライト水槽を用いて自然日長下で
一 一 9一 一
実施した。ヒラメの稚魚は日清マリンテック株式 会 社 よ り 購 入 し た ( 体 重 :3 . 5 : t 1 . 0g ，平均値±
SD)o 仔稚魚の餌料は S および L 型ワムシ，アル テミアのノープリウス幼生，魚卵および配合飼料 を用い，仔稚魚の成長に合わせて給餌した。
( 2 ) 試験装置と方法
マダイおよびシロギスの試験では高 CO
2およ び酸性水の毒性比較試験と同様の装置を用い，高 CO
2区 ( CO
2混合ガス曝気)と対照区 ( A i r 曝気) の 2 水槽を設けた。ヒラメ稚魚の試験には，高 CO
2区水槽，対照区水槽(各 7 L)および高 CO"
海水準備水槽 ( 1 4 L)からなる装置を用いた ( F i g . 4) 。試験水温は T a b l e . 4 に示した。すべての試 験において，高 CO
2および酸性水の毒性比較試 験と同様に漏過した自然海水を用い，水質を測定 した。自然海水の塩分は 3 3 . 8 4 : t 0 . 6 2 ，アルカリ度 は 2 . 2 94 土 0.025meq l L ， pH は 8 . 1 1 1 士 0 . 0 6 2 であった (各，平均値:t SD)o CO
2混合ガスの CO
2濃度と 海水の平衡 pH の関係を T a b 1 e . 5 に示した。
( 3 ) 卵の高 C O
2暴露方法
マダイおよびシロギス卵の暴露は次のように行っ
た。卵収容器は各暴露時間区 ( T a b l e . 4) および
対照区につきそれぞれ 2 本ずつ用意した。卵をピ
ペットで卵収容器に 4 0 ' " ' " ' 5 0 個ずつ移し，収容器を
暴露水槽内に置き，高 CO
2暴露を開始した。所
定の暴露時間が終了した時点で，収容器を暴露水
S p e c i e s
T a b l e 4 . D e v e l o p m e n t a l s t a g e ， e x p e r i m e n t a l t e m p e r a t u r e ， a n d e x p o s u r e d u r a t i o n i n t h e CO ， t o l e r a n c e t e s t s
Pagrus m a j o r
S t a g e
Egg ( c 1 e a v a g e ) ， L a r v a e ， J u v e n i l e Egg ( e m b r y o )
Egg ( c 1 e a v a g e ) Egg ( e m b r y o ) L a r v a e ， J u v e n i l e Egg ( c 1 e a v a g e ) J u v e n i l e Egg ( c 1 e a v a g e ) S i l l a g o j a p o n i c a
P a r a l i c h t h y s o
/iv a c e u s E u t h 盟 主 必 附
H y p e r c a p n i c s e a w a l e r ( 1 4 L )
C o n l r o l ( 7 L )
F i g . 4 . A p p a r a t u s u s e d f o r t h e CO ， t o l e r a n c e t e s t o f j u v e n i l e s o f P a r a l i c h t h y s o l i v a c e u s . Upper t a n k was a r e s e r v o i r o f h y p e r c a p n i c s e a w a t e r a n d t h e s e a w a t e r f l o w s i n t o t h e CO ， e x p o s u r e t a n k ， w h i c h was f i l l e d w i t h n o r m a l s e a w a t e r i n i t i a l l y .
槽から対照区水槽へ移した。全ての暴露が終了し た時点で供試卵を収容器から対照区海水を満たし た 300mL ビーカに移し，対照区卵の僻化が開始し た翌日に，正常僻化した個体を計数した。正常僻 化の基準は前項同様，外見上の異常(脊索の轡曲，
卵黄の収縮，体躯の白濁，旋回，痘筆，横臥等) が見られない僻化とした。高 CO
2区の正常僻化 率を対照区の正常僻化率で除し，これを百分比で 表したものを正常僻化率 (%)とした。なお，算出 した正常僻化率が 100% を超えた場合は 100% とし て扱った。
また約 3 0 ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ 4 0 個のヒラメおよひ'スマの卵を同様 のポリカーボネイト管に収容して，上記の方法と 同様に高 CO
2暴露を行った(ヒラメ卵について は最長 45 時間の暴露とした)。
前 向 一 却
E x p o s u r e d u r a t i o n 15min ， 1 . 5h ， 6h ， 24h
15min ， 1 . 5 h ， 6h 1 5 m i n ， 1 . 5 h ， 6h ， 1 6 . 7 h
1 5 m i n ， 1 . 5h ， 6h 15min ， l . 5 h ， 6h ， 24h
1 5 m i n ， 6 h ， 24h ， 45h 1 5 m i n . l . 5 h . 6 h8 h . 2 4 h . 4 8 h .
15min ， 1 . 5h ， 6h ， 24h 26
げ同 一川 一
T a b l e 5 . R e l a t i o n s h i p s o f f C O ， ( % ) o f g a s m i x t u r e a n d s e a w a t e r pH a t e q u i l i b r i u m ， pH
=a l o g ( f C O ， ) + b ， r ' : c o e f f i c i e n t o f d e t e r m i n a t i o n
W a t e r t e m p e r a t u r e
b r
2( O C ) a
1 7 0 . 8 6 8 7 . 0 1 9 0 . 9 7 0 1 8 ‑ 1 . 0 5 5 6 . 8 5 9 0 . 9 9 5 20 ‑ 1 . 0 1 1 6 . 8 6 2 0 . 9 9 1 24 1 . 4 8 1 7 . 7 7 6 0 . 9 7 0 26 1 . 0 0 4 6 . 9 0 3 0 . 9 9 5
( 4 ) 仔稚魚の高 C O
2暴露方法
マタ守イおよびシロギス仔稚魚については次の方 法で高 CO
2暴露を行った。飼育水槽から正常に 遊泳している仔稚魚を 5L計量カップまたはタモ 網を用いて取り上げ，ハンドリングのストレスを 減じるため約 1 時間曝気しながら試験温度に設定 した恒温水槽内に静置した。その後，マダイ仔稚 魚は約 20 個体，シロギス仔魚は約 1 5 個体，シロギ ス稚魚は約 1 0 個体をそれぞれ仔稚魚収容器に移し，
高 CO
2暴露を開始した。これらの収容器は 4 個 準備し，対照区については艶死率が常にほぼ 0 % であるため，収容器は 1 個とした。仔魚(前脊索 屈曲期仔魚，脊索屈曲期仔魚および後脊索屈曲期 仔魚)については空気接触による艶死を避けるた め，ピペットを用いて収容器に移し，稚魚はタモ 網を用いた。所定の暴露時間ごとに収容器内の生 残個体および死亡個体を計数した。ここでは心拍 が停止した個体のみを死亡として判定した。仔稚 魚の生残率は高 CO
2区の生残率を対照区の生残 率で除し，これを百分率で表したものとした。な お，生残率が 100% を越えた場合は 100% として扱っ た 。
ヒラメ稚魚の暴露は次のように行った。供試魚 はハンドリングによるストレスを減じるため，高
一 一 1 0 一 一
海産魚卵 f 子稚への二酸化炭素影響
T a b l e 6 . P e r c e n t n o n n a l h a t c h i n g a n d s u r v i v a l o f c o n t r o l g r o u p s i n t h e CO ， t o l e r a n c e t e s t s
S p e c i e s S t a g e Mean
土SD Egg ( c l e a v a g e ) 9 6 . 2
土2 . 6 Egg ( e m b r y o ) 8 2 . 0
土1 7 . 4 L a r v a ( p r e f l e x i o n ) 1 0 0 L a r v a ( f l e x i o n ) 1 0 0 L a r v a ( p o s t f l e x i o n ) 1 0 0 J u v e n i l e 1 0 0 Egg ( c l e a v a g e ) 9 5 . 2
土6 . 3 Egg ( e m b r y o ) 1 0 0 L a r v a ( p r e f l e x i o n ) 1 0 0 L a r v a ( f l e x i o n ) 9 0 . 9 土 1 2 . 9 L a r v a ( p o s t f l e x i o n ) 1 0 0 Pagrus m . c ザ o r
S i l l a g o j a p o n i c a
Par α
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ρ u ρ i w σ b o b
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1 0 0 8 4 . 6
土7 . 2
1 0 0 8 4 . 5
土1 0 . 1 E l I t h y n n u s a f f i n i s
CO
2暴露開始の前日に曝気を施した高 CO
2区水 槽および対照区水槽へ各 1 2 個体収容し，水槽を黒 いビニールで覆った。また，高 CO
2海水準備水 槽 に は CO
2混 合 ガ ス を 送 気 し ， あ ら か じ め 高 CO
2海水を用意した。翌日，供試魚が安静状態 に あ る こ と を 確 認 し 高 CO
2海水準備水槽の海 水を高 CO
2区水槽に約 5 分聞かけて流し入れる とともに，曝気を所定の高 CO
2混合ガスに切り 替え，暴露開始としたい生残の判定および生残率 の算出は前述の方法と同様に実施した。
2 ) 結果
対 照 区 に お け る 正 常 僻 化 率 お よ び 生 残 率 を T a b l e . 6 に示した。マダイにおける卵の正常僻化 率および仔稚魚の生残率は C02濃度の増加およ び暴露時間の延長に伴って低下した ( F i g .5'" 1 0 ) 。 卵割期 ( F i g . 5) および稚魚 ( F i g . 1 0 ) は CO
2に対する感受性の高い発育ステージであった。旺 体期 ( F i g . 6) ，前脊索屈曲期 ( F i g . 7) および 脊索屈曲期 ( F i g . 8) は短時間の暴露に対して特 に高い C02耐性を有していた。長時間暴露にお ける後脊索屈曲期の CO
2感受性は，匹体期，前 脊 索 屈 曲 期 お よ び 脊 索 屈 曲 期 と 同 等 で あ っ た ( F i g . 9) 。シロギス卵の正常僻化率 ( F i g .1 1 ， 1 2 ) および仔稚魚の生残率 ( F i g .13'" 1 6 ) は，傾向が やや不明瞭ではあるが，マダイの反応に概ね一致
していた。
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F i g . 5 . P e r c e n t a g e o f c l e a v a g e s t a g e e g g s o f Pagrus major h a t c h i n g n o r m a l l y u n d e r h y p e r c a p n i a r a n g e o f 1
・5%f o r 1 5 min t o 24 h e x p o s u r e ( N = 2 ) .
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F i g . 6 . P e r c e n t a g e o f embryo s t a g e e g g s o f P a g r l l s m a j o r h a t c h i n g n o n n a l l y u n d e r h y p e r c a p n i a r a n g e o f
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F i g . 7 . P e r c e n t s u r v i v a l o f p r e f l e x i o n l a r v a e o f P a g r u s
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F i g . 9 . P e r c e n t s u r v i v a l o f p o s t f l e x i o n l a r v a e o f P a g r u s m a j o r u n d e r h y p e r c a p n i a r a n g e o f 2‑7% f o r 1 5 min t o 2 4 h e x p o s u r e . B a r s show SD (N = 4 ) .
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F i g . 8 . P e r c e n t s u r v i v a l o f f l e x i o n l a r v a e o f P a g r u s m a j o r u n d e r h y p e r c a p n i a r a n g e o f 1
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F i g . 1 0 . P e r c e n t s u r v i v a l o f j u v e n i l e s o f P a g r u s m a j o r u n d e r h y p e r c a p n i a r a n g e o f 1‑5% f o r 1 5 min t o 24 h e x p o s u r e . B a r s show SD (N = 4 ) .
一 一 1 2 一 一
海産魚卵仔稚への二酸化炭素影響
n u n u n u n u n u n u n u n u n u n u n u n u n u n υ n u n u n u n u n u n υ n u n υ n u n u n υ n u n o ' 0 4 4
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司 t n u n o ' 0 4 4 司 L n υ n 0 2 0 4 4 内 4
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F i g . 1 1 . P e r c e n t a g e o f c 1 e a v a g e s t a g e e g g s o f S i l l a g o j
中o n i c a h a t c h i n g n o r r n a l l y u n d e r h y p e r c a p n i a r a n g e
o f 1 ・ 5%f o r 1 5 m i n t o 1 6 . 7 h e x p o s u r e (N=2).
ヒラメ卵割期の正常僻化率は， 1 % CO
2に対 して暴露時間にかかわらず82% 以上で、あった。 3
%C02以上の濃度では正常鮮化率は暴露時間の 延長とともに急激に低下し， 8 % CO
2，暴露時 間24 時 間 以 上 で は 全 く 僻 化 が 見 ら れ な か っ た ( F i g . 1 7 ) 。ヒラメ稚魚は卵割期よりも高い CO2 耐性を示し ， 3 % CO
2， 72 時間暴露においても 全個体が生残した。 24 時間以上の暴露では， 5 お よび 7%C02 に対する生残率がそれぞれ 50% お よび 0 % であった ( F i g .1 8 ) 。
スマの卵割期は試験した他魚種と比較し，極め て高い CO
2耐性を有していた。正常解化率は 8
% C02， 24 時間暴露に対しても 90% 以上であり，
15% C02， 24 時間暴露に対してのみ，鮮化率は 0 % を示した ( F i g .1 9 ) 。
これらの結果から L C s o (Median L e t h a l C o n c e n t r a t i o n 半数致死濃度)を J I S 工場排水試験方法
( K O I 0 2 ‑
1剛)の「魚類による急性毒試験」に準拠 し，以下の方法で算出した ( T a b l e . 7 ， 8) 。 CO
2濃 度 の 場 合 は 片 対 数 方 眼 紙 の 対 数 目 盛 に CO
2濃度 (%)を，普通目盛に正常僻化あるい
1 0 0 80 60
40~
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~ 20~ _.~:_~I.~_
g > 0 仁土二二二
二 三 1 0 0
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