米子医誌 JYonago Med Ass 50， 67-77， 1999
慢性肝疾患における血清
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及び肝組織中
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(EGFR)
の発現
鳥取大学医学部内科学第ニ教室(主任川崎寛中教授)原田賢一・汐田同日史
67E
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HARADAand G
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SHIOT A Second Department 01I.ηternα1 MediciηeTottori University School 01 Medicine Yonago683-8504， Japan
Transforming growth factor-α(TGF-αis a potent mitogen of normal and neoplastic hepatocytes， and exhibits its effect by binding to epidermal growth factor receptor (EGFR).耳owever，the significance of TGF-αand EGFR in liver diseases remains unclear. To evaluate the significance of TGF一αandEGFR in chronic liver diseases， we examined serum TGF-a， and gene expression of TGF-α， EGFR and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in liver tissues. Twenty-five patients with chronic hepatitis (CH) ， 20 with liver cirrhosis (LC) ， 45 with hepatocellular carcinoma (HCC) and 45 normal contr叫s (C) were
enrolled in this study. Serum TGF一αlevelswere measured by enzyme-linked
immunosor-bent assay. Gene expression of TGF-α， EGFR， PCNA and s-actin in liver tissues was exa -mined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Serum TGF-a levels in controls， C宜， LC and HCC were 6.5土 2.4，32.8土 11.3，383.1 ::t287.3 and 119.9 土 47.5pg/ml， respectively. Serum TGF-a levels in LC were higher than CH and C (p
<
0.05 compared to CH， and p<
0.01 compared to controls). Serum TGF-αlevels exhibited a significant positive correlation with total bilirubin and indocyanine green retension test (p<
0.05)， and a significant negative correlation with albumin (p<
0.05). Also， serum TGF-αlevels increased in parallel with severity of disease according to Child classification. The ratios of TGF-a， EGFR and PCNA mRNA to s-actin mRNA were not significantly68 原因賢一・汐田剛史
different among the diseases， although they tended to be lower in patients with LC than in other diseases. The TGF一α/s-actin ratio was correlated with EGFR/
，
9-actin and PCNA/，
9 actin ratios (p<
0.005 and p<
0.000，1 respectively)， and EGFR/s-actin ratio was relat -ed to PCNA/ s-actin ratio in all the patients， especially in HCC (p<
0.005). The results of the present study suggest that serum TGFαlevels are dosely related to severity of liver dysfunction， and that TGF-αaccelerates cell proliferation of hepatocytes and HCC cell in an autocrine fashion. (Accepted on January 12， 1999)Key
words : transforming growth factor-α， epidermal growth factor receptor， chronic liver diseases はじめに TGF-αは50個のアミノ酸1.2)からなる一本鎖の ポリペプチドで， 160個のアミノ酸からなる膜貫 通 型 前 駆 体 が 蛋 自 分 解 さ れ る こ と に よ り 生 じ る3:，4) 成熟TGF-αはEGFと約40%の相向性があ る3).TGF-αはEGFレセプターCEGFR)に結合し， レセブターのチロジンキナーゼを活性化する. TGF-αは強力なマイトゲンであり血管新生作用 を有し5)，マクロファージ活性化6)，細胞遊走7)な どの機能を持ち，意Ij傷治癒3)，胎児発生8.9)，癌 化10-13)に重要な役割を果たしている. TGF-αの発現はヒト14-18)と動物10，19-22)における 肝細胞増殖と肝発癌に関連していると報告されて きた.TGF一αmRNAは部分肝切除後，肝細抱に おいてDNA合成とEGFRmRNAのピークに一致 して増加するといわれている12，23.24) TGF-αと EGFRは共に免疫組織学的方法あるいはinsitu hybridization法lこよりヒト肝細胞捕において過剰 発現しているとの報告があり16.17，25)，血清 TGF-αは肝細胞癒患者及び、部分肝切除が行われた患者 で増加している18，26，27) このようにTGF一αは肝 細胞あるいは肝癌細胞の増殖に強く関連している ことが示唆される.しかし，ヒト肝疾患におけるTGF Y の臨床的意義は未だ明らかにされていない. 今回我々は慢性肝疾患におけるTGF-a/EGFR
の臨床的意義を明らかにするために血清TGF-α と肝組織中のTGF-α，EGFR， PCNAの遺伝子発 現を検討した. 対象と方法 対 象 慢 性 肝 炎(CH)25仔jl，肝硬変(LC)20例，肝 細 胞 癌(HCC)45例と健常者(C)45例を対象とし た.診断は臨床的，生化学的，画{象的及び組織学 的所見により行った.画像検査として捜部超音波， 腹部CT，腹部血管造影検査を行った.肝組織は， CHとLCは腹腔鏡下に， HCCは腹部超音波下に 採取した.患者の臨床的特徴と検査所見を表 1に 示す.HCC患者は全てLCを有し， HCCの腫蕩筏 は5cm以下であった， TGF-α， EGFR， PCNA mRNAの肝組織中の発現は， CH患者10例， LC3 例， HCC16例で検討した.HCC例では腫虜組織 と共に周回非腫蕩組織(nHCC)も採取した.ブロ トコールは1975::9三ヘルシンキ宣言に準拠して作成 し，それぞれの患者からインフォームド・コンセ ントを得た. 血 清TGFーα値測定 患者血清は入院時に採取し， 血清TGF-α濃度は enzyme-linkedimmunosor-bent assay kit (Oncogene Science. Inc.， New York， USA)により概定した.RNA抽 出 総RNAはISOGEN (Nippon Gene Co.， Toyama， Japan)を用いたグアニジンーチオ シアン酸塩ーフェノールーク口口ホルム法により分 離した.肝組織は肝生検後置ちに1mlのISOGEN 液と共にホモジネートし， RNA抽出まで-800 C で保存した.ホモジネートされた肝組織は室温で 融解し， 0.2 mlのクロロホルムを加え， 15秒間転 倒混和した.40 Cで15分間12，000gで、遠心分離後， 水相を抽出し0，5mlのイソプロパノールを添加 後， 40 Cで10分間12，000gで遠心分離した.沈j殿 物を75%エタノールで洗浄後乾燥させ， 30μl DEPC (diethyl pyrocarbonate)処理水に溶解し た， RNA量は260nmの波長で分光光度計により 算出した.
cDNA合成 Ready-To-GoTM T-Primed First -Strand Kit (Pharmacia Biotech Inc.， USA)を用
慢性jJ干疾患におlナるTGF-a 69 表1.慢性肝疾患患者の臨床検査所見 患者数 年齢(歳) 性(男/女) 成因 (A/B/C/他)本 ピ1)Jレピン (mg/dl) アルブミン (g/cU) ブP口卜口ンピン11寺間(0/0) ICGR1ii(0/0) AST (IU/l) ALT (IU/l) ALP (IU/l) GGT (IU/l) LDH (IU/l) AFP (ng/ml) Child分類 (A/B/C) Pugh スコア llll1青TGF-(f (pg/ml) 母性
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炎 25 45土12 18/7 1/9/14/1 O. 9i:0. 1 3.9土O.1 100こと3 12i:1 81土26 106i:18 239i:12 69士 山 176士9 12土3 32.8土日 3 肝硬変 20 59こと10a 13/7 6/6/7/1 2.0士0.3 3.3土O.1 a 68士3a，c 37i:5a 75土10 60i:9 308土21 149こと34b 216i:10b 15土4 6/8/3 8士 会 383.1土287.;3b.c1 1]刊誌 45 64i:12a 33/12 2/12/30/1 2. L土0.6 3.4士O.1 a 77土 佐 30土2a 102i:24 79土18 493土120 104i:17 229土10a 5，781士:3，504 27/14/4 7土2 119土47.5 健 常 者 45 24土2 33/12 6.5i:2.4 *成!去IA，B， Cはそれぞれa1cohol，hepatitis B， hepatitis Cを示す.a: p
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0.01 compared to CH; b:p<
0.05 compared to CH; c: p<
0.05 compared to HCC; d: p<
(J.Ol compared to C い μgの RNAか ら プ ラ イ マ ー と し て oligo (dT)と逆転写酵素により相捕￨拘DNAを作成し た.まずRNAをDEPC処理水に溶解し計33μlと し， 650 Cで5分間加損した.その後First-Strand Reaction Mixと共に 370 Cで5分間力Ili
晶しRNAを 加えさらに3
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で5分間加温した.同溶液をよく 混和し3
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で60分間反応させ逆転写を行-った. PCR士単車菌 TGF一α，EGFR， PCNAそして内部lコ ント口ールとしての/3-actin遺伝子の特異的ブラ イマーを表2に示す. PCRはGeneAmpPCR R出 合gent Kit (Perkin Elmer， New ]ersy， USA)を用 いて施行した.2μlのcDNAi容j夜lこ77.5川の水を 力1え1， 950 C5分間加熱後氷冷した.引き続き， 10 fl1の10x PCR反応液， 8 [11のdNTP混合液(それぞ れ の デ オ キ シ ヌ ク レ オ チ ド の 最 終 濃 度 は200 μM)， senseおよびおltisenseプライマーをそれぞ れ50pmoL AmpliTaq DNA polymeraseを2.5単 位添加し計100[11とした.各遺伝子のPCRは以下 の如く行った.TGF-cv， EGFR， /)-actinについて は， 940 C30秒間， 580 C30秒間， 720 C90秒間を 32 サイクル行い， PCNAにつL、てはそれぞれ940 C 90秒間， 550 C120秒間， 720 C30秒間で36サイクル 行った.PCR産物はエチジウム・ブロマイド、を 含む20/0アガロースゲル上で電気泳動し，紫外線 下でバンドを確認した. Southern Blot法 アガロースゲルi二に電気泳動 さ れ たPCR産 物 を ナ イ ロ ン ・ メ ン ブ レ ン (MICRON SEPARATIONS Inc.， M A， USA)に 転写した.プロープは既報に準じて作成した28) 転写されたメンブレンはプレハイブリダイゼーシ ョン /{j江主 (6 x SSC， 10/0SDS， 5 x DenharU夜， 100 pg/ mlサケ精子DNA) と共に 650 C6時間加熱し，
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:
12P]dCTPとRandomPrimers DNA LabellingSystem Kit (Wako Pharmacentical Inc.， Osaka， ]apan)を用い作成したプローブと共に 420 Cで一 娩ハイブ1)ダイゼーションを行った.ハイブ1)ダ イゼーション液の組成は0.1g/mlデキストラン 硫酸出， 0.4 mg/ml )J，ルムアミド， 4 x SSC， 7 m M Tris-HCL p狂 7.4，8 xデンハルト液， 20 μg / m1サケ精子DNAとした.それぞれのプロー ブの放射能活性は2.0 x 10i cpmとした.メンブ レンは2x SSC， O. 1 % SDSで室温 10分間2問， 0.2
70 原田賢一・汐田剛史 x SSC， 0.1
%
SDSで650C10分間2回洗浄し， Ko-dak Scientific Imaging Fi1m (Kodak Company， New York， USA)に12時間感光させた.バンド の強度はNIHimage version 1. 58 computer software (Machintosh， USA)を用いて測定し， それぞれのサンプルの発現量はTGF-α/
，
3-actin， EGFR/ s-actin， PCNA/ s-actin比として半定量化 した. 統計解析結果は平均±標準誤差で表わした.統 計学的有意差はMann-WhitneyU-testと one-way ANOVAを，相関関係についてはSpearman 順位相関検定を用い， p値<0.05を有意とした. 結 果 慢性肝疾患における凪清γGF-α値 表1に患者の臨床検査成績を示す.CH， LC， HCC患 者 の 血 清TGFーα値 は そ れ ぞ れ32.8土 11.3 pg/m1， 383. 1 こと 287.3 pg/m1， 119.9 ::t 47.5 pg/m1で，健常者では6.5::t2.4 pg/m1で、あ った.慢性肝疾患における血清TGF-α値は健常 者より高い傾向にあり，特にLCにおいては有意 を も っ て 最 も 高 値 を 示 し た (CHに比しp<
0.05，健常者に比Lp<O.Ol).表3にlfiJ.清TGF-M
直と肝機能検査， Pughスコア， AFP，腫蕩径と の関連を示す.血清TGF-α舗は総ピ、リルピン及 びICG停滞率と有意な正の相関(それぞれr 0.275， p < 0.0，1 r=
0.228， p < 0.05)，アル ブミンと負の相関(r= -0.212， p < 0.05)を 示したが，他の検査値とは関連を認めなかった. LCとHCC患者において血清TGF-α値と臨床所見 との関連を検討したところ(表的， Chi1d分類につ いては重症度を増すに連れて血清TGF-α値は増 加し， Chi1d CではChi1dAと8よりも有意に高値 であり (p < 0.05)，脳症を有するものは脳症の ないものに比し有意に高舗を示した(p< 0.05). 腹水を有する患者では血清TGF-α値は39.7 ::t 表 2. PCR[こ用いたプライマー Primer Sequences TGF-α Sense 5' CGCCCTGTTCGCTCTGGGT A 3' Antisense 5' CTGGCTGGCAGCCACCACGG 3' EGFR Sense 5' ACCAGAGTGATGTCTGGAGC 3' Antisense 5' GATGAGGTACTCGTCGGCAT 3' PCNA Sense 5' AAACT AGCT AGACTTTCCTC 3' Antisense 5' ATTGCCGGCGCATTTTAGTA 3' s-actin Sense 5' CCCAGGCACCAGGGCGTGAT 3' Antisense 5' TCAAACATGATCTGGGTCAT 3' 表 3.慢性肝疾患における血清γGF-α値と臨床パラメーターとの関連 相関係数 P 総ピリルピン 0.275 0.0100 ICGR15 0.228 0.0388 アルブミン -0.212 0.0458 ブロトロンピン時間 -O. 111 N.S. AST O. 158 N.S. ALT 0.072 N.S. ALP 0.071 N.S. GGT -O. 097 N.S. LDH O. 151 N.S. AFP O. 118 N.S. Pughスコア O. 148 N.S. 腫蕩径 -0.040 N.S. Abbreviation; N.S.: not significant慢性肝疾患におけるTGF-α 71 表 4.肝硬変及び肝癌患者における血清丁GFーαと臨床所見との関連 TGF-α(pg/ml) Child分類 A 116. 4:t62. 6 B 134.7土56.4 C 888. 9:t808. 0 b，c 肝性脳症 (十) 829. 7:t816. 1 a (一) 123. 1土40.9 腹水
(
+
)
39. 7:t28. 2 (一) 240. 7土116.9 腫蕩数 多発 67. 8:t22. 8 単発 214.4土126.1 a: p<
0.05 compared to the absence of encephalopathy; b: p<
0.05 compared to Childc1ass A; c: p<
0.05 compared to Childc1ass B. 28.2 pg/mlであり，腹水のない患者は240.7土 116.9 pg/mlであったが両者に有意差は認めなか っ た . 腫 蕩 数 に つ い て は 単 発 群 で は214.4 :t 126.1 pg/mlで、あり，多発群では67.8 :t22.8 pg/mlで両群聞には有意差を認めなかった. 慢性肝疾患におけるTGF-α，EGFR， PCNA遺伝子 発現 各遺伝子のPCR産物の増加の程度をTGF一α， EGFR， s-actinについてはおから38サイクルま で， PCNAについては32から42サイクルまでそれ ぞれ2サイクル毎に検討した.各遺伝子のサイク ル数はサイクル数とバンドの強度がほぼ直線的関 連を恭したところをもって決定した.すなわち， TGF一α，EGFR， s-actinは32サイクル， PCNAは 36サイクルとした.図11こTGF-α，EGFR，PCNA mRNAのPCR産 物 の バ ン ド を 示 す .TGF一α， EGFR， PCNA， s-actinのバンドのサイズはそれ ぞれ270bp，367bp， 324bp， 263bpで、あった.慢性 肝疾患におけるTGF一α，EGFR， PCNAの遺伝子 発現を図2に示す.各mRNAの発現強度は各疾患 間で有意差は認めなかったが，LC
でこれらの発 現は他の疾患よりも低い傾向にあった. HCCと nHCCにおけるTGF-αmRNAの発現は類似して いたが(HCC:1. 071 :t0.336， nHCC: 1. 018土 0.352)， EGFR， PCNA mRNAの発現はnHCC、で HCCに比べ高い傾向にあった(EGFR:nHCC， 1.922土 0.687;HCC， 1. 009土 0.193;PCNA: nHCC， 4.273 :t1. 503; HCC， 3.060 :t0.956). 慢性肝疾患におけるTGF-α，EGFR， PCNAの遺伝 子発現量 慢性肝疾患においてTGF一αとEGFR，TGF一α とPCNA，EGFRとPCNAとの間にそれぞれ有意 の正の相関を認めた(図3).図4にHCC例の腫療 部におけるTGF一α，EGFR， PCNA間の関連を示 すが， TGF-αはEGFR(r=
0.54，1p=
0.0361)， PCNA (r=
0.700， p=
0.0067)と正の相闘が あり，またEGFRとPCNAとの聞にも正の相闘を 認めた (r=
0.782， p口 0.0024). 考 察 TGF-αは肝細胞と肝癌細胞に対してオートク ラインに作用する増殖因子の一つである.血清 TGF一α値はヒトにおいて肝部分切除後増加し， 肝切除最と肝増加量に有意に相関した18)TGF-αmRNAは 肝 縮 胞 に お い てDNA合成とEGFR mRNAのピークに一致して増加すると報告され ている12) TGF-αトランスジェニックマウスに おいては高頻度に肝細胞癌が発生するが，肝腫蕩 では周臨正常肝組織よりもTGF-amRNA発現量 は高いことが恭されている10) これらの報告は TGF-αが肝再生と肝癌発生に重要な役割を果た していることを示唆している. 血清TGF-α値は急性肝炎あるいは劇症肝炎患 者において肝再生に伴い増加する29) 劇症肝炎患 者における血清TGFーα最高値は非生存者に比べ 生存者で有意に高値を示し， TGF-αmRNAレベ ルは急性肝炎患者でPCNAラベリング・インデッ
72 原田賢一 汐回剛史 九
f
TGF-α
-2
70bp
EGFR
-367bp
PCNA
-324bp
。
-
a
c
t
i
n
-263bp
図1.慢性肝疾患における reversetranscription polymerase chain reactionによる TGF一α，
EGFR， PCNA and s-actin mRNAの発現 M:マーカー， CH:慢性肝炎，LC:肝硬変，H:
肝細胞癌， nH:周囲非癌部 クスとよく相関を示した15) またB型慢性肝炎で は肝組織中の
TGF
一α
の発現は炎症の程度と関連 していた30) 本研究において血清TGF
α
値は健 常 者 よ り も 慢 性肝疾患患者で上昇しており， Child C及び脳症を有する患者で高値を示した. さらに血清TGF
α
値は総ビリルビン値，ICG
停 滞率及びアlレブFミン値と有意な相関を認めた 同 様に血清TGF
一α
値は肝硬変患者で血清アルブミ ンと総ビリルビン値と有意な関連がある27)という 報告があることより，血、清TGF
一α
値は肝機能障 害の重症度の指標として有用と考えられた. 今回の検討では肝癌患者の血清TGF
一α
値は健 常者と慢性肝炎患者よりも高値であったが， 肝硬 変患者よりも低値であった 肝硬変と肝癌との間 で肝組織中TGF
α
-
とEGFR
の発現に有意差はな かった この理由としてICG
停滞率やプロトロン ビン時間のような肝機能検査が肝癌患者に比べ肝 硬変患者で悪化していたため， 肝癌患者より肝硬 変患者で肝臓におけるTGF
一α
のクリアランスが 低下しているものと推測された.慢性肝疾患におけるTGF一α 73
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図2.慢性肝疾患におけるTGトα(A)，EGFR (B)， PCNA (C) mRNAの発現.
ジメチルニトロサミンによる化学肝発癌モデル において， 176個の肝腫癌の37.5%に免疫組織化 学染色法によりTGF-αが陽性となっており， 23 個の腺腫全例とl僧の肝癌でTGF一αが陽性であ り， TGF-αタンパクの増加レベルはDNAラベリ ング・インデックスの増加と関連していた20) TGF-αトランスジェニック・マウスにおいて
DNA
合成増加が肝腫大とDNA
量増加を引き起こ し22)，その結果，肝癌と肝腺腫が生じ， TGF-α は 正 常 部 よ り も 肝 癌 と 肝 腺 腫 で 高 発 現 し て い た16.19) 免疫組織化学的解析ではTGF-αは肝癌 組織と同様に周囲非腫蕩部においても発現してい ることが示されており14.16.17.31)，TGF-αは周囲非 腫蕩部で24例中23例(96%)に発現し， EGFRは24 例中17例(71%)に検出され， TGF-αとEGFRの 発現増加が周囲非腫虜組織における再生過程の一74 原田賢一・汐田剛史
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p<O.0001 PLO EL 5 4 6 8 EGFR発現量 (EGFR/β-actin)図3.慢性肝疾患の肝紐織における了GFーαとEGFR (A)， TGF一αとPCNA (B)， EGFRとPCNA (C)との関連.
2 10 12
部として生じていると報告されている凶.これら の 報 告 で は 肝 癌 組 織 と 同 様 に 非 腫 蕩 組 織 で も
TGF-a
， EGFR， PCNAが発現していると述べら れ て い る . 本 研 究 で は 肝 組 織 中 の TGF-α は EGFRとPCNAと正の栢闘を認め，肝癌組織で EGFRはPCNAと有意な関連を涼した.これらの ことより TGF-α が慢性肝疾患において肝細胞と 肝癌細胞の増殖に寄与しているものと考えられた. 結 語 車 清TGFーαは肝機能障害の重症度の指標とし て有用と考えられ、さらにTGF-α とEGFRはオーA
3 c 劇 吉 2 眠中 献 午ま序
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15 c 劇~陣
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慢性肝疾患におけるTGF一α•
2 3 4 TGF-α発現霊 (TGF-α/β-actin)•
2 3 4 丁GF-α発現量 (γGF-α / s -actin) 2 EGFR発現量 (EGFR/β-actin) 5 5•
3 n=16 r=O.541 p=O.0361 n=16 r=O.700 p=O.0067 n=16 r=O.782 p=O.0024図4.肝癌組織における TGFーαとEGFR (A)， TGF-aとPCI¥IA (B)， EGFRと PCI¥IA (C)との関連. 75 トクラインに作用し肝細胞及び肝癌細胞の細胞周 期 を 活 性 化 す る も の と 考 え ら れ た . 稿を終えるにあたり，懇切なる御指導と御校関を賜 わりました鳥取大学医学部内科学第二教室川崎寛中教 授，また御校閲賜わりました鳥取大学匿学部小児科学 教室白木和夫教授，同臨床検査医学教室猪川嗣朗教授 に深甚なる謝意、を捧げます.さらに御協力いただきま した肝臓研究室の先生方ならびに内科学第二教室員各 位に深く御礼申し上げます. なお，本論文の要旨は第33回日本肝臓学会総会(1997 年4月)及び第 11田アジア太平洋肝臓病学会議(1998
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