原 著
〔書蟻蔑85第臨6確言〕
単純ヘルペスウイルス1型角膜感染症に対する免疫局所リンパ節
細胞の効果とT細胞サブセットの役割
東京女子医科大学 眼科（主任 内田幸男）即死 萱 豊
（受付 昭和62年1月21日）Analysis of the Cell Mediated Immunity in Corneal Herpes Simplex Virus Infection：Role of the Immune Local L，ymph Node Cells
Norio KAZAMI
Department of Pphthalmology（Director：Prof． Yukio UCHIDA） Tokyo Women’s Medical College
Aprotective role of cell mediated immunity in corneal herpes simplex virus type−1（HSV−1） infection was studied． Immune local lymph node cells and immune spleen cells obtained froln the animals which had been sensitized with HSV4 subconjunctivally were adoptive transferred into the syngeneic BALB／c nude mice． HSV4 inoculated on the abrased cornea of nude mice multiplied locally and spread to the trigeminal ganglia by 7 days post−inoculation． Adoptive transfer of 1060f sensitized lymph node cells or 1070f sensitized spleen cells 2 hours prior to the corneal virus chanange inhibited
the viral proliferation in the eye balls and prevented viral spread to the trigeminal ganglia． Depletion of
Lyt l or Lyt 2．3 bearing cells reduced markediy their protective effect against infection．
The results might indicate that collaboration of both Lyt l and Lyt 2．3 positive T cells play a role in resolving corneal HSV−1 infection．
緒 言 単純ヘルペスウイルス（以下HSVと略）感染防 禦機構の中で細胞性免疫の重要性が数多く報告さ れている1）∼3）．一方HSV角膜感染症では感染防禦 だけでなく実質性角膜炎をひきおこす要因として も細胞性免疫が重要な役割をはたしていると考え られている4）∼6）．そしてそうしたなかでT細胞サ ブセットの働きについての解析も行なわれてい る． ウイルスが宿主に接種されるとT細胞が免疫さ れる．ウイルスのクリアランスに有効に働くT細 胞サブセットは，接種された抗原の量や感染して から経過した時間によって違いがあると考えられ る7）．さらに重要なことは，ウイルスの接種ルート によっても大きな相違がみられるという点であ る8）． 今までに報告されている実験ではその多くが免 疫脾細胞を用いて行なわれている．そこで今回， より実際の病像に近いものを得るために，免疫局 所リンパ節細胞を用いてHSV角膜感染時のウイ ルスの拡がりに対する抑制効果についてT細胞サ ブセットの働きを調べた．移入細胞数を変えるこ とにより，この効果の発現に必要な免疫細胞数に ついても検討を加えた．またこの際同時に得た免 疫脾細胞についても同様な実験を行ない，両者を 比較したのでここに報告する． 材料と方法 1．ウイルス
GMK細胞で継代したHSV 1型（以下HSV−1
と略）CHR3株を用いた．使用時のウイルス価は4．3×106plaque forming unit（以下pfuと略）／ m1であった． 2．動物 雌雄のBALB／c CrSlc（以下マウスと略）6 ∼8週齢，雄iのBALB／c nu／nu Slc（以下ヌード マウスと略）6週齢を用いた． 3．免疫局所リンパ節細胞浮遊液の調整 マウスの両眼球結膜下に0．8∼！．2×105pfuの HSV−1を接種した．7日後，マウスを殺し耳前リ ンパ節，顎下リンパ節を無菌的に摘出した．摘出 したリンパ節をステンレスメッシュを通して個々 の細胞とし，10％胎児ウシ血清加RPMI1640液に 浮遊させた．0．83％NH4C1液を加えて赤血球を溶 解した後，10％胎児ウシ血1清加RPMI1640液に再 浮遊させた．ついで，ルー瓶中で37℃，40分間保 温し，ガラス壁に付着したマクロファージを除き 免疫局所リンパ節細胞浮遊液を得た． 4．免疫脾細胞浮遊液の調整 球結膜下にウイルスを接種したマウスからリン パ節を摘出した際，同時に脾臓を無菌的に摘出し た．リンパ節の場合と同様の処理を施し免疫脾細 胞浮遊液を得た． 5．免疫局所リンパ節細胞の抗体処理 ’ 免疫局所リンパ節細胞浮遊液に適量の抗しyt 1・2単クローン抗体あるいは抗しyt 2・2単クロー
ン抗体（Cedarlane Lab．， Ontario， Canada）を加
え，4℃，60分反応させた．10％胎児ウシ血清加 RPMI1640液で洗った後，再び同齢に浮遊させた． この浮遊液に適量の低毒性ウサギ補体（Cedar−
lane Lab．， Ontario， Canada）を加え37℃，60分
反応させ，洗浄した後章浮遊液をつくった．それ ぞれの浮遊細胞をTrypan blueで染色し生細胞 数を確認した．抗しyt 1・2抗体処理細胞では53％， 抗しyt 2・2抗体処理細胞では55％が生細胞であっ た． 6．ヌードマウスへの細胞移入 ヌードマウスを13群に分け，1群につき5匹と した．免疫局所リンパ節細胞，免疫脾細胞をヌー ドマウス1個体につきそれぞれ107個，106個，105 個尾静脈より養子移入した．同様に抗しyt 1・2抗 体処理細胞はヌードマウス1個体につき5．3×106 個，5．3×105個，5．3×104個，抗しyt 2・2抗体処理 細胞は5．5x106個口5．5×105個，5．5×104個それぞ れ養子移入した．細胞移入を受けないものを対照 群とした． 7．ウイルス接種 細胞移入の2時間後，すべてのヌードマウスを エーテルで麻酔した後，両眼角膜を27G針で実質
に達するまで乱切した．そして両角膜上に
0．8∼1．2×105pfuのウイルスを滴下した． 8．ウイルス価の測定 ウイルス接種から7日後，すべてのヌードマウ スを殺し眼球，三叉神経節を摘出した．これらを 各群ごとに分け乳化し，GMK細胞を用いプラー ク法にてウイルス価を測定した． 結 果 1．免疫局所リンパ節細胞のウイルス増殖抑制 効果 免疫局所リンパ節細胞，免疫脾細胞のウイルス 増殖抑制効果を調べるため養子移入実験を行なっ た結果が表1である．細胞の養子移入を受けず角 膜にウイルスを接種された対照群では，接種後7 日目に摘出された眼球，三叉神経節はそれぞれ4．0×104pfu／0．1g tissue weight（以下t，w．と略）， 5．3×104pfu／0．1g t．w．のウイルス価を示した．免 疫局所リンパ節細胞を養子移入された群では， ヌードマウス1個体につき107個，106個移入した とき，眼球，三叉神経節ともにウイルスは検出さ れなかった．しかし，移入細胞数が105個の場合， 眼球，三叉神経節ともに対照群と同等のウイルス 価を示した．免疫脾細胞を移入した場合にはヌー ドマウス1個体につき107個の細胞を移入したと 表1 局所リンパ節細胞と脾細胞の抑制効果の比較 ウイルス価 細 胞 移入細胞数／マウス （pfu／0．1g tissue） 眼 球 三叉神経節 局所リンパ節細胞 107 0 0 106 0 0 105 3×104 3．7×104 脾細胞 107 0 0 106 2．7×104 LO×103 105 4．3×104 6．0×104 対 照 一 4．0×104 5．3×104 一282一
表2 局所リンパ節細胞とTリンパ球サブセットの 抑制効果の比較 細胞の処理 移入細胞数／マウス ウイルス価 ipfu／0．1g tissue） 眼 球 三叉神経節 抗Lyt1・2抗体＋補体 RLyt2・2抗体＋補体 @ 対 照 5．3×106 T’．3x105 T．3×104 T．5×105 T．5×105 T．5×104
@一
2．8×103 R．0×103 R．Ox104 Q．0×102 V．5×103 U．5×1伊 S．0×104 0 Q．7×103 @6×104 @ 0 @ 0 R．3×1G4 T．3×104 き，眼球，三叉神経節ともウイルスは検出されな かった．しかし移入細胞数が106個のとき，三叉神 経節では1．0×103pfu／0．1g t．w．と対照群よりやや 低いウイルス価を示したが，眼球のウイルス価は 対照群のそれと変わりなかった．そして移入細胞 数が105個では，眼球，三叉神経節ともに対照群と 変わらないウイルス価を示した．これらの結果か ら免疫局所リンパ節細胞は，免疫脾細胞の約10分 の1の数で同等のウイルスの拡がりに対する抑制 効果をもつことがわかった． 2．ウイルス増殖抑制に働くT細胞サブセット 免疫局所リンパ節細胞についてT細胞サブセッ トの働きを比較するために，抗しyt 1・2または抗 しyt 2・2単クローン抗体と補体で細胞を処理し，細 胞養子移入実験を行なった．その結果，表2に示 すように抗しyt 1・2抗体，抗しyt 2・2抗体処理細胞 ともに約5×106個，5×10‘個移入したとき，眼 球，三叉神経節のウイルス価は対照群のそれより 低い値を示した．しかし両細胞とも約5×104個の 移入細胞数のときにはウイルス価は対照群と同等 であった．従って，抗しyt 1・2抗体，抗しyt 2・2抗 体処理細胞ともにウイルスの増殖抑制効果をもつ ことが示された．しかしこの効果には両細胞の間 で大きな差はみられなかった． 考 察 細胞性免疫の主役をなすTリンパ球は，遅延型 過敏反応（以下DTHと略）のe任ectorとされる helper／inducer T cell（以下THと略）と細胞障 害性を示すsuppressor／cytotoxic T ce11（以下 CTLと略）の2つのサブセットに大きく分けられ る．マウスではTHはLyt 1， CTLはLyt 2・3の表 面抗原をもっており，この点で区別される9）． 前回，著者ぱ免疫脾細胞を用いた養子移入実験 で，HSV眼感染時の感染防禦の主役はCTLであ ると報告した10）．CTLがウイルスのクリアランス に有効に働くということは，Lyt抗原だけでなく H−2抗原の解析からもいわれている11）∼17）．しかしTHがHSV感染防禦の主体をなしているとの報
告もある18）∼20）．この相違は動物を免疫するときの 抗原の量や，抗原を接種してから免疫細胞を得る までの時間などが関与していると思われる7）．さ らに抗体で処理する際に，precursor CTLである Lyt 1・2・3陽性細胞を除去してしまう可能性が考 えられる21）．HSVを静脈内や前房内に接種するとDTHが
抑制され，サプレッサーT細胞が多く誘導される ことが知られている22） 24）．またHSVの接種ルー トによって誘導されるTリンパ球サブセットに相 違がある8）．これらは抗原の進入経路によって免 疫系への抗原呈示の仕方が異なることによると考 えられる．したがって腹腔内に抗原を接種して得 られる免疫脾細胞よりも眼局所に免疫して得られ るリンパ節細胞を用いる方が，HSV角膜感染時 に働く免疫細胞を解析する場合，より適当である と思われる． そこで今回，マウスの球結膜にHSV4を接種 し，7日後に耳前，顎下リンパ節を摘出して免疫 局所リンパ節細胞を得た．この細胞を用いて HSV−1角膜感染マウスに対し免疫細胞養子移入 実験を行なった．同時に同様の実験を免疫脾細胞 についても行ない，免疫リンパ節細胞と免疫脾細 胞との有効性を比較した．そして，さらに免疫局 所リンパ節細胞についてウイルスのクリアランス に働くT細胞サブセットについて検討を加えた． 結果に示したとおり，免疫局所リンパ節細胞， 免疫脾細胞ともウイルスの増殖を抑制した．この ことから免疫細胞を全身投与した場合，眼局所の 感染に対して有効に働くことが確認された．しか しこの移入された細胞両者を比較すると，リンパ 節細胞は脾細胞の10分の1で同等の効果を得てい ることがわかる．これは球結膜下という限られた場所に抗原が接種されたとき，局所リンパ節の方 に脾臓と比べてより多くの抗原が達することが一 因となっていると考えられる． 局所リンパ節細胞では106個，脾細胞では107個 の細胞を移入したときには完全なウイルス増殖阻 止効果がみられた．しかし移入細胞数をそれぞれ 10分の1にしたとき両者ともほぼ全く阻止効果を 示さなかった．このことから免疫細胞の示すウイ ルス増殖阻止効果は免疫細胞の数に依存すること が示唆された．この効果発現は一定の細胞数を境 としてall or noneであり，その細胞数は今回使用 した免疫局所リンパ節細胞では10‘∼106個の問で あった． 次に局所リンパ節細胞のT細胞サブセットの働 きを知るために抗しyt 1・2，抗しyt 2・2単クローン 抗体と補体で細胞を処理し養子移入実験を行なっ た．Lyt 1， Lyt 2・3陽性細胞ともウイルス増殖の 抑制効果に大きな差はみられなかった． 抗体処理をしていない細胞を106個移入したと きの方が，Lyt 1， Lyt 2・3陽性細胞をそれぞれ5× 106個移入したときよりも，眼球のウイルス価は低 い値を示している，また，Lyt 1， Lyt 2・3陽性細 胞のどちらかを移入した場合には，両者が存在し ている場合に見られたような移入細胞数と効果発 現の関係はみられない．従って，抗原接種から7 日目の免疫局所リンパ節細胞では，ウイルスのク リアランスにLyt 1， Lyt 2・3陽性細胞の相互作用 が働いていると考えられる． 脾細胞を用いたこれまでの報告では，どちらか のT細胞サブセットがeffector cellとして働いて いるとされている．この相違は抗原が呈示されリ ンパ球が免疫される過程の違いによるものと思わ れる．さらに前述したように抗原刺激を受けてか ら免疫細胞を得るまでの時間によってもT細胞サ ブセットの割合や働きが異なることが考えられ る．したがって，こうした点も考慮して検討する 必要がある． 今後，感染防禦だけでなく実質性角膜炎の発症 のメカニズムに関しても，T細胞サブセットの役 割について実験を重ねていく予定である． 一284 結 語 HSV−1角膜感染症の際に働くT細胞とそのサ ブセットの役割を知るために，球結膜にウイルス を接種して得た免疫局所リンパ節細胞を用いて養 子移入実験を行なった．免疫局所リンパ節細胞は 免疫脾細胞の！0分の1の細胞数で，眼球，三叉神 経節へのウイルスの拡がりを阻止した．また，免 疫細胞がウィルス増殖を抑制するためには，ある 一定の細胞数が必要なことが示唆された．Lyt 1， Lyt 2・3陽性細胞の間にはウイルス増殖抑制効果 の差ぱ認められず，両者の相互作用が働いている と考えられた， 稿を終えるにあたり，御指導，御校閲頂いた内田幸 男教授，郡山免疫医学研究所林皓三郎先生に深謝す る． なお本研究は昭和61年度文部省科学研究費補助金 （第61570851号）の援助を受けた． 文 献
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