CYP1A inducerの複合投与によるラット肝発がんイニシエーション・プロモーション作用の修飾に関する分子病理学的研究

Title

CYP1A inducerの複合投与によるラット肝発がんイニシエー

ション・プロモーション作用の修飾に関する分子病理学的

研究( 内容と審査の要旨(Summary) )

Author(s)

林, 仁美

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 甲第380号

Issue Date

2013-03-13

Type

博士論文

Version

none

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/48006

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氏名(本(国)籍) 主 指 導 教 員 名 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件

研究科及び専攻

研究指導を受けた大学

学 位 論 文 題 目

審

査 委 員 林 仁 美(東京都) 東京農工大学 教授 渋 谷 淳 博士(獣医)

獣医博甲第380号

平成25年3月13日

学位規則第3条第1項該当

連合獣医学研究科 獣医学専攻 東京農工大学 CYPIAinducerの複合投与によるラット肝発がんイニシ

エーション･プロモーション作用の修飾に関する分子病

理学的研究 主査

東京農工大学

副査

帯広畜産大学

副査 岩手大学 副査

東京農工大学

副査 岐阜大学 田 林 領 谷 井 下 古

御

渋 柳 授 授 授 授 授

教

教

教

教

教

実 与志安 政 信 淳

徳

磨

論

文 の

内

容

の

要

旨 一部の動物薬では,活性酸素種(ROS)を産生することにより肝発がんを誘発することが知られ ている｡その中にはCYPIAを誘導する物質(CYPIAinducer)も含まれている｡それらの複数の物質 を同時に摂取することで,CYPIAの代謝活性増加により食品中に微量に含まれる発がん物質のイ ニシエーション作用が増強,あるいはROS産生増加による肝発がんプロモーション作用が増強す る可能性が推察される｡本研究では,複数のCYPIAinducerをラットに同時投与することにより, 肝発がんイニシエーションもしくはプロモーション作用に対する修飾作用の有無を分子病理学的 に解析した｡CYPIAinducerとしては,胃酸分泌抑制剤であるomeprazole(OPZ),CYPIA酵素を選 択的かつ強力に誘導する天然フラボノイドの合成誘導体であるβ-mph血0鮎vone(BN下),CYPl〟2B 酵素を誘導する殺虫剤のpiperonylbutoxide(PBO)を使用した｡ 第1章では,OPZのラット肝発がんプロモーション作用の有無を,ラット肝二段階発がんモデル を用いて検討した｡6週齢雄性F344ラットにdiethylmitrosamine(DEN)でイニシエーション処置を施 し,その2週後から6週間にわたりプロモーターの投与を行い,また,投与一週間後には2/3部分 肝切除を施した｡プロモーターとして,OPZO,138,276mg耽gの連日強制経口投与を行った｡276 mgn(gOPZ投与群の肝似でラット前がん病変マーカーであるglutathioneSLtranSferaseplacentalforrn (GSTP)陽性肝細胞巣の発生の増加が静められた｡さらに,AhRに制御されるq〆αノ,q〆α2, 【な〟α∂やROS産生により誘導される句∝2や托2の有意なmRNA発現増加が静められ,酸化スト レスの関与が示唆された｡しかし,ミクロソーム由来のROS産生や脂質過酸化の指標であるチオ パルピッール酸反応陽性物質(TBARS)は減少し,DNA損傷のマーカーである 8-hydroxydeoxyguanOSine(8-OHdG)には明らかな変化は認められなかった｡OPZはラットに対して 肝発がんプロモーション作用を有することが明らかになったが,そのメカニズムには酸化ストレス が関与しない可能性を示唆した｡.

第2章では,BNFの肝発がんプロモーション作用の開催について,ラット肝二段階発がんモデ ルを用いて検討した｡プロモーターとして,0,0.03%,0.06%,0.125%,0.25%BNFの混餌投与を 行った｡0.25%BNF投与群でGSTJp陽性肝細胞巣の有意な増加が認められたが,ミクロノーム由 来のROS産生やTBARSに明らかな変化は認められなかった｡一方0.25%BNF投与群で,炎症関 連遺伝子の発現増加が認められ,さらに肝臓でCOX-2陽性細胞数の有意な増加が認められた｡ 0.25%がBNfの肝発がんプロモーション作用の閥値であり,その発がんプロモーション作用には 炎症が関与する可能性を示唆した｡ 以上の実験結果を踏まえ,第3章では,OPZとBNfを用いて複合投与を行い,発がんプロモー ション(実験1)もしくはイニシエーション(実験2)作用に対する修飾作用を検討した｡実験1 では,ラット肝二段階発がんモデルを用い,プロモーターとしてOPZ138mgn(gないし276mg/kg を連日強制経口投与,BNF O･125%ないし0.25%を混餌投与,もしくはOPZ138mg/kg及びBN下 0.125%の併用投与を行った｡実験2では,ラット肝イニシエーションアッセイモデルを用いて検 討を行った｡イニシエーターである多発芳香族炭化水素2-Amin0-3,4-dimethylimidazo[4, 5-f]quin0lone(MeIQx)の投与1週間前から9日間OPZ138mg/kgないし276mgn(gを連日強制経口 投与,BNfO.03%ないし0.06%を混餌投与,もしくはOPZ138mg耽g及びBNFO.03%の併用投与を 行った｡2/3部分肝切除12時間後にMeIqxの投与を行った｡15日間基礎飼料を与えた後,四塩化 炭素の単回投与とともに10日間2･aCe呼1am血0仙oreneの混餌投与を行った｡実験1では,併用投与. 群で,GST-P陽性肝細胞巣が276mg珠gOPZ及び0.25%BNF投与群の平均値と比較して有意に増 加した｡さらに同群では肝臓においてCqX･2のmRNA及びタンパクの発現増加が認められた｡実 験●2では,併用投与群で有意なG亭T･P陽性肝細胞巣の増加は静めらなかった｡OPZとBNfを併用 投与することにより,ラット肝発がんプロモーション作用が増強することを明らかにした｡しか↓, 併用投与では,MeIqxの肝イニシエーション作用に対する修飾作用は認められなかった｡ 第4章では,BNFとPBOを複合投与することで発がんプロモーション作用に対する修飾作用を 検討した｡プロモーターとしてBNfO.125%ないし0.25%を混餌投与,PBOO.125%ないし0.25%を 混餌投与,もしくはBNFO.125%及びPBOO.125%の併用投与を行った｡しかし,併用投与群におい ては,明らかなGST-p陽性肝細胞巣の増加は嘗められなかった｡遺伝子解析の結果,BNF+PBO併 用投与群においてq〆αノ及びqp2ムノ〟甲発現が,0.125%BNFないし0.125%PBO投与群とそれぞ れ比較して低かった｡BNF及びPBOの併用投与では,ラット肝発がんプロモーション作用は増強 せず,2剤が互いに桔抗する可能性を示唆した｡ 以上のことから,一部のCYPIAinducerを併用投与することにより,その肝発がんプロモーショ ン作用の増強することを示し,CYPIAを誘導する化学物質に同時暴露された場合は,肝発がん性 が増強する可能性を示唆した｡しかし,どのようなCYPIAinducerを用いた場合でも,同じような 発がん修飾作用が発現するか否かについては,今後さらにその詳細なメカニズムを解析する必要が ある｡ 審

査

結 果 の

要

旨 一部の動物薬には,その肝発がん過程に活性酸素種(ROS)産生による酸化ストレスが関与する ものが報告されており,その中にはCYPIAを誘導する物質(CYPIAinducer)も含まれている｡それ らの複数の物質を同時に摂取した場合,CYPIAの代謝活性増加により食品中に微量に含まれる発

がん物質のイニシエーション作用が増強,あるいはROS産生増卿による肝発がんプロモーション

作用が増強される可能性が推察される｡本研究は,複数のCYPIAinducerをラットに同時投与する ことにより,肝発がんイニシエーションないしプロモーション作用に対してどのような修飾作用が 見いだされるかについて分子病理学的に解析したものである｡CYPIAinducerとしては,胃酸分泌 阻害剤であるomeprazole(OPZ),CYPIA酵素を選択的かつ強力に誘導する天然フラボノイドの合成 誘導体であるβ-naPhthofLavone(BNF),CYPIA/2Binducerである殺虫剤のpiperonylbutoxide(PBO) を使用した｡ 第1章では,OPZのラット肝発がんプロモーション作用の有無を,ラット肝二段階発がんモデル を用いて検討した｡その結果,276mg/kgOPZ投与群の肝臓でラット前がん病変マーカーである

glutathioneS-tranSferaseplacentalform(GSTIP)陽性肝細胞巣の発生の増加が認められた｡しかし,ミ クロソーム由来のROS産生や脂質過酸化の指標であるチオパルピッール酸反応陽性物質(TBARS) は減少し,DNA損傷のマーカーである8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)には明らかな変化は認め られなかったことから,OPZはラットに対して肝発がんプロモーション作用を有し,そのメカニズ ムには酸化ストレスが関与しない可能性を示唆した｡ 第2章では,BNFの肝発がんプロモーション作用の間借について,ラット肝二段階発がんモデ ルを用いて検討した｡その結果,0.25%BNF投与群でGSTJP陽性肝細胞巣の有意な増加が認めら れたが,ミクロソーム由来のROS産生やTBARSに明らかな変化は認められなかった｡一方,炎 症関連遺伝子の発現増加が静められ,さらに肝臓でCOX-2陽性細胞数の有意な増加が認められた｡ 以上から,0.25%がBNFの肝発がんプロモーション作用の開催であり,ラットにおけるBN下の発 がんプロモーション作用には炎症が関与する可能性を示唆した｡ 第3章では,OPZとBNFを用いて複合投与を行い,発がんプロモーション(実験1)ないしイニ シエーション(実験2)作用に対する修飾作用を検討した｡実験1で軋併用投与群で,GST-P陽 性肝細胞巣が単独投与群と比較して有意に増加した｡さらに同群では肝臓においてCの-2のmRNA 発現増加とCOX-2タンパクの増加が静められた｡実験2では,併用投与群で有意なGST-P陽性肝 細胞巣の増加は認めらなかった｡以上から,OPZとBNFを併用投与することにより,ラット肝発 がんプロモーション作用を増強するが,肝イニシエーション作用に対する修飾作用はないことを明 らかにした｡ 第4章では,BNFとPBOを複合投与することで発がんプロモーション作用に対してどのような 修飾作用が発現するかを検討した｡その結果,併用投与群においては,明らかなGST-P陽性肝細 胞巣の増加は認められなかったが,q〆αJ及びqp2ゐノ〟の発現は低下した｡以上から,BNF及び PBOを併用投与することにより互いに括抗し,ラット肝発がんプロモーション作用の増強には至 らないことを明らかにした｡ 本研究において,一部のCYPIAinducerを併用投与することにより,その肝発がんプロモーショ ン作用の増強することが示され,CYPIAを誘導する化学物質に同時暴蕗された場合は,肝発がん 性が増強する可能性を示唆した｡したがって,本研究はCYPIAinducerを併用投与した際の肝発が ん機序を理解する上で,重要な知見を提供し得るものと考えた｡ 以上について,審査委負全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論文として 十分価値があると認めた｡ 基礎となる学術論文 1) 題 目 著 者 名 学術雑誌名 巻･号･貫･ 2) 眉 目 著 者 名 学術雑誌名 巻･号･貫･ 3) 題 目 ‥Livertumorpromotinge飴ctofomeprazoleinratsanditspossiblemechanismof action :Hayashi,H･,ShimamOtO,K･,Thniai,E･,Ishii,Y,Morita,R･,Suzuki,K･,Shibutani, M.andMitsumori,K. :TheJournalofToxicologlCalSciences 発行年:37(3):491-501,2012 :Thresholddoseoflivertumorpromotinge銑ctofP･naPhthonavoneinrats :Hayashi,H･,Thniai,E･,Morita,R･,Yafune,A･,Su2uki,K･,Shibutani,M･and Mitsumori,K. :TheJoumalofToxicologicalSciences 発行年:37(3):517-526,2012 :Enhancedlivertumorpromotionbutnotliverinitiationactivityinratssu句ectedto COmbinedadministrationofomeprazoleandβ,naphthoflavone 著 者 名:Hayashi,H.,Thiai,E.,Morita,R.,Hayashi,M･,Nakamura,D･,Wakita,A･,Suzuki, K.,Shibutani,M.andMitsumori,K. 学術雑誌名:TheJoumalofToxicologicalSciences 巻･号･貫･発行年:37(5):969-985,2012

既発表学術論文 1) 題 目‥Noe鮎ctofsustainedsystemicgrowthretardationonthedistributionof Reelin-eXPreSSlnginterneurOnSintheneuron-prOducinghippocampaldentategymS 著 者 _{名:Ohishi,T.,Wang,L.,Ogawa,B.,Fltiisawa,K.,Thniai,E.,Hayashi,は,Mitsumori,} K.andShibutani,M. 学術雑誌名‥ReproductiveToxicology 巻･号･頁･発行年:30(4):591-599,2010 2) 題 目:Concomitantapoptosisandregenerationofliverce11sasamechanismof liver-tumOrprOmOtionbyβ-naPhthoflavoneinvoIvingTNFα-Signalingdueto OXidativecellularstressinrats 著 者 名‥Kuwata,K.,Shibtrtani,M.,Hayashi,H.,Shimamoto,K.,Hayashi,S.M.,Suzuki,K. andMitsumori,K. 学術雑誌名:Toxicology 巻･号･頁･発行年:283(1):$-17,2011 3) 題 目:Indole-3-Carbinolenhancesoxidativestressresponsesresultingintheinductionof preneoplasticlivercelllesionsinpartiallyhepatectomizedratsinitiatedwith diethylnitrosamine 著 者 名‥ShimamOtO,K.,Dewa,Y,Ishii,Y,Kemmochi,S.,籠niai,E.,Hayashi,H.,Imaoka, M.,Morita,R.,Kuwata,K.,Suzuki,K.,Shibutani,M.andMitsumori,K. 学術雑誌名:Toxicolo訂 巻･号･頁･発行年:2S3(2-3):109-117,2011 4) 題 目=Disruptiveneuronaldevelopmentbyacrylamideinthehippocampaldentatehilus afterdevelopmentalexposureinrats 著 者 名:Ogawa,B.,Ohishi,T.,Whng,L.,Thkahashi,M.,Taniai,E.,Hayashi,Il.,Mitsumori, K.andShibutani,M. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology 巻･号･頁･発行年:S5(5):987-994,2011 5) 題 目:Evaluationofinvivogenotoxicpotentialoffenofibrateinratssubjectedto two-Weekrepeatedoraladministration 著 者 名‥Tbwfeeq,M.M.,Suzuki,T.,Shimamoto,K.,Hayashi,H.,Shibutani,M.and Mitsumori,K. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology 巻･号･貫･発行年:85(S):1003-1011,2011 6) 題 目:RelationshipbetweenCYPIAinductionbyindole-3-Carbinolorf)utamideandliver tumor-PrOmOtlngpOtentialinrats 著 者 名=ShimamOtO,K.,Dewa,Y,Kemmochi,Sっ恥niai,E.,Hayashi,H.,Imaoka,M., Shibutani,M.andMitsumori,K. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology 巻･号･貢･発行年:S5(9):1159-1166,2011 7) 題 目:AntioxidantN-aCety1-L-CySteine脚AC)suppl与mentationreducesreactiveoxygen SPeCies(ROS)-mediatedhepatocellulartumorpromotionofindole-3-Carbinol(I3C) 著 者 名:Shimamoto,K.,Hayashi,H.,1bniai,E.,Morita,R.,Imaoka,M.,Ishii,Y,Suzuki,K., Shibutani,M.andMitsumori,K. 学術雑誌名‥TheJoumalofToxicologicalSciences 巻･号･貢･発行年:36(6):775-786,2011 8) 題 目‥Mechanisticstudyonlivertumorpromotinge蝕ctsofnutamideinrats 著 者 名:Thwfeeq,M.M.,Hayashi,H.,Shimamoto,K.,Suzuki,K.,Shibutani,M.,hokuma, H.andMitsumori,K. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology 巻･号･頁･発行年:86(3):497-507,2012 9) 題 目:Protectivee飴ctofSiac妙botrysmicro甲Oratriprenylphenol-70nthedepositionof IgAtotheglomeru1armesangluminnivalenol-inducedIgAnephropathyuslng BALB/cmice 著 者 名:Kemmochi,S.,Hayashi,H.,Thiai,E.,Hasumi,K.,Sugita-Konishi,Y,Kumagai,S., Mitsumori,K.andShibutani,M. 学術雑誌名‥TheJournalofToxicologicPathology 巻･号･貫･発行年:25(2):149-154,2012

10)題 目:Cellulardistributionofcellcycle⊥relatedmoleculesintherenaltubulesofrats treatedwithrenalcarcinogensfor28days‥relationshipbetweence11cycle aberrationandcarcinogenesis 著 者 名:1もniai,E.,Hayashi,H.,Yafune,A･,Watanabe,M･,Akane,H･,Suzuki,K･, Mitsumori,K.andShibutani,M. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology 巻･号･貢･発行年:86(9):1453-1464,2012