略 号 一 覧
ANCOVA analysis of covariance
BMI body mass index
BSFS Bristol Stool Form Scale
CCQ Chinese Constipation Questionnaire CFU colony forming unit
CMR circular medium-sized red
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FAS full-analysis set
GCP Good Clinical Practice
GEE generalized estimating equation
HPLC high performance liquid chromatography IL-12 interleukin 12
ISS International Space Station
LcS Lactobacillus casei strain Shirota
LLV lactitol-LBS-vancomycin
MRS-V MRS-vancomycin
M-RTLV modified-rhamnose-2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-LBS-vancomycin
NASA National Aeronautics and Space Administration
NK natural killer
PAC-QOL Patient Assessment of Constipation Quality of Life PAC-SYM Patient Assessment of Constipation Symptom PBS phosphate buffered saline
PCR polymerase chain reaction
PMA propidium monoazide
PTP press-through-package QoL quality of life
RAPD randomly amplified polymorphic DNA TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride VBNC viable but non-culturable
1 第 1 章 序 論 微 生 物 と ヒ ト の 健 康 と の 関 わ り に つ い て 研 究 が 始 ま っ た の は 19 世 紀 後 半 か ら 20 世 紀 前 半 の こ と で あ る 。 フ ラ ン ス の 小 児 科 医 Henry Tissier は 、 1899 年 に 母 乳 保 育 さ れ て い た 乳 幼 児 の 糞 便 か ら ビ フ ィ ズ ス 菌 を 分 離 す る こ と に 成 功 し 、健 康 な ヒ ト の 腸 内 に ビ フ ィ ズ ス 菌 が 最 優 勢 に 存 在 す る こ と を 明 ら か に し た （ 1）。 免 疫 学 研 究 で 1908 年 に ノ ー ベ ル 生 理 学 ・ 医 学 賞 を 受 賞 し た ロ シ ア の 研 究 者 Ilya Metchnikoff は 、 長 寿 者 の 多 い ブ ル ガ リ ア に 住 む 人 々 が ヨ ー グ ル ト を 常 食 し て い る こ と に 着 目 し 、ヨ ー グ ル ト に 含 ま れ る 乳 酸 菌 に よ り 腸 内 の 腐 敗 菌 の 働 き が 抑 え ら れ 、老 化 の 抑 制 に つ な が る の で は な い か と 考 え た 。 こ の 「 ヨ ー グ ル ト 不 老 長 寿 説 」 は 、 1907 年 に 発 行 さ れ た 著 書 “ The Prolongation of Life”に 記 さ れ て お り （ 2）、 プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス の 概 念 の 礎 と な っ て い る 。 プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス は 、ラ テ ン 語“ pro”と ギ リ シ ア 語“ bios”を 組 み 合 わ せ た“ for life”を 意 味 し 、1965 年 に Lilly と Stillwell に よ っ て 初 め て 提 示 さ れ た （ 3）。 1989 年 に 英 国 の 微 生 物 学 者 Roy Fuller は 、「 腸 内 フ ロ ー ラ の バ ラ ン ス を 改 善 す る こ と に よ り 人 に 有 益 な 作 用 を も た ら す 生 き た 微 生 物 （ a live microbial feed supplement which beneficially affects the host animal by improving its intestinal microbial balance）」と プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス を 定 義 し た（ 4）。そ の 後 、2001 年 に 国 際 連 合 食 糧 農 業 機 関（ Food and Agriculture Organization of the United Nations： FAO）/世 界 保 健 機 関（ World Health Organization：WHO）共 同 の 専 門 家 ワ ー キ ン グ グ ル ー プ に よ り「 十 分 量 を 摂 取 し た と き に ヒ ト に 有 益 な 効 果 を も た ら す 生 き た 微 生 物（ live microorganisms which, when administered in adequate amount, confer a health benefit to the host）」 と い う 定 義 が 提 唱 さ れ （ 5）、 2002 年 に は 食 品 に 使 用 さ れ る プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス の 評 価 に 関 す る ド ラ フ ト ガ イ ド ラ イ ン を ま と め た（ 6）。2014 年 、国 際 プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス・プ レ バ イ オ テ ィ ク ス 学 術 機 関 （ the International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics）の 専 門 家 パ ネ ル メ ン バ ー に よ り 、FAO/WHO 定 義 の 文 法 的 な 修 正（ live microorganisms that , when administrated in adequate amounts, confer a health benefit on the host） が 加 え ら れ た （ 7）。
2
サ ポ ー ト す る 免 疫 賦 活 、抗 炎 症 、抗 ア レ ル ギ ー 、抗 肥 満 作 用 な ど 、プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス の 多 種 多 様 な 機 能 性 に 関 す る 研 究 成 果 が 報 告 さ れ て い る（ 7–10）。 プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス の 機 能 性 や 効 果 の 程 度 は 菌 株 に よ っ て 異 な り 、そ の 評 価 も 菌 株 レ ベ ル で 実 施 す る こ と が 求 め ら れ て い る 。
6 れ て い る 。一 方 で 、培 養 法 は「 生 き て い る 」こ と を 確 実 に 証 明 で き る 方 法 と し て 、 依 然 と し て そ の 有 用 性 は 支 持 さ れ て い る 。 LcS は 、胃 酸 お よ び 胆 汁 酸 に 耐 性 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る 。モ デ ル 実 験 系 を 用 い た 過 去 の 研 究 に て 、LcS 生 菌 が 腸 内 で 酢 酸 や 乳 酸 な ど の 有 機 酸 を 産 生 す る こ と に よ り サ ル モ ネ ラ 感 染 を 抑 制 す る こ と 、加 熱 処 理 し 死 菌 化 し た LcS に は 感 染 抑 制 効 果 が 認 め ら れ な い こ と が 報 告 さ れ （ 38 ）、 生 き て 腸 に 届 く こ と の 重 要 性 が 示 さ れ て い る 。こ れ ま で 日 本 国 内 で は 、LcS の 消 化 管 生 残 性 を 評 価 す る た め 、LcS を 摂 取 し た 被 験 者 の 糞 便 を 採 取 し 、糞 便 中 の 最 優 勢 菌 群 の 生 育 を 抑 え ら れ る 選 択 培 地 で あ る lactitol-LBS-vancomycin（ LLV）寒 天 培 地 を 用 い て 培 養 を 行 っ て い た（ 12–14）。こ の 培 地 で は 、炭 素 源 と し て ラ ク チ ト ー ル（ lactitol）、抗 生 物 質 と し て バ ン コ マ イ シ ン（ vancomycin）用 い て い る 。す な わ ち 、ラ ク チ ト ー ル を 資 化 し 、バ ン コ マ イ シ ン に 耐 性 を 有 す る 菌 は 生 育 可 能 な 培 地 で あ り 、LcS の 類 縁 種 で あ る L. casei、Lactobacillus paracasei お よ び L. rhamnosus を 培 養 す る と LcS に 類 似 の コ ロ ニ ー を 形 成 す る 。LcS 以 外 に こ れ ら の 菌 が 糞 便 中 に 含 ま れ て い る 場 合 、コ ロ ニ ー 形 態 で LcS と 見 分 け る こ と が 困 難 と な り 、消 化 管 生 残 性 評 価 に 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が あ る 。特 に 欧 州 地 域 は 古 く か ら 酪 農 が 盛 ん で あ り 、チ ー ズ や ヨ ー グ ル ト と い っ た 発 酵 乳 製 品 も 豊 富 で あ る 。欧 州 で 流 通 し て い る 製 品 の 中 に は L. rhamnosus を 含 む も の も あ り （ 39）、 現 地 に 居 住 す る 人 々 は 日 常 的 に 発 酵 乳 製 品 を 摂 取 し て い る こ と か ら 、腸 内 細 菌 叢 も そ の 食 生 活 の 影 響 を 受 け て い る 可 能 性 が あ る 。実 際 に 、欧 州 に 居 住 す る ヒ ト の 糞 便 か ら L. rhamnosus が 検 出 さ れ た こ と が 報 告 さ れ て い る （ 40）。
7
2.2 材 料 お よ び 方 法
使 用 菌 株
L. casei DSM 20011T、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081T、
L. paracasei subsp. paracasei に 属 す る 6 菌 株 （ DSM 5622T、 DSM 8741、 DSM
20006、DSM 20008、 DSM 20020、DSM 20244） お よ び L. rhamnosus に 属 す る 9 菌 株 （ DSM 20021T、 DSM 8743、 DSM 8744、 DSM 8745、 DSM 8746、 DSM
20022、 DSM 20245、 DSM 20247、 DSM 20711） は DSMZ GmbH（ ブ ラ ウ ン シ ュ ヴ ァ イ ク 、 ド イ ツ ） よ り 購 入 し た 。 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356T、
Lactobacillus brevis ATCC 14869T、 Lactobacillus fermentum ATCC 14931T、
Lactobacillus fructivorans JCM 1117T、 Lactobacillus plantarum ATCC 14917T、
Lactobacillus reuteri JCM 1112T、Lactobacillus ruminis JCM 1152T、Lactobacillus
sakei JCM 1157Tお よ び LcS は ヤ ク ル ト 中 央 研 究 所（ 東 京 ）の カ ル チ ャ ー コ レ
ク シ ョ ン よ り 入 手 し た 。 接 種 用 菌 液 の 調 製
Lactobacillus 属 の 各 菌 株 は MRS 培 地 （ Becton Dickinson and Company、 フ ラ ン ク リ ン・レ イ ク ス 、米 国 ）を 用 い て 培 養 し た 。AnaeroGen（ Oxford Limited、 ハ ン プ シ ャ ー 、 英 国 ） お よ び AnaeroPack Rectangular Jar（ 三 菱 ガ ス 化 学 株 式 会 社 、 東 京 ） を 使 用 し 、 37℃ に て 48～ 72 時 間 培 養 し た 。 培 地 調 製 M-RTLV 寒 天 培 地 の 組 成 を Table 2-1 に 示 す 。 培 地 は 1N の HCl を 用 い て pH6.0 に 調 整 し 、沸 騰 水 中 で 30 分 間 煮 沸 す る こ と に よ っ て 滅 菌 し た 。L-ラ ム ノ ー ス 溶 液 （ 0.4 g/mL）、 バ ン コ マ イ シ ン 溶 液 （ 10 mg/mL）、 メ ト ロ ニ ダ ゾ ー ル 溶 液 （ 10 mg/mL） お よ び TTC 溶 液 （ 30 mg/mL） は 、 ろ 過 滅 菌 を 行 っ た 。 プ レ ー ト に 分 注 す る 直 前 に 、 L-ラ ム ノ ー ス 溶 液 50 mL、 バ ン コ マ イ シ ン 、 メ ト ロ ニ ダ ゾ ー ル 、TTC の 各 溶 液 1 mL を 培 地 液 に 加 え た 。MRS-バ ン コ マ イ シ ン（ MRS-vancomycin：MRS-V）寒 天 培 地 は 、Tharmaraj と Shah の 方 法（ 42） に 従 い 調 製 し た 。 全 て の 寒 天 培 地 プ レ ー ト は 安 全 キ ャ ビ ネ ッ ト 内 で 10 分 間 乾 燥 さ せ た 。
菌 数 検 査
8
数 を 測 定 し た 。少 な く と も 2 回 の 独 立 し た 実 験 に よ り 、コ ロ ニ ー 形 態 を 確 認 し た 。
M-RTLV 寒 天 培 地 と MRS-V 寒 天 培 地 に よ る 菌 数 測 定 能 の 比 較
L. rhamnosus DSM 20021Tの 培 養 液 と LcS、 L. casei DSM 20011Tま た は L.
paracasei subsp. paracasei DSM 5622Tの 培 養 液 を 1:1、 1:3 お よ び 3:1 の 比 で
混 合 し 、PBS に て 106倍 希 釈 し た 。こ れ ら 混 合 希 釈 液 を M-RTLV 寒 天 培 地 お よ び MRS-V 寒 天 培 地 に 塗 抹 し た 。MRS-V 寒 天 培 地 の 場 合 は デ ュ プ リ ケ ー ト と し 、 一 つ は 37℃ 、 も う 一 つ は 43℃ で 培 養 し た 。 M-RTLV 寒 天 培 地 は 37℃ で 培 養 し た 。M-RTLV 寒 天 培 地 で は 、各 菌 株 を 単 一 培 養 し た 際 の コ ロ ニ ー 形 態 を 参 照 し た 。赤 い 斑 点 が 中 心 に あ り 、大 き い（ 2～ 3 mm 程 度 ）円 形 の 白 色 コ ロ ニ ー を L. rhamnosus、 中 程 度 の 大 き さ （ 1～ 1.5 mm 程 度 ） の 赤 色 コ ロ ニ ー を L. casei お よ び L. paracasei と 判 定 し た 。 MRS-V 寒 天 培 地 で は 、 L. rhamnosus、 L. casei お よ び L. paracasei は 37℃ で は 全 て 生 育 す る の に 対 し 、 43℃ で 生 育 で き る の は L. rhamnosus の み で あ る 。 L. casei お よ び L. paracasei の 菌 数 は 、 37℃ で 出 現 し た コ ロ ニ ー 数 か ら 43℃ で 出 現 し た コ ロ ニ ー 数 を 差 し 引 く こ と で 推 定 し た 。M-RTLV 寒 天 培 地 、MRS-V 寒 天 培 地 共 に 2 連 で 測 定 を 行 っ た 。
健 常 成 人 を 対 象 と し た LcS 発 酵 乳 の 飲 用 試 験
Drug Research Unit Ghent（ ゲ ン ト 、 ベ ル ギ ー ） が 募 集 し た ベ ル ギ ー に 居 住 す る 18～ 65 歳 の 健 常 成 人 男 女 20 名 を 本 飲 用 試 験 の 被 験 者 と し た 。試 験 の 実 施 に 先 立 ち 、Ghent University Hospital の 倫 理 審 査 委 員 会 に よ る 承 認 を 受 け た 。 全 て の 被 験 者 か ら 同 意 書 へ の 署 名 を 受 け た 。本 試 験 は ヘ ル シ ン キ 宣 言 の 主 旨 、 Good Clinical Practice（ GCP）そ の 他 の 法 令 を 遵 守 し て 実 施 し た 。被 験 者 の 除 外 基 準 は 次 の と お り と し た：① 選 択 基 準 の 年 齢 に 該 当 し な い 者 、精 神 的 あ る い は 法 的 に 十 分 な 能 力 を 有 し て い な い 者 ② 過 敏 性 腸 症 候 群 、 ク ロ ー ン 病 な ど の 慢 性 的 な 腸 管 障 害 の 既 往 を 有 す る 者 ③ 飲 用 開 始 2 週 間 前 か ら 飲 用 期 間 中 に 治 療 を 中 止 で き な い 者 、あ る い は 治 療 を 行 う こ と が 予 期 さ れ る 者（ 処 方 薬 、非 処 方 薬 、ビ タ ミ ン お よ び ハ ー ブ サ プ リ メ ン ト を 含 む 、た だ し パ ラ セ タ モ ー ル 、経 口 避 妊 薬 お よ び ホ ル モ ン 療 法 は 除 く ）④ 麻 薬 中 毒 、ア ル コ ー ル 中 毒 の 既 往 が あ る 者 。 被 験 者 を 試 験 飲 料 A 群 お よ び 試 験 飲 料 B 群 に ラ ン ダ ム に 割 り 付 け た 。 試 験 飲 料 A と し て 現 地 で 市 販 さ れ て い る Yakult、 試 験 飲 料 B と し て 現 地 で 市 販 さ れ て い る Yakult Light を 使 用 し た （ Table 2-2）。 両 飲 料 は 、 Yakult Europe B.V.（ ア ル メ ア 、 オ ラ ン ダ ） よ り 提 供 さ れ た 。
9
12
13
2.3 結 果
M-RTLV 寒 天 培 地 上 に 生 育 す る Lactobacillus 属 菌 株 の コ ロ ニ ー 形 態
Lactobacillus 属 の 26 菌 株 を M-RTLV 寒 天 培 地 で 培 養 し た と こ ろ 、L. casei、
L. paracaseii お よ び L. rhamnosus に 属 す る 全 て の 菌 株 を 含 む 21 株 が コ ロ ニ ー を 形 成 し 、5 株 は 生 育 し な か っ た（ Table 2-3）。L. casei と L. paracasei の 各 菌 株 は 赤 色 の コ ロ ニ ー を 形 成 し た の に 対 し 、 L. rhamnosus の 各 菌 株 は 赤 い 斑 点 の あ る 白 色 コ ロ ニ ー ま た は ピ ン ク 色 の コ ロ ニ ー を 形 成 し た 。こ れ ら 以 外 の 菌 株 で は 、 L. plantarum ATCC 14917Tの み L. casei/L. paracasei と 類 似 の 赤 色
コ ロ ニ ー を 形 成 し た 。L. fermentum ATCC 14931T、L. reuteri JCM 1112Tお よ び
L. sakei JCM 1157Tは 微 小 コ ロ ニ ー を 形 成 し 、 L. casei、 L. paracasei お よ び L.
rhamnosus と は 明 確 に 異 な っ て い た 。
L. casei/L. paracasei と L. rhamnosus が 混 在 す る 場 合 の M-RTLV 寒 天 培 地 で の 識 別 性 お よ び MRS-V 寒 天 培 地 と の 菌 数 測 定 能 の 比 較
LcS と L. rhamnosus DSM 20021Tの 混 合 希 釈 液 を M-RTLV 寒 天 培 地 に て 培
養 し た 例 を Fig. 2-2 に て 示 す 。 両 者 は 、 色 調 を は じ め と す る コ ロ ニ ー 形 態 の 違 い に よ り 、同 一 の M-RTLV 寒 天 培 地 プ レ ー ト 上 で 明 確 に 識 別 す る こ と が で き た 。 LcS 以 外 の L. casei/L. paracasei と L. rhamnosus の 組 合 せ で も 同 様 に 識 別 す る こ と が 可 能 で あ っ た 。 L. casei/L. paracasei と L. rhamnosus の 混 合 比 を 3 段 階 に 分 け 、 M-RTLV 寒 天 培 地 上 で の コ ロ ニ ー 形 態 の 違 い に 基 づ き 両 者 を 判 別 し 、そ れ ぞ れ の コ ロ ニ ー 数 を 計 測 し た 。比 較 対 照 と し て 、43℃ で も 生 育 で き る L. rhamnosus と 同 温 度 で は 生 育 で き な い L. casei/L. paracasei の 特 性 の 違 い を 活 用 し 、MRS-V 寒 天 培 地 を 用 い て 両 者 の 菌 数 測 定 を 行 う 方 法（ 42） を 採 用 し た 。 同 一 の 混 合 希 釈 液 を 用 い て M-RTLV 寒 天 培 地 と MRS-V 寒 天 培 地 に そ れ ぞ れ 接 種 し 培 養 し た 結 果 、L. rhamnosus DSM 20021Tと LcS、L. casei
DSM 20011Tお よ び L. paracasei subsp. paracasei DSM 5622Tの い ず れ の 組 合
14 結 果 、 19 名 中 18 名 か ら CMR コ ロ ニ ー が 検 出 さ れ た 。 試 験 飲 料 A 群 に 含 ま れ る 被 験 者 No. 13 で は 、 バ ッ ク グ ラ ウ ン ド で 生 育 し た 菌 の 数 が 非 常 に 多 く 培 地 プ レ ー ト 全 体 に 広 が っ て お り 、 CMR を 識 別 で き な か っ た 。 検 出 さ れ た CMR コ ロ ニ ー の 大 部 分 は ELISA に よ り LcS と 判 定 さ れ 、個 々 の 被 験 者 に お け る CMR と LcS の 菌 数 は 同 等 で あ っ た 。 試 験 飲 料 A 群 に お け る CMR コ ロ ニ ー 形 成 菌 数 は 6.7 ± 0.6 log1 0 CFU/g 糞 便 、 LcS 菌 数 は 6.6 ± 0.7 log1 0 CFU/g
15 Table 2-3. 各 種 乳 酸 菌 株 の M-RTLV 寒 天 培 地 上 で の コ ロ ニ ー 形 態 —： 生 育 を 認 め な い 菌 株 コ ロ ニ ー 形 態 色 形 状 大 き さ (mm) LcS 赤 色 円 形 1.0 L. casei DSM 20011T 赤 色 円 形 1.0
L. paracasei subsp. paracasei DSM 5622T 赤 色 い び つ 1.0–1.5
L. paracasei subsp. paracasei DSM 8741 赤 色 円 形 1.0
L. paracasei subsp. paracasei DSM 20006 赤 色 い び つ 2.0–3.0
L. paracasei subsp. paracasei DSM 20008 赤 色 い び つ 1.5–2.0
L. paracasei subsp. paracasei DSM 20020 赤 色 円 形 1.0
L. paracasei subsp. paracasei DSM 20244 赤 色 い び つ 2.0–3.0
L. rhamnosus DSM 20021T 白 色 、 赤 色 の 斑 点 円 形 2.0–3.0 L. rhamnosus DSM 8743 白 色 、 赤 色 の 斑 点 円 形 2.0 L. rhamnosus DSM 8744 白 色 、 赤 色 の 斑 点 円 形 2.0 L. rhamnosus DSM 8745 白 色 、 赤 色 の 斑 点 い び つ 1.5–2.0 L. rhamnosus DSM 8746 ピ ン ク 色 円 形 2.0 L. rhamnosus DSM 20022 白 色 、 赤 色 の 斑 点 円 形 1.0 L. rhamnosus DSM 20245 白 色 、 赤 色 の 斑 点 円 形 2.0 L. rhamnosus DSM 20247 白 色 、 赤 色 の 斑 点 い び つ 2.0–3.0 L. rhamnosus DSM 20711 白 色 、 赤 色 の 斑 点 円 形 1.0 L. acidophilus ATCC 4356T — — — L. brevis ATCC 14869T — — —
L. delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081T
17
Table 2-4. M-RTLV 寒 天 培 地 お よ び MRS-V 寒 天 培 地 に よ る L. rhamnosus DSM 20021T（ LR） と LcS、 L. casei DSM 20011T（ LC） ま た は L. paracasei subsp.
19 2.4 考 察 L-ラ ム ノ ー ス を 炭 素 源 と し 、pH 変 化 に よ る 呈 色 反 応 を 示 す TTC を 用 い た 新 規 な 乳 酸 菌 鑑 別 用 選 択 培 地 と し て 開 発 さ れ た M-RTLV 寒 天 培 地 の 性 能 評 価 を 行 っ た 。 本 培 地 を 用 い て 培 養 し た 場 合 、 LcS を 含 む L. casei/L. paracasei は 赤 色 の コ ロ ニ ー を 形 成 す る の に 対 し 、 L. rhamnosus は 赤 色 の 斑 点 の あ る 白 色 コ ロ ニ ー ま た は ピ ン ク 色 の コ ロ ニ ー を 形 成 し た （ Table 2-3 ）。 ま た 、 L. casei/L. paracasei と L. rhamnosus を 共 に 含 む 菌 液 を M-RTLV 寒 天 培 地 で 培 養 し た 場 合 、同 一 の プ レ ー ト 上 で も 両 者 は 異 な る 形 態 の コ ロ ニ ー を 形 成 し 、目 視 で 見 分 け て 個 別 に 菌 数 測 定 可 能 で あ る こ と が 確 認 さ れ た （ Fig. 2-2、 Table 2-4）。
Tharmaraj お よ び Shah は 、 生 育 可 能 温 度 の 違 い に よ り L. casei と L.
rhamnosus を 含 む 菌 液 か ら 両 者 の 菌 数 を 測 定 す る 方 法 を 確 立 し た（ 42）。こ の
20 培 養 に 適 用 す る 際 の M-RTLV 寒 天 培 地 の 精 度 を 高 め る た め に は 、バ ン コ マ イ シ ン 以 外 の 抗 生 物 質 を 追 加 す る な ど 、 更 な る 改 良 が 必 要 と 考 え ら れ た 。 本 試 験 で は 、試 験 飲 料 A の 飲 用 後 に 平 均 で 6.6 ± 0.7 log1 0 CFU/g 糞 便 、試 験 飲 料 B の 飲 用 後 に 6.5 ± 0.6 log10 CFU/g 糞 便 の LcS 生 菌 が そ れ ぞ れ 検 出 さ れ た（ Table 2-5）。摂 取 し た LcS 発 酵 乳 中 の 生 菌 数（ 1 本 当 た り 6.5×109 CFU） か ら 換 算 す る と 、 糞 便 1 g 当 た り の 平 均 回 収 率 は 試 験 飲 料 A が 0.061%、 試 験 飲 料 B が 0.049%と 算 出 さ れ た 。日 本 国 内 で LLV 寒 天 培 地 と ELISA を 組 み 合 わ せ て 評 価 し た 過 去 の 飲 用 試 験 結 果（ 12–14）か ら 同 様 に 算 出 し た 場 合 、平 均 回 収 率 は 0.050～ 0.084%で あ っ た 。 今 回 の 試 験 に よ り 得 ら れ た LcS 摂 取 後 の 糞 便 中 の LcS 生 菌 数 は 、LLV 寒 天 培 地 に よ る 過 去 の 試 験 実 績 と 同 等 で あ っ た と 考 え ら れ た 。培 養 法 は 、培 地 の 性 質 の 違 い に よ り 選 択 圧 の 掛 か り 方 も 異 な る が 、M-RTLV 寒 天 培 地 の 培 地 特 性 は LcS の 消 化 管 生 残 性 評 価 に は 影 響 を 及 ぼ さ な い と 判 断 さ れ た 。 本 研 究 で は 、 プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 乳 酸 菌 と し て LcS を 用 い て M-RTLV 寒 天 培 地 の 性 能 評 価 お よ び 消 化 管 生 残 性 評 価 を 行 っ た 。LcS 以 外 に も L. casei/L. paracasei お よ び L. rhamnosus に 属 す る 乳 酸 菌 が 市 販 の 発 酵 乳 製 品 等 に 用 い ら れ て お り 、こ の 培 地 を 同 様 の 評 価 に 適 用 可 能 と 考 え ら れ る 。ま た 、中 に は 一 つ の 製 品 中 に 複 数 の 乳 酸 菌 種 が 含 ま れ て い る こ と も あ り 、製 品 中 の 個 々 の 乳 酸 菌 数 を 同 一 の 寒 天 培 地 上 で 測 定 す る と い っ た 品 質 管 理 に も 応 用 す る こ と が 期 待 さ れ る 。 さ ら に 、 菌 株 の ス ク リ ー ニ ン グ に も 応 用 可 能 と 考 え ら れ 、 炭 素 源 を L-ラ ム ノ ー ス か ら 別 の 糖 に 変 え る な ど 、タ ー ゲ ッ ト に 応 じ て 利 用 の 幅 も 広 が る 技 術 と 考 え ら れ る 。
21 第 3 章 便 秘 症 状 に 関 す る 精 度 の 高 い 評 価 手 法 の 導 入 お よ び LcS の 機 能 性 評 価 3.1 硬 め の 便 の 排 出 頻 度 に 基 づ く 評 価 手 法 の 導 入 お よ び 便 が 硬 め の 健 常 成 人 を 対 象 と し た LcS 発 酵 乳 の 飲 用 効 果 検 証 3.1.1 緒 言 便 秘 と は 満 足 な 排 便 が 得 ら れ な い 状 態 で あ り 、個 々 の 主 観 に 応 じ て 症 状 の 捉 え 方 が 異 な る 。古 く か ら 、排 便 頻 度 の 低 下 が 便 秘 を 表 す 簡 便 な 指 標 と し て 扱 わ れ て き た が 、毎 日 排 便 が あ る に も 関 わ ら ず 便 秘 の 自 覚 が あ る 方 も い る こ と か ら 、排 便 頻 度 だ け で 説 明 す る こ と は で き な い（ 43）。便 秘 は 主 観 に 委 ね ら れ る こ と か ら 、自 己 申 告 型 の 評 価 手 法 が 数 多 く 開 発 さ れ て き た（ 44）。一 方 、 便 秘 症 状 の 表 現 は 国 や 地 域 、言 語 に よ っ て 異 な り 得 る 。異 な る 国 や 地 域 で も 同 じ 水 準 で 便 秘 の 状 態 を 評 価 す る た め に は 、地 域 性 や 言 語 に 依 存 し な い 評 価 手 法 の 構 築 が 必 要 で あ る 。
23
Fig. 3-1-1. ブ リ ス ト ル 便 性 状 ス ケ ー ル （ BSFS） の 見 本
24
Table 3-1-1. 機 能 性 便 秘 の 診 断 に 関 す る ロ ー マ III 基 準 1. 以 下 の 6 項 目 の う ち ， 2 項 目 以 上 を 満 た す
a. 排 便 の 25%以 上 で 排 便 時 に い き み が あ る Straining during at least 25% of defecations b. 排 便 の 25%以 上 で 硬 め の 便 が 出 る
Lumpy or hard stools in at least 25% of defecations c. 排 便 の 25%以 上 で 残 便 感 を 感 じ る
Sensation of incomplete evacuation for at least 25% of defecations d. 排 便 の 25%以 上 で 直 腸 肛 門 の 閉 塞 感 や 排 便 困 難 感 が あ る
Sensation of anorectal obstruction/blockage for at least 25% of defecations e. 排 便 の 25%以 上 で 用 手 的 に 排 便 促 進 の 対 応 を し て い る
（ 摘 便 、 骨 盤 底 圧 迫 な ど ）
Manual maneuvers to facilitate at least 25% of defecations (e.g., digital evacuation, support of the pelvic floor)
f. 排 便 回 数 が 週 に 3 回 未 満 で あ る Fewer than 3 defecations per week
2. 下 剤 を 使 わ な い と き に 軟 便 に な る こ と は 稀 で あ る
Loose stools are rarely present without the use of laxatives 3. 過 敏 性 腸 症 候 群 （ IBS） の 診 断 基 準 を 満 た さ な い
There are insufficient criteria for IBS
※ 6 か 月 以 上 前 か ら 症 状 が あ り 、 直 近 3 か 月 間 は 上 記 の 基 準 を 満 た し て い る こ と
25
3.1.2 材 料 お よ び 方 法
被 験 者
硬 め の 便 が 頻 繁 に 出 る と の 自 覚 が あ り 、 少 な く と も 2 日 に 1 回 排 便 の あ る 18 歳 ～ 65 歳 の 健 常 成 人 男 女 を 被 験 者 と し た 。 被 験 者 の 募 集 は Drug Research Unit Ghent が 行 っ た 。 試 験 の 実 施 に 先 立 ち 、 全 て の 被 験 者 か ら 同 意 書 へ の 署 名 を 受 け る と 共 に 、年 齢 等 の 背 景 情 報 お よ び 服 薬 歴 を 取 得 し た 。飲 用 試 験 へ の 参 加 者 を 選 抜 す る た め 、被 験 者 に 対 し て BSFS を 用 い た 日 誌 に 便 の 状 態 を 1 週 間 記 録 さ せ た 。平 均 BSFS ス コ ア < 3.0 と な っ た 被 験 者 を 飲 用 試 験 の 参 加 者 と し た 。 被 験 者 の 除 外 基 準 は 次 の と お り と し た ： ① 法 的 承 諾 年 齢 に 満 た な い 者 ② 精 神 的 ま た は 法 的 に 能 力 が 十 分 で な い と み な さ れ る 者 ③ 消 化 管 の 手 術 歴 を 有 す る 者 、 ま た は 慢 性 的 な 消 化 管 障 害 を 有 す る 者 ④ 重 度 の 消 化 管 障 害 を 有 す る 者 ⑤ 妊 婦 あ る い は 妊 娠 の 予 定 が あ る 者 ⑥ パ ラ セ タ モ ー ル 、経 口 避 妊 薬 お よ び ホ ル モ ン 補 充 療 法 を 除 く 服 薬 を 避 け る こ と が 困 難 で あ る 者 ⑦ 薬 物 中 毒 ま た は ア ル コ ー ル 中 毒 の 履 歴 を 有 す る 者 。試 験 期 間 中 、被 験 者 に は 試 験 飲 料 を 除 く プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 製 品 、プ レ バ イ オ テ ィ ク ス 製 品 ま た は ヨ ー グ ル ト 製 品 の 摂 取 を 控 え る よ う 指 導 し た 。 飲 用 試 験 プ ロ ト コ ー ル 飲 用 試 験 ス ケ ジ ュ ー ル を Fig. 3-1-2 に 示 す 。 本 試 験 は 、 単 一 施 設 に よ る ラ ン ダ ム 化 オ ー プ ン ラ ベ ル 非 飲 用 対 照 試 験 と し て 実 施 し た 。層 別 ブ ロ ッ ク ラ ン ダ ム 化 に よ り 、 40 名 の 被 験 者 を LcS 発 酵 乳 群 と 非 飲 用 群 に 男 女 均 等 に 割 り 付 け た 。 1 週 間 の 観 察 期 間 と 3 週 間 の 飲 用 期 間 に て 試 験 を 実 施 し 、 非 飲 用 群 は 試 験 飲 料 を 飲 用 し な い 観 察 期 間 4 週 間 と し た 。 被 験 者 は 、試 験 期 間 を 通 じ て BSFS お よ び 便 秘 関 連 症 状 を 日 誌 に 記 録 す る と 共 に 糞 便 検 体 を 週 3 回 採 取 し た 。 糞 便 の 一 部 （ 0.5～ 2 g 程 度 ） を 2 本 の 採 便 チ ュ ー ブ（ SARSTEDT、ニ ュ ー ム ブ レ ヒ ト 、ド イ ツ ）に 採 取 し 、分 析 に 供 す る ま で 凍 結 状 態 を 維 持 し た 。 被 験 者 は 日 誌 と 糞 便 検 体 を 試 験 実 施 施 設 （ Drug Research Unit Ghent） ま で 毎 週 持 参 し た 。
試 験 の 実 施 に 先 立 ち 、Ghent University Hospital の 倫 理 審 査 委 員 会 に よ る 承 認 を 受 け た 。本 試 験 は ヘ ル シ ン キ 宣 言 の 主 旨 、GCP そ の 他 の 法 令 を 遵 守 し て 実 施 し た 。
試 験 飲 料
試 験 飲 料 は 、 1 本 65 mL 当 た り 6.5 × 109 CFU の LcS を 含 む 発 酵 乳 （ Table
27
ト を 精 製 水 1 mL に 溶 解 し た 後 0.45 μm フィルターにて濾過し、HPLC 解析
に 供 し た 。 統 計 解 析
全 て の 統 計 解 析 は SAS バ ー ジ ョ ン 9.1.3（ SAS Institute Inc.、ケ ー リ ー 、ノ ー ス カ ロ ラ イ ナ 州 、 米 国 ） に て 実 施 し た 。 サ ン プ ル サ イ ズ の 推 定 は 次 の と お り 行 っ た 。未 発 表 デ ー タ か ら 、平 均 BSFS ス コ ア < 3.0 と な る 健 常 成 人 の ベ ー ス ラ イ ン に お け る 排 便 の 25%以 上 で 硬 め の 便 が 出 る 人 の 比 率 は 85.7%と 見 積 も ら れ た 。 既 報 （ 54） を 参 照 し 、 LcS 発 酵 乳 の 継 続 飲 用 に よ り そ の 比 率 は 26.4%ま で 低 減 す る と 推 定 さ れ た 。非 飲 用 群 は 変 化 無 し と し た 。 カ イ 二 乗 検 定 に て 両 側 検 定 に よ る 有 意 水 準 を 5%と し た 場 合 、80%の 検 出 力 を 得 る た め に 必 要 な 被 験 者 数 は 13 名 と 見 積 も ら れ た 。 途 中 脱 落 の 可 能 性 を 考 慮 し 、 1 群 の 被 験 者 数 を 20 名 と 設 定 し た 。 排 便 の 25% 以 上 で 硬 め の 便 が 出 る 被 験 者 の 比 率 は 、 一 般 化 推 定 方 程 式 （ generalized estimating equation model： GEE model） で 両 側 検 定 に て 0.05 を 有 意 水 準 と し て 解 析 し た 。 BSFS ス コ ア 、 便 秘 関 連 症 状 ス コ ア 、 便 中 水 分 含 量 お よ び 便 中 代 謝 産 物 濃 度 の 変 化 は 、 反 復 測 定 の 共 分 散 分 析 （ repeated analysis of covariance model： repeated ANCOVA model） で 両 側 検 定 に て 0.05 を 有 意 水 準 と し て 解 析 し た 。 排 便 回 数 お よ び 残 便 感 の 無 い 排 便 回 数 も repeated ANCOVA model に て 解 析 し た 。
28
30
Table 3-1-3. 便 秘 関 連 症 状 ス コ ア
ス コ ア
1 2 3 4
排 便 時 の 痛 み
Painful effort during bowel movement None Little Some A lot 排 便 後 の 残 便 感
Feeling incomplete on bowel movement None Little Some A lot 排 便 時 の い き み
Straining during bowel movement None Little Some A lot ト イ レ の 滞 在 時 間
Minutes in lavatory per attempt < 5min 5-10 min 10-20 min
20 min or more 排 便 未 遂
Unsuccessful attempts for bowel movement Never 1 time 2times
3 times or more 腹 部 の 不 快 感
32
36
Table 3-1-6. 便 秘 関 連 症 状 ス コ ア の 変 化
38 Table 3-1-8. 排 便 回 数 お よ び 残 便 感 の 無 い 排 便 回 数 の 変 化 飲 用 前 飲 用 期 間 （ 飲 用 前 か ら の 変 化 ） 1 週 目 2 週 目 3 週 目 4 週 目 P 排 便 回 数 （ 回 /週 ） LcS 発 酵 乳 群 6.2 ± 2.0 7.0 ± 2.1 (0.7 ± 1.4) 7.6 ± 2.7 (1.4 ± 2.1) 7.9 ± 3.1 (1.7 ± 1.8) < 0.001 非 飲 用 群 5.9 ± 1.5 6.0 ± 2.0 (0.1 ± 1.0) 5.9 ± 1.7 (0.0 ± 1.2) 6.0 ± 2.0 (0.1 ± 1.7) 残 便 感 の 無 い 排 便 回 数 （ 回 /週 ） LcS 発 酵 乳 群 3.2 ± 2.2 3.7 ± 3.3 (0.6 ± 2.2) 4.5 ± 3.3 (1.4 ± 2.5) 5.3 ± 3.0 (2.1 ± 2.6) 0.039 非 飲 用 群 3.5 ± 2.4 4.1 ± 2.6 (0.6 ± 1.6) 4.2 ± 2.3 (0.7 ± 2.2) 3.9 ± 2.8 (0.4 ± 2.5)
43 便 秘 の 対 策 と し て 食 事 や 生 活 習 慣 の 改 善 が 第 一 に 挙 げ ら れ 、出 産 前 に 栄 養 学 の 知 識 や 健 康 的 な 生 活 習 慣 に 関 す る 教 育 を 行 う こ と は 、出 産 後 の 便 秘 改 善 に も 有 効 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る（ 82）。こ の ア プ ロ ー チ は 、食 生 活 の 要 因 と 便 秘 の 発 症 と の 関 連 性 を 示 す 知 見 を 支 持 す る も の で あ る （ 83）。 適 度 な 運 動 や 食 物 繊 維 、水 分 の 摂 取 も 一 般 的 に 有 用 と さ れ て い る が 、科 学 的 根 拠 に 乏 し い と の 報 告 も あ る（ 84, 85）。生 活 習 慣 等 の 改 善 で も 効 果 が み ら れ な い 場 合 は 緩 下 剤 に よ る 便 秘 の 治 療 が 行 わ れ 、浸 透 圧 調 節 剤 、軟 便 化 剤 、膨 張 化 剤 が は じ め に 利 用 さ れ る （ 85）。 こ れ ら の 緩 下 剤 は 妊 娠 中 で も 使 用 可 能 で あ る が 、副 作 用 と し て 膨 満 感 、痙 攣 、電 解 質 異 常 を 引 き 起 こ す こ と も あ る（ 86）。 次 の 段 階 で 使 用 さ れ る の は 刺 激 性 の 緩 下 剤 で あ る 。セ ン ナ は 出 産 後 に お け る 排 便 状 況 の 改 善 に 有 効 で あ る こ と が 示 さ れ て い る も の の 、腹 部 痙 攣 が 副 作 用 と し て 懸 念 さ れ る （ 87）。 育 児 を 営 む 出 産 後 の 女 性 に と っ て は 安 全 か つ ス ト レ ス の 掛 か ら な い 便 秘 対 策 が 理 想 的 で あ り 、有 効 な 手 段 の 確 立 が 望 ま れ て い る 。安 全 性 が 高 く 発 酵 乳 飲 料 と し て 手 軽 に 摂 取 可 能 で あ り 、排 便 状 況 等 の 改 善 効 果 が 報 告 さ れ て い る LcS は 、 出 産 後 の 女 性 に お け る 便 秘 ケ ア に 有 用 で は な い か と 考 え た 。 そ こ で 、 産 褥 期 の 女 性 を 対 象 と し た LcS 発 酵 乳 飲 用 に よ る プ ラ セ ボ 対 照 二 重 盲 検 試 験 を 実 施 し 、PAC-SYM お よ び PAC-QOL を 採 用 し て 便 秘 関 連 症 状 お よ び QoL に 対 す る 効 果 を 検 証 し た 。併 せ て 、出 産 後 の 女 性 に 多 く 、便 秘 と の 関 連 性 も 示 唆 さ れ て い る 痔 に 対 す る 効 果 も 調 べ た 。 3.2.2 材 料 お よ び 方 法 被 験 者
44 る 者 ⑨ 本 試 験 を 完 遂 で き な い 、 ま た は 試 験 手 順 や 要 件 を 満 た す こ と が で き な い 可 能 性 が あ る と 試 験 責 任 者 が 判 断 し た 者 。 観 察 期 間 お よ び 飲 用 期 間 中 、被 験 者 は 試 験 飲 料 を 除 く プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 製 品 ま た は ヨ ー グ ル ト 製 品 の 摂 取 、緩 下 剤 、抗 生 物 質 そ の 他 の 試 験 結 果 に 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が あ る と 試 験 責 任 者 が 判 断 し た 薬 剤 の 服 用 を 制 限 さ れ た 。 た だ し 、制 限 さ れ た 食 品 ま た は 薬 剤 を 摂 取 し た 場 合 で も 試 験 参 加 の 継 続 を 認 め た 。 飲 用 試 験 プ ロ ト コ ー ル 本 試 験 は ラ ン ダ ム 化 プ ラ セ ボ 対 照 二 重 盲 検 並 行 群 間 比 較 試 験 と し て 実 施 し た 。 飲 用 試 験 ス ケ ジ ュ ー ル を Fig. 3-2-1 に 示 す 。 試 験 期 間 は 、 妊 娠 中 最 長 8 週 間 の 選 抜 期 間 、 4 日 間 の 観 察 期 間 （ 出 産 当 日 ～ 出 産 後 3 日 目 ） お よ び 6 週 間 の 飲 用 期 間（ 出 産 後 4 日 目 以 降 ）で 構 成 さ れ た 。選 抜 時 に 全 被 験 者 よ り 署 名 済 み 同 意 書 を 取 得 し 、条 件 を 満 た す 者 は 飲 用 期 間 中 に LcS を 含 む 発 酵 乳 を 飲 用 す る 群 （ LcS 発 酵 乳 群 ） ま た は プ ラ セ ボ を 飲 用 す る 群 （ プ ラ セ ボ 群 ） へ ラ ン ダ ム に 割 り 付 け ら れ た 。被 験 者 は 、観 察 期 間 お よ び 飲 用 期 間 中 に 排 便 回 数 、 便 性 状 お よ び 痔 の 出 血 の 有 無 を 含 む 排 便 習 慣 に 関 す る 日 誌 記 録 し た 。 ま た 、 飲 用 14 日 目 、 28 日 目 お よ び 42 日 目 に PAC-SYM お よ び PAC-QOL の 各 質 問 票 に 回 答 さ せ た 。 な お PAC-SYM/PAC-QOL の ラ イ セ ン ス は Mapi Research Trust（ リ ヨ ン 、フ ラ ン ス ）が 保 有 し て お り 、事 前 に 使 用 許 諾 契 約 を 締 結 し た 。な お 、PAC-SYM お よ び PAC-QOL の ベ ー ス ラ イ ン デ ー タ 取 得 は 行 わ な か っ た 。日 誌 は 1 週 毎 に 回 収 し 、PAC-SYM お よ び PAC-QOL の 質 問 票 は 2 週 毎 に 回 収 し た 。被 験 者 に は 毎 週 10 本 の 試 験 飲 料（ 予 備 3 本 を 含 む ）を 配 布 し 、飲 用 済 み お よ び 未 飲 用 の ボ ト ル を 回 収 し て 飲 用 コ ン プ ラ イ ア ン ス を 確 認 し た 。
45
ラ ン ダ ム 化 お よ び 盲 検 化
46
47
53
Table 3-2-3. BSFS ス コ ア 、 排 便 回 数 お よ び 残 便 感 の 無 い 排 便 回 数 の 変 化
54
Table 3-2-4. PAC-SYM ス コ ア の 変 化
55
Table 3-2-5. PAC-QOL ス コ ア の 変 化
56
61
63
［ プ ラ イ マ ー 配 列 （ 5'-3'）］
pLcS-57F： CTCAAAGCCGTGACGGTC
pLcS-597R： ACGTGGTGCTAATAATCCTAGTG
Randomly amplified polymorphic DNA（ RAPD） 解 析
64
イ ブ ラ リ ー を MiSeq（ Illumina Inc.） に よ る paired-end sequencing に 供 し た 。 シ ー ケ ン ス デ ー タ は CLC Genomics Workbench（ CLC Bio、フ ィ ン ラ ン ズ ゲ イ ド 、 デ ン マ ー ク ） に 移 し 、 次 の 条 件 に て ト リ ミ ン グ を 行 っ た : trim using quality scores limit = 0.05; trim ambiguous nucleotides = 2; discard reads below length = 150.ト リ ミ ン グ 後 の デ ー タ を LcS の ゲ ノ ム シ ー ケ ン ス と 照 合 し 、 マ ッ ピ ン グ を 行 っ た 。Variant calling は SAMtools（ 105）を 用 い て 実 施 し 、次 の 条 件 を 満 た す 位 置 の sequence variant frequency を 評 価 し た ： depth for the chromosome > sequence coverage × 1/3、 depth for the plasmid > 3 × sequence coverage × 1/3、 SP (Phred-scaled strand bias P-value) < 13。 Variant frequency が 50%を 超 え る 場 合 、 一 塩 基 多 型 が 生 じ て い る と み な し た 。 発 酵 性 状 解 析 糖 発 酵 性 試 験 : 凍 結 乾 燥 LcS 粉 末 1 さ じ 分 を 試 験 管 内 の MRS 培 地 に て 37℃ で 一 晩 培 養 し た 。 培 養 液 の 一 部 を 採 取 し 、 再 度 MRS 培 地 に て 37℃ で 一 晩 培 養 し た 。1,660 g、4℃ で 20 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、ペ レ ッ ト を API 50 CIIL medium（ シ ス メ ッ ク ス・ビ オ メ リ ュ ー 株 式 会 社 、東 京 ）に て 懸 濁 し た 。指 定 の 手 順 に 従 い 、 API 50 CH strip を 用 い て 49 種 類 の 糖 の 発 酵 性 を 評 価 し た 。 生 育 曲 線 : カ プ セ ル 1 個 分 の 凍 結 乾 燥 LcS 粉 末 を 10 mL の MRS 培 地 に 懸 濁 し 、さ ら に MRS 培 地 で 20 倍 希 釈 し た 後 、新 し い MRS 培 地 に 1%(v/v)で 接 種 し て 37℃ で 24 時 間 培 養 し た 。 培 養 中 、 4 時 間 毎 に サ ン プ リ ン グ を 行 っ て pH を 測 定 す る と 共 に 、MRS 寒 天 培 地 に て 37℃ で 48～ 72 時 間 培 養 し 、LcS の 生 菌 数 を 測 定 し た 。 免 疫 指 標 解 析 LcS 特 異 的 抗 体 へ の 反 応 性 : 凍 結 乾 燥 LcS 粉 末 を 2 mg/mL と な る よ う PBS に 懸 濁 し 、室 温 で 30 分 間 静 置 し た 。そ の 上 清 を 回 収 し 、LcS 懸 濁 液 と し た 。 LcS 懸 濁 液 400 μL を 600 μL の PBS と混合した後に 10,000 g、4℃で 5 分間 遠 心 分 離 し た 。 ペ レ ッ ト に LcS 特 異 的 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 L8 を 産 生 す る ハ イ ブ リ ド ー マ 細 胞 培 養 上 清 の 10 倍 希 釈 液 100 μL を添加し、抗体反応に供し た 。4℃で一晩インキュベートし、PBS で 2 回洗浄した後、FITC 標識された
mouse immunoglobulin light-chain antibody（ clone RMK-45、 BioLegend、 サ ン
66
あ っ た 。ま た 、PMA-qPCR 法 に よ る 測 定 の 結 果 、FS は 12.5 ± 0.02 log10 cells/g
粉 末 、GC-US は 12.4 ± 0.08 log1 0 cells/g 粉 末 、GC-JP は 12.4 ± 0.10 log10 cells/g
粉 末 と な っ た （ 平 均 値 ± 標 準 偏 差 ）。 遺 伝 子 解 析 お よ び 発 酵 性 状 解 析
67
Fig. 4-1. ISS 保 管 後 に 地 上 帰 還 し た 試 験 サ ン プ ル （ FS）。 A： パ ッ ケ ー ジ お よ び LcS カ プ セ ル の 外 観 、 B： バ イ オ パ ド レ ス （ 左 ） お よ び 温 度 ロ ガ ー （ 右 ）。
A
68
70
72
Fig. 4-5. 各 試 験 サ ン プ ル に 含 ま れ る LcS の Sequence variance 解 析 結 果 。 A： 染 色 体 、B：プ ラ ス ミ ド pLY101、Baseline：製 造 時 。推 定 さ れ る コ ピ ー 数（ 3 コ ピ ー ） を 考 慮 し て 解 析 を 実 施 し た 。
Position in the chromosome
73 Fig. 4-5. （ 続 き ）
B
V ar ia n t f re q ue nc y74
76
88
89
引 用 文 献
1. Tissier H. Recherches sur la flore intestinale des nourrissons (état normal et pathologique). University of Paris. 1900.
2. Metchnikoff I. The Prolongation of Life: Optimistic Studies (Classics in Longevity and Aging). 1907.
3. Lilly DM, Stillwell RH. Probiotics: growth-promoting factors produced by microorganisms. Science. 1965;147:747–8.
4. Fuller R. Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol. 1989;66:365–78. 5. Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional
Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. 1-4 October 2001.
6. Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. 30 April - 1 May 2002.
7. Hill C, Guarner F, Reid G, Gibson GR, Merenstein DJ, Pot B, Morelli L, Canani RB, Flint HJ, Salminen S, Calder PC, Sanders ME. Expert consensus document. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2014;11:506–14.
8. Sanders ME, Guarner F, Guerrant R, Holt PR, Quigley EM, Sartor RB, Sherman PM, Mayer EA. An update on the use and investigation of probiotics in health and disease. Gut. 2013;62:787–96.
9. Jäger R, Mohr AE, Carpenter KC, Kerksick CM, Purpura M, Moussa A, Townsend JR, Lamprecht M, West NP, Black K, Gleeson M, Pyne DB, Wells SD, Arent SM, Smith-Ryan AE, Kreider RB, Campbell BI, Bannock L, Scheiman J, Wissent CJ, Pane M, Kalman DS, Pugh JN, Ter Haar JA, Antonio J. International Society of Sports Nutrition Position Stand: Probiotics. J Int Soc Sports Nutr. 2019;16:62.
10. Sivamaruthi BS, Kesika P, Suganthy N, Chaiyasut C. A Review on role of microbiome in obesity and antiobesity properties of probiotic supplements. Biomed Res Int. 2019;2019:3291367.
11. Yakult Central Institute for Microbiological Research. Lactobacillus casei strain Shirota : intestinal microbiota and human health: new advances. 2013. 12. Yuki N, Watanabe K, Mike A, Tagami Y, Tanaka R, Ohwaki M, Morotomi M.
Survival of a probiotic, Lactobacillus casei strain Shirota, in the gastrointestinal tract: selective isolation from faeces and identification using monoclonal antibodies. Int J Food Microbiol. 1999;48:51–7.
90
Yamaoka Y, Hirano K, Nishimura A, Kajimoto O, Nomoto K. The Effects of a probiotic milk product containing Lactobacillus casei strain Shirota on the defecation frequency and the intestinal microflora of sub-optimal health state volunteers : a randomized placebo-controlled cross-over study. Biocsi Microflora. 2006;25:39–48.
14. Shioiri T, Yahagi K, Nakayama S, Asahara T, Yuki N, Kawakami K, Yamaoka Y, Sakai Y, Nomoto K, Totani M. The effect of a symbiotic fermented milk beverage containing Lactobacillus casei strain Shirota and transgalactosylated oligosaccharides on defecation frequency, intestinal microflora, organic acid concentrations, and putrefactive metabolites of sub-optimal health state volunteers: a randomized placebo-controlled cross-over study. Biosci Microflora. 2006;25:137–46.
15. Shida K, Suzuki T, Kiyoshima-Shibata J, Shimada S, Nanno M. Essential roles of monocytes in stimulating human peripheral blood mononuclear cells with Lactobacillus casei to produce cytokines and augment natural killer cell activity. Clin Vaccine Immunol. 2006;13:997–1003.
16. Shida K, Kiyoshima-Shibata J, Nagaoka M, Watanabe K, Nanno M. Induction of interleukin-12 by Lactobacillus strains having a rigid cell wall resistant to intracellular digestion. J Dairy Sci. 2006;89:3306–17.
17. Nagao F, Nakayama M, Muto T, Okumura K. Effects of a fermented milk drink containing Lactobacillus casei strain Shirota on the immune system in healthy human subjects. Biosci Biotechnol Biochem. 2000;64:2706–8.
18. Morimoto K, Takeshita T, Nanno M, Tokudome S, Nakayama K. Modulation of natural killer cell activity by supplementation of fermented milk containing Lactobacillus casei in habitual smokers. Prev Med. 2005;40:589–94.
19. Takeda K, Suzuki T, Shimada S-I, Shida K, Nanno M, Okumura K. Interleukin-12 is involved in the enhancement of human natural killer cell activity by Lactobacillus casei Shirota. Clin Exp Immunol. 2006;146:109–15.
20. Shida K, Sato T, Iizuka R, Hoshi R, Watanabe O, Igarashi T, Miyazaki K, Nanno M, Ishikawa F. Daily intake of fermented milk with Lactobacillus casei strain Shirota reduces the incidence and duration of upper respiratory tract infections in healthy middle-aged office workers. Eur J Nutr. 2017;56:45–53. 21. Ishikawa H, Akedo I, Otani T, Suzuki T, Nakamura T, Takeyama I, Ishiguro S, Miyaoka E, Sobue T, Kakizoe T. Randomized trial of dietary fiber and Lactobacillus casei administration for prevention of colorectal tumors. Int J Cancer. 2005;116:762–7.
91
of a Lactobacillus casei preparation on the recurrence of superficial bladder cancer in a double-blind trial. The BLP Study Group. Eur Urol. 1995;27:104– 9.
23. Ohashi Y, Nakai S, Tsukamoto T, Masumori N, Akaza H, Miyanaga N, Kitamura T, Kawabe K, Kotake T, Kuroda M, Naito S, Koga H, Saito Y, Nomata K, Kitagawa M, Aso Y. Habitual intake of lactic acid bacteria and risk reduction of bladder cancer. Urol Int. 2002;68:273–80.
24. Toi M, Hirota S, Tomotaki A, Sato N, Hozumi Y, Anan K, Nagashima T, Tokuda Y, Masuda N, Ohsumi S, Ohno S, Takahashi M, Hayashi H, Yamamoto S, Ohashi Y. Probiotic beverage with soy isoflavone consumption for breast cancer prevention: a case-control study. Curr Nutr Food Sci. 2013;9:194–200. 25. Bian L, Nagata S, Asahara T, Rahman MS, Ohta T, Yuki N, Wang C, Takano K, Daibo M, Nomoto K, Yamashiro Y. Effects of the continuous intake of Lactobacillus casei strain shirota-fermented milk on risk management of long-term inpatients at health service facilities for the elderly. Int J Probiotics Prebiotics 2011;6:123-32.
26. Fujita R, Iimuro S, Shinozaki T, Sakamaki K, Uemura Y, Takeuchi A, Matsuyama Y, Ohashi Y. Decreased duration of acute upper respiratory tract infections with daily intake of fermented milk: a multicenter, double-blinded, randomized comparative study in users of day care facilities for the elderly population. Am J Infect Control. 2013;41:1231–5.
27. Nagata S, Asahara T, Wang C, Suyama Y, Chonan O, Takano K, Daibou M, Takahashi T, Nomoto K, Yamashiro Y. The effectiveness of Lactobacillus beverages in controlling infections among the residents of an aged care facility: a randomized placebo-controlled double-blind trial. Ann Nutr Metab. 2016;68:51–9.
28. Kato-Kataoka A, Nishida K, Takada M, Kawai M, Kikuchi-Hayakawa H, Suda K, Ishikawa H, Gondo Y, Shimizu K, Matsuki T, Kushiro A, Hoshi R, Watanabe O, Igarashi T, Miyazaki K, Kuwano Y, Rokutan K. Fermented milk containing Lactobacillus casei strain Shirota preserves the diversity of the gut microbiota and relieves abdominal dysfunction in healthy medical students exposed to academic stress. Appl Environ Microbiol. 2016;82:3649–58. 29. Takada M, Nishida K, Kataoka-Kato A, Gondo Y, Ishikawa H, Suda K, Kawai
92
models. Neurogastroenterol Motil. 2016;28:1027–36.
30. Takada M, Nishida K, Gondo Y, Kikuchi-Hayakawa H, Ishikawa H, Suda K, Kawai M, Hoshi R, Kuwano Y, Miyazaki K, Rokutan K. Beneficial effects of Lactobacillus casei strain Shirota on academic stress-induced sleep disturbance in healthy adults: a double-blind, randomised, placebo-controlled trial. Benef Microbes. 2017;8:153–62.
31. Dimidi E, Christodoulides S, Scott SM, Whelan K. Mechanisms of Action of Probiotics and the Gastrointestinal Microbiota on Gut Motility and Constipation. Adv Nutr. 2017;8:484–94.
32. Bron PA, Kleerebezem M, Brummer R-J, Cani PD, Mercenier A, MacDonald TT, Garcia-Ródenas CL, Wells JM. Can probiotics modulate human disease by impacting intestinal barrier function? Br J of Nutr. 2017;117:93–107.
33. Sakai T, Oishi K, Asahara T, Takada T, Yuki N, Matsumoto K, Nomoto K, Kushiro A. M-RTLV agar, a novel selective medium to distinguish Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei from Lactobacillus rhamnosus. Int J Food Microbiol. 2010;139:154–60.
34. Sakai T, Makino H, Ishikawa E, Oishi K, Kushiro A. Fermented milk containing Lactobacillus casei strain Shirota reduces incidence of hard or lumpy stools in healthy population. Int J Food Sci Nutr 2011;62:423–30. 35. Sakai T, Kubota H, Gawad A, Gheyle L, Ramael S, Oishi K. Effect of
fermented milk containing Lactobacillus casei strain Shirota on constipation-related symptoms and haemorrhoids in women during puerperium. Benef Microbes. 2015;6:253-62.
36. Sakai T, Moteki Y, Takahashi T, Shida K, Kiwaki M, Shimakawa Y, Matsui A, Chonan O, Morikawa K, Ohta T, Ohshima H, Furukawa S. Probiotics into outer space: feasibility assessments of encapsulated freeze-dried probiotics during 1 month’s storage on the International Space Station. Sci Rep. 2018;8:10687. 37. Davis C. Enumeration of probiotic strains: Review of culture-dependent and alternative techniques to quantify viable bacteria. J Microbiol Methods. 2014;103:9–17.
38. Asahara T, Shimizu K, Takada T, Kado S, Yuki N, Morotomi M, Tanaka R, Nomoto K. Protective effect of Lactobacillus casei strain Shirota against lethal infection with multi-drug resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 in mice. J Appl Microbiol. 2011;110:163–73.
39. Reid G, Kim SO, Köhler GA. Selecting, testing and understanding probiotic microorganisms. FEMS Immunol Med Microbiol. 2006;46:149–57.
93
Genomic diversity of cultivable Lactobacillus populations residing in the neonatal and adult gastrointestinal tract. FEMS Microbiol Ecol. 2007;59:127– 37.
41. Nagasaki H, Ito K, Matsuzaki S, Tanaka S. An improved tetrazolium agar medium for testing sugar fermentation in lactobacilli. Nippon Saikingaku Zasshi. 1992;47:511–4.
42. Tharmaraj N, Shah NP. Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus,
Bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and
Propionibacteria. J Dairy Sci. 2003;86:2288–96.
43. Cummings JH, Antoine JM, Azpiroz F, Bourdet-Sicard R, Brandtzaeg P, Calder PC, Gibson GR, Guarner F, Isolauri E, Pannemans D, Shortt C, Tuijtelaars S, Watzl B. PASSCLAIM – gut health and immunity. Eur J Nutr. 2004;43 Suppl 2:II118–II173.
44. McCrea GL, Miaskowski C, Stotts NA, Macera L, Hart SA, Varma MG. Review article: self-report measures to evaluate constipation. Aliment Pharmacol Ther. 2008;27:638–48.
45. Heaton KW, Ghosh S, Braddon FE. How bad are the symptoms and bowel dysfunction of patients with the irritable bowel syndrome? A prospective, controlled study with emphasis on stool form. Gut. 1991;32:73–9.
46. Bassotti G, Bellini M, Pucciani F, Bocchini R, Bove A, Alduini P, Battaglia E, Bruzzi P; Italian Constipation Study Group. An extended assessment of bowel habits in a general population. World J Gastroenterol. 2004;10:713–6.
47. Garrigues V, Gálvez C, Ortiz V, Ponce M, Nos P, Ponce J. Prevalence of constipation: agreement among several criteria and evaluation of the diagnostic accuracy of qualifying symptoms and self-reported definition in a population-based survey in Spain. Am J Epidemiol. 2004;159:520–6.
48. O'Donnell LJ, Virjee J, Heaton KW. Detection of pseudodiarrhoea by simple clinical assessment of intestinal transit rate. BMJ. 1990;300:439–40.
49. Probert CJ, Emmett PM, Heaton KW. Intestinal transit time in the population calculated from self made observations of defecation. J Epidemiol Community Health. 1993;47:331–3.
50. Degen LP, Phillips SF. How well does stool form reflect colonic transit? Gut. 1996;39:109–13.
51. Lewis SJ, Heaton KW. Stool form scale as a useful guide to intestinal transit time. Scand J Gastroenterol. 1997;32:920–4.
94
RC. Functional bowel disorders. Gastroenterology. 2006;130:1480–91.
53. Lacy BE, Mearin F, Chang L, Chey WD, Lembo AJ, Simren M, Spiller R. Bowel disorders. Gastroenterology 2016;150:1393–1407.
54. Koebnick C, Wagner I, Leitzmann P, Stern U, Zunft HJ. Probiotic beverage containing Lactobacillus casei Shirota improves gastrointestinal symptoms in patients with chronic constipation. Can J Gastroenterol. 2003;17:655–9. 55. Kikuchi H, Tajima T. Correlation between water-holding capacity of different
types of cellulose in vitro and gastrointestinal retention time in vivo of rats. J Sci Food Agric. 1992;60:139–46.
56. Topping DL, Clifton PM. Short-chain fatty acids and human colonic function: roles of resistant starch and nonstarch polysaccharides. Physiol Rev. 2001;81:1031–64.
57. Ríos-Covián D, Ruas-Madiedo P, Margolles A, Gueimonde M, de los Reyes-Gavilán CG, Salazar N. Intestinal short chain fatty acids and their link with diet and human health. Front Microbiol. 2016;7:185.
58. Mosele JI, Macià A, Motilva M-J. Metabolic and Microbial Modulation of the Large Intestine Ecosystem by Non-Absorbed Diet Phenolic Compounds: A Review. Molecules. 2015;20:17429–68.
59. De Paula JA, Carmuega E, Weill R. 2008. Effect of the ingestion of a symbiotic yogurt on the bowel habits of women with functional constipation. Acta Gastroenterol Latinoam. 2008;38:16–25.
60. Yang YX, He M, Hu G, Wei J, Pages P, Yang XH, Bourdu-Naturel S. Effect of a fermented milk containing Bifidobacterium lactis DN-173010 on Chinese constipated women. World J Gastroenterol. 2008;14:6237-6243.
61. Guyonnet D, Schlumberger A, Mhamdi L, Jakob S, Chassany O. Fermented milk containing Bifidobacterium lactis DN-173 010 improves gastrointestinal well-being and digestive symptoms in women reporting minor digestive symptoms: a randomised, double-blind, parallel, controlled study. Br J Nutr. 2009;102:1654–1662.
62. Kamm M, Mueller-Lissner S, Talley N, Tack J, Boeckxstaens G, Minushkin O, Kalinin A, Dzieniszewski J, Haeck P, Fordham F, Hugot S, Nault B. Tegaserod for the treatment of chronic constipation: a randomized, double-blind, placebo-controlled multinational study. Am J Gastroenterol. 2005;100:362–72. 63. Camilleri M, Kerstens R, Rykx A, Vandeplassche L. A placebo-controlled trial
of prucalopride for severe chronic constipation. N Eng J Med 2008;358:2344– 2354.
95
efficacy, impact on quality of life, and safety and tolerability of prucalopride in severe chronic constipation – a 12-week, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Aliment Pharmacol Ther. 2009;29:315–328.
65. Tack J, van Outryve M, Beyens G, Kerstens R, Vandeplassche L. Prucalopride (Resolor) in the treatment of severe chronic constipation in patients dissatisfied with laxatives. Gut 2009;58:357–365.
66. Chan AO, Lam KF, Hui WM, Hu WH, Li J, Lai KC, Chan CK, Yuen MF, Lam SK, Wong BC. Validated questionnaire on diagnosis and symptom severity for functional constipation in the Chinese population. Aliment Pharmacol Ther. 2005;22:483-8.
67. Frank L, Kleinman L, Farup C, Taylor L, Miner P Jr. Psychometric validation of a constipation symptom assessment questionnaire. Scand J Gastroenterol. 1999;34:870-7.
68. Marquis P, Loge CDL, Dubois D, McDermott A, Chassany O. Development and validation of the Patient Assessment of Constipation Quality of Life questionnaire. Scand J Gastroenterol. 2005;40:540–51.
69. Seymour CA, Chadwick VS, Liver and gastrointestinal function in pregnancy. Postgraduate Med J. 1979;55:343–352.
70. Gjerdingen DK, Froberg DG, Chaloner KM, McGovern PM. Changes in women’s physical health during the first postpartum year. Arch Fam Med. 1993;2:277–83.
71. Marshall K, Thompson KA, Walsh DM, Baxter GD. Incidence of urinary incontinence and constipation during pregnancy and postpartum: survey of current findings at the Rotunda Lying-in Hospital. BJOG 1998;105:400–402. 72. Saurel‐Cubizolles MJ, Romito P, Lelong N, Ancel PY. Women’s health after
childbirth: a longitudinal study in France and Italy. BJOG. 2000;107:1202–9. 73. Bradley CS, Kennedy CM, Turcea AM, Rao SSC, Nygaard IE. Constipation
in pregnancy: prevalence, symptoms, and risk factors. Obstet Gynecol. 2007;110:1351–1357.
74. Cullen G, O’Donoghue D. Constipation and pregnancy. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2007;21:807–818.
75. Derbyshire EJ, Davies J, Detmar P, Changes in Bowel Function: Pregnancy and the Puerperium. Dig Dis Sci. 2007;52:324–328.
76. Saha S, Manlolo J, McGowan CE, Reinert S, Esposti SD. Gastroenterology Consultations in Pregnancy. J Womens Health. 2011;20:359–363.
96
1994;81:946–54.
78. Dennison AR, Paraskevopoulos JA, Kerrigan DD, Shorthouse AJ. New thoughts on the aetiology of haemorrhoids and the development of non-operative methods for their management. Minerva Chir. 1996;51:209–16. 79. Abramowitz L, Sobhani I, Benifla JL, Vuagnat A, Daraï E, Mignon M,
Madelenat P. Anal fissure and thrombosed external hemorrhoids before and after delivery. Dis Colon Rectum. 2002;45:650–5.
80. Avsar AF, Keskin HL. Haemorrhoids during pregnancy. J Obstetrics Gynaecol. 2010;30:231–7.
81. Hibberts F, Schizas A. Assessment and treatment of patients with haemorrhoids. Nurs Stand. 2010;24:51–6.
82. Liu N, Mao L, Sun X, Liu L, Yao P, Chen B. The effect of health and nutrition education intervention on women’s postpartum beliefs and practices: a randomized controlled trial. BMC Public Health. 2009;9:45.
83. Derbyshire E, Davies J, Costarelli V, Dettmar P. Diet, physical inactivity and the prevalence of constipation throughout and after pregnancy. Matern Child Nutr. 2006;2:127–34.
84. Wanitschke R, Goerg KJ, Loew D. Differential therapy of constipation - a review. Int J Clin Pharmacol Ther. 2003;41:14–21.
85. Tack J, Müller‐Lissner S, Stanghellini V, Boeckxstaens G, Kamm MA, Simren M, Galmiche JP, Fried M. Diagnosis and treatment of chronic constipation – a European perspective. Neurogastroenterol Motil. 2011;23:697-710.
86. Trottier M, Erebara A, Bozzo P. Treating constipation during pregnancy. Can Fam Physician. 2012;58:836-8
87. Shelton MG. Standardized senna in the management of constipation in the puerperium: A clinical trial. S Afr Med J. 1980;57:78–80.
88. O’Boyle AL, O’Boyle JD, Magann EF, Rieg TS, Morrison JC, Davis GD. Anorectal symptoms in pregnancy and the postpartum period. J Reprod Med. 2008;53:151–4.
89. LeBlanc A, Schneider V, Shackelford L, West S, Oganov V, Bakulin A, Voronin L. Bone mineral and lean tissue loss after long duration space flight. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2000;1:157-60.
90. Konstantinova IV, Rykova MP, Lesnyak AT, Antropova EA. Immune changes during long-duration missions. J Leukoc Biol. 1993;54:189–201.
97
2008;63:697–705.
92. Crucian BE, Stowe RP, Pierson DL, Sams CF. Immune system dysregulation following short- vs long-duration spaceflight. Aviat Space Environ Med. 2008;79:835–43.
93. Guéguinou N, Huin‐Schohn C, Bascove M, Bueb J-L, Tschirhart E, Legrand‐ Frossi C, Frippiat JP. Could spaceflight-associated immune system weakening preclude the expansion of human presence beyond Earth’s orbit? J Leukoc Biol. 2009;86:1027–38.
94. Stowe RP, Sams CF, Pierson DL. Adrenocortical and immune responses following short- and long-duration spaceflight. Aviat Space Environ Med. 2011;82:627–34.
95. Crucian BE, Zwart SR, Mehta S, Uchakin P, Quiriarte HD, Pierson D, Sams CF, Smith SM. Plasma cytokine concentrations indicate that in vivo hormonal regulation of immunity is altered during long-duration spaceflight. J Interferon Cytokine Res. 2014;34:778-86.
96. Nagamatsu A, Masukawa M, Kamigaichi S. Development of the space radiation dosimetry system ‛PADLES'. KEK Proc. 2006;2006-7:26-36.
97. Tawara H, Masukawa M, Nagamatsu A, Kitajo K, Kumagai H, Yasuda N. Measurement of a linear energy transfer distribution with antioxidant doped CR-39 correcting for the dip angle dependence of track formation sensitivity. Jpn J Appl Phys. 2008;47:7324–7.
98. Nagamatsu A, Murakami K, Araki S, Kumagai H, Kitajo K, Tawara H. Space radiation dosimetry in low earth orbit by a passive and integrating dosimeter - ‛PADLES'. KEK Proc. 2008;2008-14:167-77.
99. Nagamatsu A, Murakami K, Yokota A, Yamazaki J, Yamauchi M, Kitajo K, Kumagai H, Tawara H. Space radiation damage to HDTV camera CCDs onboard the international space station. Radiation Measurements. 2011;46:205–12.
100. Tawara H, Masukawa M, Nagamatsu A, Kitajo K, Kumagai H, Yasuda N. Characteristics of Mg2SiO4:Tb (TLD-MSO-S) relevant for space radiation dosimetry. Radiation Measurements. 2011;46:709–16.
101. Matsuki T, Watanabe K, Fujimoto J, Kado Y, Takada T, Matsumoto K, Tanaka R. Quantitative PCR with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of human intestinal bifidobacteria. Appl Environ Microbiol. 2004;70:167–73.
strain-98
specific primers derived from randomly amplified polymorphic DNA. Int J Food Microbiol. 2008;126:210-5.
103. Akopyanz N, Bukanov NO, Westblom TU, Kresovich S, Berg DE. DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori detected by PCR-based RAPD fingerprinting. Nucleic Acids Res. 1992;20:5137–42.
104. Endo A, Okada S. Oenococcus kitaharae sp. nov., a acidophilic and non-malolactic-fermenting oenococcus isolated from a composting distilled shochu residue. Int J Syst Evol Microbiol. 2006;56:2345-8.
105. Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009;25:2078–9.
106. Yasuda E, Serata M, Sako T. Suppressive effect on activation of macrophages by Lactobacillus casei strain Shirota genes determining the synthesis of cell wall-associated polysaccharides. Appl Environ Microbiol. 2008;74:4746-55. 107. Wakayama S, Kamada Y, Yamanaka K, Kohda T, Suzuki H, Shimazu T, Tada
MN, Osada I, Nagamatsu A, Kamimura S, Nagatomo H, Mizutani E, Ishino F, Yano S, Wakayama T. Healthy offspring from freeze-dried mouse spermatozoa held on the International Space Station for 9 months. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114:5988–93.
108. Thirsk R, Kuipers A, Mukai C, Williams D. The space-flight environment: the International Space Station and beyond. CMAJ. 2009;180:1216–20.
109. Reale M, Boscolo P, Bellante V, Tarantelli C, Nicola MD, Forcella L, Li Q, Morimoto K, Muraro R. Daily intake of Lactobacillus casei Shirota increases natural killer cell activity in smokers. Br J of Nutr. 2012;108:308–14.
110. Fajardo-Cavazos P, Nicholson WL. Cultivation of Staphylococcus epidermidis in the human spaceflight environment leads to alterations in the frequency and spectrum of spontaneous rifampicin-resistance mutations in the rpoB gene. Front Microbiol. 2016;7:999.
111. Moeller R, Reitz G, Nicholson, the PROTECT Team, Wayne L, Horneck G. Mutagenesis in Bacterial Spores Exposed to Space and Simulated Martian Conditions: Data from the EXPOSE-E Spaceflight Experiment PROTECT. Astrobiology. 2012;12:457–68.
