皮膚表皮におけるEnolase-1の機能解析

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皮膚表皮における Enolase-1 の機能解析

東ヶ崎健

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3 略語一覧

本学位論文で使用した略語を以下に示す AD; Atopic dermatitis

BCA; Bicinchoninic acid BSA; Bovine serum albumin

DAPI; 4',6-diamidino-2-phenylindole

DMEM; Dalbecco’s modified eagle medium EASI; Eczema Area and Severity Index EDTA; Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA; Enzyme linked immune solvent assay HRP; Horseradish peroxidase

Ig; Immunoglobulin

LDH; lactate dehydrogenase NIH; National Institutes of health

NHEK; Normal human epidermal keratinocytes PBS; Phosphate-buffered saline

PBST; Phosphate-buffered saline with tween 20 PDVF; PolyVinylidene DiFluoride PL; Plasmin PLG; Plasminogen RIPA; Radioimmunoprecipitation SC; Stratum Corneum S.D.; standard deviation SDS; Sodium Dodecyl Sulfate S/N; signal-noise ratio

SCORAD; Scoring of Atopic Dermatitis TEWL; trans-epidermal water loss

TARC; thymus and activation-regulated chemokine TJ; Tight junction

TMB; 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine tPA; Plasminogen activator

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7 第１章角層中 ENO1 の ELISA による定量方法の確立第１節序論本研究では、ヒト角層中に高発現となる原因、さらに ENO1 量と皮膚状態との関係性について調べることを目的として行った。ヒト皮膚は、一般に、性別、年齢、部位などの要因に加え、紫外線や温湿度などの外的要因により変化するため、ENO1 の発現量もこれらの要因により影響を受けることが予想された。このことから、多数の検体を複数回、長期にわたって安定的に定量する方法が必要と考え、過去の報告で行われていた immuno bloting 法による方法ではなく、 Sandwich ELISA 法による定量方法を新規に確立することとした。第２節実験方法１－２－１ ELISA 法確立の際に検討した試薬と検討の流れ Sandwich ELISA 法の確立の際に検討した固相化抗体、検出抗体、検量線用精製タンパク抗原およびタンパク希釈液（角層中タンパク抽出液）を Table 1-1 に示す。抗体 7 種類に対して、それぞれ固相化抗体、検出抗体として 49 通りの組み合わせに、2 種類の検量線用精製タンパク抗原(Table 1-2)、2 種類のタンパク希釈液(Table 1-3)をそれぞれ掛け合わせ合計 196 通りの組み合わせについて、検討を行った。まず、抗原濃度 30ng/mL と Blank として希釈 Buffer のみを各組み合わせに反応させて、Blank と抗原を添加した際の吸光差の大きい組み合わせを選定した。さらに、選定された組み合わせに対し、濃度依存的な反応性を確認するため、0.47～30ng/mL の精製タンパク抗原および希釈液のみ（Blank）を反応させるとともに、角層の抽出液を反応させて、検量線内に検体の吸光度が納まり、定量可能か確認を行った。さらに、反応特異性の確認を行うため、Western Blotting の検出値との相関性、アトピー性患者で高値となるか確認を行った。 Table 1-1 固相化または検出抗体一覧 No. 抗体製品名,製品番号製造社名

#1 Rabbit polyclonal Antibody (H-300),#sc15343

SantaCruz 社

#2 Mouse monoclonal antibody (9E4), #H00002023-M10

Abnova 社

#3 Rabbit polyclonal Antibody, #ARP34374 Aviva system biology 社 #4 Rabbit polyclonal Antibody,

NB100-65252

Novus Biologicals 社

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8 NBP1-42645

#6 Mouse monoclonal antibody (37E4), NBP-1-47595

#7 Mouse monoclonal antibody (8G8), NBP1-69787

Table 1-2 検量線用精製タンパク抗原一覧

No. 抗体製品名,製品番号製造社名

A α-Enolase recombinant protein, #ab89248

Abnova 社

B α-Enolase recombinant protein, #α-Enolase(1-434)

ACR 社

Table 1-3 タンパク希釈用 Buffer 一覧

No. Buffer 名製造社名

A T-PER buffer Thermo Fisher Scientific 社 B RIPA buffer Thermo Fisher Scientific 社

１－２－２角層採取法および角層タンパクの抽出角層の採取には、2.4cm 四方の角層チェッカー（アサヒプリテック社）を用いてテープストリッピング法により、頬部の角層を採取した(Fig. 1-1)。採取の際には、メークや化粧品などによる角層中 ENO1 の定量性への影響を抑えるため、採取前にメークを落とし、洗顔を行った後に、十分に水分を拭き取り、角層の採取を行った。角層を採取した角層チェッカーは、あらかじめ 500mL の Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) buffer（Thermo Fisher Scientific 社）または Radioimmunoprecipitation (RIPA) buffer（Thermo Fisher Scientific 社）と、9mm のガラスビーズを入れた 2mL のエッペンチューブに入れて、ガラスビーズ破砕機（TOMY 社）により、4℃で冷却しながら、4600rpm で 3 分間振盪破砕させて角層細胞中のタンパク質を溶媒中に抽出した。尚、被験者間の角層中 ENO1 量を比較する際には、角層チェッカーにより採取された角層量の誤差を補正するため、Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Thermo Fisher Scientific 社)を用いて総タンパク量を定量し、総タンパク量 1µg 当たりの ENO1 量により比較を行った。

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ELISA 反応は、96 well plate(IWAKI 社)を用いて行った。固相化抗体を 96 well plate へ結合させるため、Phosphate-buffered saline (PBS)に固相化抗体を 2ug/mL の濃度で希釈し、100μL/well 添加し、25℃ で 1 晩インキュベートした。次に、Blocking 処理を行うため、StartingBlock™ (PBS) Blocking Buffer (Thermo Fisher Scientific 社)を 200μL/ Well 添加し、添加直後に後述の wash を行った。さらに、精製タンパク抗原または角層タンパクの抽出液を 100μ L/well 添加し、抗原と固相化抗体との結合反応を行うため 37℃で 2 時間インキュベートした。抗原の残液を洗浄後、あらかじめ Biotin Labeling Kit-NH2

（同仁化学研究所）を用いてビオチン標識化された検出抗体を 1ug/mL となるよう StartingBlock™ (PBS) Blocking Buffer で希釈した後、96 Well plate に 100μL/well 添加し、抗原と検出抗体の結合反応を 37℃で 1.5 時間インキュベートして反応させた。その後、Streptavidin-Horseradish peroxidase (HRP)（R&D 社）を Reagent Diluent（R&D 社）で 100 倍に希釈して、100μL/well 添加し 30 分間 37℃でインキュベートさせた。さらに、3, 3', 5,

5'-tetramethylbenzidine（TMB）基質（Thermo Fisher Scientific 社）を 100 μL/well 添加して酵素反応により発色させ、20 分後に 1N 硫酸(関東化学社) を 100μL/well 添加して酵素反応を停止した。反応停止後、Spectra MAX190 (Molecular Device 社)を用いて 450nm の光波長で各ウェルの吸光度を測定した。尚、反応停止を除く各工程間の wash には 0.05% Tween20/PBS (PBST)(Thermo Fisher Scientific 社)を 200μL/well を用いて 3 回の洗浄操作を行った。

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1 次抗体：Anti-ENO1 Mouse monoclonal antibody (abnova 社)、2 次抗体: Anti-Mouse IgG HRP antibody(Invitrogen 社)

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Fig. 1-1 角層を採取する角層チェッカーと頬部の採取方法

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12 第３節実験結果

１－３－１抗体、抗原、希釈液の組み合わせ検討

角層中 ENO1 量の Sandwich ELISA 法のよる定量方法を確立するため、市販の抗体 7 種類を固相化または検出用抗体として 49 通りの組み合わせに対して、2 種の抽出用 Buffer および検量線を作製するための 2 種類の精製タンパク抗原について総当たりに反応性の検討を行った。まず、精製タンパク抗原 30ng/mL に対する反応性を確認し、組み合わせの絞り込みを行った。その結果、RIPA Buffer を希釈液として用いた組み合わせのうち、Table 1-1 の固相化抗体 #2、#3 と検出抗体 #7、Table 1-2 の精製タンパク抗原 A の組み合わせが、Blank との吸光度差が大きかった。一方、RIPA buffer を用いたその他の組み合わせや、T-PER Buffer を希釈液として用いた組み合わせでは、吸光度の差が著しく低かった。精製タンパク抗原 A を用いた全組み合わせの吸光度差を Fig. 1-2 に示す。このことから、希釈液を RIPA Buffer、固相化抗体 #2,#3 の 2 種、検出抗体 #7、精製タンパク抗原 A の組み合わせに絞った。

１－３－２精製タンパクの濃度依存性の確認

１－３－１の項で絞った、RIPA buffer を希釈液とした#2-#7-A、#3-#7-A（固相化抗体-検出抗体-精製タンパク抗原）の組み合わせについて、精製タンパク抗原の濃度依存性の検証を行った。精製タンパク抗原の濃度は、4 倍公比で 4 点（0.47～30ng/mL）、および Blank を加えた合計 5 点で行った。その結果、どちらの組み合わせにおいても 5 回の測定において濃度依存性が認められたが（R = 0.998～1.000; n=5）、低濃度域の検量線の形状に違いがあり、#2-#7 の組み合わせの方が全体的に低濃度でも吸光度差が大きく、また、比較的にアッセイ間差も少なかった（#2-#7-A; CV 値:8%～22%, #3-#7-A; CV 値:14%～31%）（Fig. 1-3）。

１－３－３角層中 ENO1 量の定量

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15 Fig. 1-3 ENO1 の精製タンパク抗原による濃度依存性グラフ #2-#7,#3-#7 の組み合わせによる、精製タンパク抗原を用いた濃度依存性のグラフを示す。値は、Blank との吸光度差を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 O .D . ( 450n m )

ENO1 recombinant protein Conc. (ng/mL)

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Fig. 1-5 ELISA 法と Western blotting 法による角層中 ENO1 量の相関性

8 名の角層中 ENO 量を ELISA 法により測定した値（pg/ ug protein）と Western Blotting 法による検出値との相関グラフを示す。 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 5000 10000 15000 20000 In te n si ty of w es tern bl o ti ng

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Fig. 1-6 健常者とアトピー性皮膚炎患者の角層中 ENO1 量の比較

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１－１－２の項で示した方法と同様、テープストリッピング法により、各部位の角層を採取し、角層中のタンパクを RIPA Buffer により抽出した。角層中 ENO 量は、第 1 章で確立した sandwich ELISA 法を用いて、前述の１－１－３の項に従って定量した。また、BCA protein assay kit を用いて、抽出した角層タンパク抽出液の総タンパク量を定量し、採取した角層量の誤差を補正するため、被験者間の角層中 ENO1 量を比較する際には、総タンパク量 1µg 当たりの ENO1 量により比較を行った。

２－２－３角層水分量と TEWL の測定

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Fig. 2-1 角層細胞の形態評価スコアの評価基準

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27 Fig. 2-2 角層中 ENO1 量の性差

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29 Fig. 2-4 35 名の角層中 ENO1 量の日差変動

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30 Fig. 2-5 角層中 ENO1 量と年齢との関係

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Fig. 2-6 角層中 ENO1 量と皮膚バリア指標との相関解析グラフ左角層中 ENO1 量と TEWL の相関解析グラフ

右角層中 ENO1 量と角層水分量（water content）の相関解析グラフ

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Fig. 2-7 角層中 ENO1 量と角層の形態的特徴の相関解析

左角層中 ENO1 量と重層剥離度 (desquamative state of SC)との相関グラフ中央角層中 ENO1 量と細胞面積 (the corneocyte area)との相関グラフ右角層中 ENO1 量と有核細胞率 (rate of nucleated corneocytes)との相関グ

ラフ

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36 Fig. 3-1 ヒト腹部皮膚における ENO1 の局在

健常女性ヒト腹部皮膚の免疫蛍光染色の写真。写真はいずれも、角層側を上面に示し、表皮と真皮が観察されている。

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37 Fig. 3-2 角化による ENO1 量の変化

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39 第４章皮膚バリア機能との関係解析第１節序論本論文第２章において、角層中 ENO1 量が皮膚バリア機能と関係する可能性が示唆された。ENO1 は、細胞内において解糖系酵素として知られる他、細胞の成長制御、低酸素耐性能、アレルギー反応などの様々な生理的プロセスに関係していることが知られている[47-52]。特に、ENO1 は、癌細胞や活性化された免疫細胞の細胞膜に発現し、Plasminogen receptor として機能し、細胞膜における Plasmin の働きを促進することが報告されている[53-57]。Plasmin は、セリンプロテアーゼの 1 種で、細胞外マトリクスおよびタイトジャンクションを分解することが知られている。皮膚では、創傷治癒時に表皮基底層において細胞分裂や細胞遊走を促し、表皮構造の再構成に重要な働きをすると考えられている [72]。一方、アトピー性皮膚炎患者の皮膚表面には Plasmin が高発現しており、 TJｓの破壊を伴うバリア機能の低下に関わる可能性が示唆されている [73]。これらのことから、アトピー性皮膚炎の皮膚表面に高発現した ENO1 は、

Plasminogen receptor として機能し、Plasmin 活性を上昇させて皮膚バリア機能を低下させる可能性が考えられる。そこで、本研究ではヒト表皮ケラチノサイトに ENO1 を過剰発現させ、TJ を構成するタンパク質の発現量、バリア機能の指標である Trans-epithelial electrical resistance (TEER)値、細胞間接着状態の蛍光観察を行った。次に、表皮ケラチノサイトにおいても Plasminogen receptor として機能するか、ENO1 と Plasminogen の共染色により観察し、 Plasmin が細胞接着を破壊するか、plsaminogen 添加時の細胞の様子をタイムラプス観察した。さらに、ENO1-Plasminogen 結合阻害剤であるトラネキサム酸を ENO1 高発現のケラチノサイトに添加し、TJ の構成タンパクの発現量、バリア機能の評価を行い、ENO1 によるバリア機能への影響が、Plasmin を介しているか調べた。第２節実験方法４－２－１細胞培養

Normal human epidermal keratinocytes (NHEK)細胞 (Lonza 社) を EpiLife® Medium (Life Technologies 社)を用いて培養を行った。細胞継代時には、0.01% トリプシン/ 0.004% Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)により NHEK 細胞の接着を剥離させた。また、分化促進の際には、3mM の CaCl2を Humedia-KG2

additive set (Kurabo 社)に添加し、これを培地として用いて培養を行った。

４－２－２ ENO1 の過剰発現

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(Promega 社)または 3µg の ENO1 plasmid vector(Promega 社)を 1mL の無血清培地 Opti-MEM(Promega 社)中に混合させて、30 分間室温でインキュベートし、 mixture を得た。あらかじめ 6 Well Plate（SUMIRON 社）またはψ3.5mm のガラスボトムディッシュ（corning 社）に 3x105_{cells/well の濃度で播種し、播種 1}

日後の培地を各条件の mixture 1mL に交換した。mixture 添加後、2 時間 37℃・ 5%CO2 下でインキュベートさせた後、培地を EpiLife® Medium に交換し、さらに 37℃・5% CO2下で各試験による条件でインキュベートした。

４－２－３ ENO1 阻害剤、トラネキサム酸添加実験

ENO1 阻害剤または ENO1-PLG 結合阻害剤のヒト表皮ケラチノサイトへの効果を評価するため、10μg/ mL の Anti-ENO-1 Mouse monoclonal 抗体（Abnova 社）、比較対象として 10μg/ mL の Anti-Mouse-IgG 抗体（BD Biosciences 社）の存在下または非存在下で NHEK 細胞を 37℃・5% CO2下で 1 時間インキュベートした。また、ENO1 と plasmongen の結合を阻害した際の、ヒト表皮ケラチノサイトのバリア機能の評価を行うため、10mM のトラネキサム酸（Sigma-Aldrich 社）を NHEK 細胞に添加し、37℃・5% CO2下で 1 時間インキュベートした。４－２－４ Western blotting

ENO1 および TJ の発現量を比較するため、Western blotting 法により、各種タンパクの検出を行った。細胞中のタンパクを抽出するため、6 Well plate に播種した NHEK 細胞に遺伝子導入し、導入後 3mM CaCl2を含む培地（４－２－１）

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てβ-actin のシグナル値により各タンパクのシグナル値を補正し、さらに control を 1 とした相対値による解析を行った。

1 次抗体：Anti-ENO1 mono clonal antibody (abnova 社)、Anti-Claudin-1 poly clonal antibody (Abcam 社)、Anti-Claudin-4 poly clonal antibody (Abcam 社)、 Anti-E-Cadherin poly clonal antibody (QED bioscience 社)、 occludin mono clonal antibody (Thermo Fisher Scientific 社) Anti-β-actin mono clonal antibody (SantaCruz Biotechnology 社)。2 次抗体: HRP-Rabbit-IgG (Invitrogen 社)、anti-mouse monoclonal IgG (H + L) (Invitrogen 社)。

４－２－５表皮ケラチノサイトの TEER 値の測定

表皮ケラチノサイトへの ENO1 過剰発現や各種阻害剤のバリア機能への影響を調べるため、TEER 値を指標として、各条件の NHEK 細胞の測定を行った。12 well Trans-well 0.4 μm polyester membrane inserts (Corning 社)に NHEK 細胞を播種し、遺伝子導入後さらに 3mM CaCl2を含む培地（４－２－１）で 2 日間分化

促進培養させた。TEER 値は、Millicell-ERS voltmeter (Millipore 社)を用いて単位面積当たりの電気抵抗値(Ω･cm2)を各 well 当たり 3 回計測し、その平均値を解析に用いた(Fig. 4-1)。

４－２－６細胞免疫染色と蛍光顕微鏡観察

ENO1 を過剰発現させた細胞の TJ の状態や、NHEK 細胞内における ENO1 および Plasminogen の局在を観察するため、免疫蛍光染色を行った。コラーゲンコートされたガラスボトムデッシュ（IWAKI 社）に NHEK 細胞を播種し、遺伝子導入して 2 日後、4%パラフォルムアルデヒド/PBS（関東化学社）で、1 時間 4℃で固定し、さらに StartingBlock™ (PBS) Blocking Buffer を用いて 30 分室温でブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、各 NHEK 細胞に後述の 1 次抗体を StartingBlock™ (PBS) Blocking Buffer 中に 500 倍で希釈して添加し、3 時間室温で静置後、残存した 1 次抗体を 0.1% PBST で洗浄除去し、蛍光標識のため後述の 2 次抗体および細胞核染色用の DAPI(同仁化学社)を StartingBlock™ (PBS) Blocking Buffer 中にそれぞれ 1000 倍、5000 倍で希釈して添加し、1 時間室温で静置し蛍光ラベル標識した。蛍光観察には、走査型共焦点レーザー顕微鏡 FV-1000（Olympus 社）を用い、60x 油浸対物レンズ（開口数 1.4）により撮像を行った。

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42 ４－２－７ Plasminogen 添加時の細胞膜のタイムラプスイメージング解析 Plasmin によるヒト表皮ケラチノサイトの細胞膜への影響を調べるため、NHEK 細胞への Plasminogen 添加実験を行った。コラーゲンコートされたガラスボトムデッシュ（IWAKI 社）に NHEK 細胞を播種し、コンフルエントに増殖したことを確認した後、3mM CaCl2を含む培地（４－２－１）で 2 日間分化促進培養を行

った。分化促進させた NHEK 細胞の細胞膜を Cell-Mask (Thermo Fisher

Scientific 社)を用いてそれぞれ生細胞蛍光染色し、顕微鏡下で観察しながら、 Plasminogen の精製タンパク(和光純薬工業株式会社)を終濃度 10 μg/ml となるように添加し、細胞間接着の様子を観察した。観察には、走査型共焦点レーザー顕微鏡 FV-1000（Olympus 社）を用い、60x 油浸対物レンズ（開口数 1.4）により、20 seconds/flame の速度で 20 分間撮像を行った。４－２－８統計解析統計解析は、2 群間の比較検定は、スチューデントの t 検定、多群間の比較検定はウィルコクソンのサインランク検定にて行った。相関解析は、Pearson の相関解析法により検定を行った。全ての統計解析は、BellCurve for Excel ver.7.0 （ソーシャルサーベイリサーチインフォメーション株式会社）で実施し、p 値が 0.05 未満を統計学的に有意であると判断し*_{P < 0.05、}** _{P < 0.01、}***_{P < 0.001}

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44 第３節実験結果４－３－１ NHEK 細胞の ENO1 過剰発現によるバリア破壊ヒト表皮ケラチノサイトにおける ENO1 発現量と皮膚バリア機能の関係を明らかにするため、NHEK 細胞への ENO1 の過剰発現を行い、TJ の構成タンパクの発現量、TEER 値、細胞接着状態の観察を行った。まず、NHEK 細胞にリポフェクション法により ENO1 の過剰発現ベクターを遺伝子導入したところ、NHEK 細胞での ENO1 発現が有意に増加したことを確認した（vs control: p = 0.005, vs control vector: p = 0.002）。次に、ENO1 過剰発現させた NHEK 細胞を分化促進させた後、抗 ENO1 IgG または比較対象として Mouse IgG 抗体の存在・非存在下における NHEK 細胞の claudin-4、E-Cadherin、tricellulin および ocludin の発現量を Western blotting 法により検出した。その結果、NHEK 細胞における claudin-4、 E-cadherin、tricellulin、occludin-1 の発現量は、ENO1 の過剰発現によって有意に減少した（claudin-4 p = 0.023、E-cadherin: p = 0.032、tricellulin: p = 0.007、occludin-1: p < 0.001 いずれも control vector を導入した NHEK 細胞との比較）。さらに、ENO1 過剰発現による claudin-4、E-cadherin、 tricellulin、occludin の減少は、10μg/ mL の Anti-ENO-1 Mouse monoclonal 抗体の添加によって抑制されたが（claudin-4 p = 0.044、E-cadherin: p = 0.018、tricellulin: p = 0.007、occludin-1: p = 0.028）、コントロールとした 10μg/ mL の Anti-Mouse-IgG 抗体を添加した際には抑制されなかった（Fig. 4-1）。また、これらの条件下における NHEK 細胞の TEER 値を測定した。ENO1 を過剰発現させた NHEK 細胞では、Control ベクターを導入した NHEK 細胞に比べて TEER 値が低下したが（p = 0.008）、10μg/ mL の Anti-ENO-1 Mouse monoclonal 抗体の添加により、TEER 値の減少は抑制され（P = 0.041）、Control ベクターを導入した NHEK 細胞の TEER 値と同程度であった。一方、Anti-Mouse-IgG 抗体を添加した NHEK 細胞の TEER 値は、抑制されなかった（Fig. 4-2）。さらに、 ENO1 を過剰発現させた NHEK 細胞の細胞間接着の状態を免疫蛍光染色で観察したところ、細胞間隙が多く観察された(Fig. 4-3)。

４－３－２ NHEK 細胞における ENO1 と Plasminogen の局在性と Plasmin による細胞間接着への影響

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Fig.4-1 ENO1 を過剰発現した際の TJ 構成タンパクの発現量

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47 Fig. 4-2 ENO1 を過剰発現した際の TEER 値

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48 Fig. 4-3 NHEK 細胞の細胞間接着の状態

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Fig. 4-4 NHEK 細胞の ENO1、Plasminogen および細胞核の 3 重免疫蛍光染色像左 Plasminogen と細胞核の Merge 画像

中央 ENO1 と細胞核の Merge 画像右 3 重蛍光染色の Merge 画像。

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Fig. 4-5 Plasmin 添加前後の細胞間隙のタイムラプス画像

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Fig. 4-6 トラネキサム酸添加時の TJ の構成タンパクの発現量

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52 Fig. 4-7 PlasminTEER 値

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53 第４節考察

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Fig. 4-8 皮膚中 ENO1 と皮膚バリア機能との関係のモデル模式図

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56 総括アトピー性皮膚炎は、再発性の慢性疾患であり、病変部では皮膚の炎症に伴い、かゆみが増し、掻破の刺激などによって、皮膚バリア機能の低下や被刺激性の亢進、湿疹がますます悪化する負のスパイラルを生じうる。このことから、アトピー性皮膚炎の発症を早期の段階で抑え、予防することが、疾患をコントロールする上で重要である。しかし、アトピー性皮膚炎の発症のメカニズムは、非常に複雑であり依然として解明されていない。個々で臨床的特徴は異なり、最善の治療法を選択するための診断には困難が伴う。これらの背景から、多様な皮膚状態（特に発症前、初期段階の皮膚状態）を客観的かつ正確に評価する指標を確立することは、重要な課題といえる。近年、角層細胞中のタンパク質をバイオマーカーとして評価する新たな皮膚評価法が開発されている[44,45]。角層細胞は、テープストリッピング法により非侵襲的かつ局所的に採取可能である。本研究では、アトピー性皮膚炎患者の角層中に多く含まれる ENO1 について、皮膚状態との関係、皮膚における発現分布、表皮細胞における機能について調べ、アトピー性皮膚炎や皮膚状態を評価する新たなバイオマーカーとしての可能性や、アトピー性皮膚炎の治療の新たな標的としての可能性について検討を行った[46]。第 1 章では、角層中 ENO1 量について、多検体を安定的かつ特異的に定量する方法として、Sandwich ELISA 法を検討した。固相化および検出抗体、検量線用精製タンパク抗原、希釈および抽出液について、196 通りの組み合わせの中から選定し、角層中 ENO1 量を定量可能な Sandwich ELISA 法を確立した。本方法においてもアトピー性皮膚炎と健常者は、有意に異なることが示され、さらに、その違いを定量的に算出することを可能とした。また、本方法では、アトピー性皮膚炎と健常者の比較だけではなく、健常な皮膚における日常の変化も検出可能な定量精度を有していることが示され、アトピー性皮膚炎を発症前の状態でも評価できる可能性があると考えられた。

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59 引用文献

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