ヒトゲノム解析がほぼ終了した 21 世紀において， ポストゲノム時代の網羅的解析手法として，プロテオ ーム解析，プロテオミクスが注目されています。ヒト ゲノム解析は多くの疾病の病態解明に貢献し，医学の 発展に寄与しました。しかし，遺伝子は蛋白質に翻訳 されてはじめて機能すること，翻訳後の蛋白質修飾が その機能に重大な影響を与えることを考えると，蛋白 質を抜きにした DNA 解析だけで病態を十分に理解す ることは不可能です。プロテオームとは細胞内の全タ ンパク質を意味しており，細胞内の全遺伝子を意味す るゲノムに対して作られた言葉です。一方，プロテオ ミクスとはゲノミクスに対応した言葉で，系統的にか つ網羅的にタンパク質を扱う技術，方法論です。 プロテオーム解析の全体の流れは，サンプル中の全 タンパクを二次元電気泳動によって展開し，タンパク 質のスポットを切り出し，トリプシン等のプロテアー ゼを用いてタンパク質を消化し，消化されたペプチド 断片の分子量を質量分析計で測定し，遺伝子バンクの データに照らし合わせてそのタンパク質を同定するこ とです。2 つの異なったサンプル，例えば目的とする 生物学的状態にある細胞や組織とそれに対するコント ロールのタンパク質の発現量の差異を解析する場合， これまではそれぞれのサンプルを異なった二次元電気 泳動ゲルに展開し，銀染色や Sypro Ruby 染色で染め て，これらを比較する，という手法がとられていまし た。これに対して平成 15 年度に大学院付属先端医学 研究施設に導入された蛍光標識二次元ディファレンス ゲ ル 電 気 泳 動 解 析 シ ス テ ム （ t w o - d i m e n s i o n a l differential image gel electrophoresis; 2D-DIGE）は 2 つ または 3 つの異なったサンプル中の全タンパク質をそ れぞれ異なった蛍光色素で標識し，1 つの二次元電気 泳動ゲルに展開するという最新の方法です。これによ り，ゲル間で生じるタンパク質の位置や発現強度の誤 差を大きく改善し再現性を高めることが可能となりま した。 本稿では 2D-DIGE を用いたプロテオーム解析のう ち，サンプルの調整から蛍光標識，二次元電気泳動ゲ ルへの展開，およびイメージアナライザー（Typhoon） による解析に関する原理と実験の流れを簡単に紹介し ます。スポットの切り出し，質量分析計（LC/MS/MS） によるタンパク質の同定に関しては次号に掲載予定で すので御参照下さい。 実験で使用する蛍光試薬は Cy2，Cy3，Cy5 の 3 種 類あり，これらを用いてタンパク質を標識します。 例えば，癌組織と正常組織の 2 サンプルで発現して いるタンパク質の違いを比較しようとした場合，癌組 織由来のタンパク質を Cy2 で標識し，正常組織由来 のタンパク質を Cy3 で標識します。最後に内部標準 プロテオミクス研究チーム： 木村健二郎（腎臓高血圧内科），加藤智啓（難病治療研究セ ンター），熊井俊夫（薬理学），安田隆（腎臓高血圧内科）， 岡本一起（生化学），大谷（金子）律子（解剖学），長田賢一 （神経精神科），堤康一郎（耳鼻咽喉科），小泉宏隆（病理学）， 太田智彦（乳腺内分泌外科），西川裕之（大学院付属先端医 学研究施設）
蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析システム（2D-DIGE）
を用いたプロテオミクス
西川 裕之 太田 智彦
として癌組織，正常組織，両方のタンパク質を等量ず つ混ぜ合わせ Cy5 で標識します。この標識された 3 つのサンプルを 1 つにまとめてこれを二次元展開しま す。1 次元目は等電点電気泳動，2 次元目は SDS-PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis）です。展開
されたゲルをイメージアナライザー Typhoon の蛍光 スキャナーモードで読みとるわけですが各蛍光試薬は 励起光が異なるので 1 枚のゲルに泳動出来るわけです （ . 1）。往来の二次元電気泳動法だとこれには 3 枚の ゲルが必要となり，ゲルのゆがみ等で正確なタンパク 質スポットの比較が出来ませんでした。しかし，2D DIGE システムだと全ての行程を同一条件で行うため サンプル間の誤差がほとんど無くなります。 プロテオーム解析の全体の流れとしては 2D-DIGE で変動のあるタンパク質スポットを検知し，質量分析 計でそれが何であるかを同定する，というものになり ます（ . 2）。このうち 2D-DIGE による変動のあるタ ンパク質スポットの検知には，サンプルの調製，蛍光 . 1 2D-DIGE の原理 (A) サンプルはそれぞれ、励起光の違う蛍光試薬で標識され 1 枚 の二次元電気泳動ゲルに展開されます。その後、蛍光スキャ ナーにて読み取られ各励起光ごとに PC 上でゲルイメージフ ァイルが作成されます。1 枚のゲルに全てのサンプルを同時 に泳動するため、これまでの二次元電気泳動での課題であっ たゲル間の再現性、均一性が保たれます。 (B) ゲルイメージ画像の例。T47D 細胞（乳癌細胞）をタキソテー ル処理する前後でのタンパク質の変化。左上：Cy2 標識した タンパク質（タキソテール処理前）。右上：Cy3 標識したタン パク質（タキソテール処理後）左下：タキソテール処理前後 のタンパク質を等量ずつ混合し、Cy5 で標識。右下：3 を統 合（Overlay）した画像。1 枚のゲルからこれらのゲルイメー ジが得られます。矢印はタキソテール処理後に減少したタン パク質。 . 2 実験の流れ 左列はディファレンシャル二次元電気泳動により変動のあるタ ンパク質スポットを探索する実験系。右列はタンパク質スポット を質量分析計で同定する実験系。Step6 の二次元電気泳動は Step1 で調製したサンプルのタンパク濃度を 500 ug に上げて二次元電 気泳動で分離します。Step7 の SYPRO Ruby 染色は分離した全タ ンパク質を可視化し質量分析の影響を与えない染色法です。
ゲルイメージの解析方法までを解説します。 A 細胞や組織などのサンプルを溶解してタンパク質を 取り出します。重要なポイントは，最終的に溶解物が pH8 ∼ 9 になることです。最適なpHになっていない と次項の蛍光標識効率が落ちてしまいます。 1 . 細胞を遠心分離し，ペレットにします。 2 . PBS（phosphate buffered saline）で洗浄します。 3 . 1 ml の細胞溶解バッファー（30mM Tris --pH 未調
整，2M Thiourea，7M Urea，4 % CHAPS）で細胞を 懸濁し，10 分ほど氷上で静置。その後，超音波破 砕して細胞を溶解します。 4 . 細胞溶解物を 4 ℃，12000 g にて 10 分間遠心した 後，上清（タンパク質抽出液）を新しいチューブへ 移します。 5 . pH 試験紙にて pH 8 ∼ 9 であることを確認します。 6 . ブラッドフォード法にてタンパク質濃度を測定し ます。 B 蛍光標識試薬（Cy2，Cy3，Cy5）を用いて溶出させ たタンパク質を蛍光標識します。標識反応はタンパク 質 50 ug に対して標識試薬 400 pmol でおこないます。 1 . 50 ug 相当のタンパク質サンプルをマイクロチュ ーブに入れます。 2 . 標識試薬 1 ul（400 pmol）をタンパク質サンプル の入ったチューブに入れます。 3 . 暗所で氷上に 30 分置きます。 4 . 10 mM リジンを 1 ul 加えて反応を停止させます。 C /SDS-PAGE 往来の泳動法と同じですが等電点電気泳動では再現 性のある市販の IPG ストリップ（乾燥ゲル）を使用 します。（各メーカーから色々な pH レンジ，長さの ゲルが販売されています）SDS-PAGE は蛍光スキャ に集めます。 2 . 集めたチューブに等量の 2x Sample Buffer（2M Thiourea，7M Urea，2 % Pharmalytes3-10，2 % DTT， 4 % CHAPS）を加えます。
3 . 最終液量が 450 ul になるように膨潤液を加えます。 4 . ストリップフォルダーにチューブの中身を移し
IPG ストリップを上にのせます。
5 . 泡が混入してないか確認し，Drystrip Cover Fluid を滴下し IPG ストリップ全体を覆います。 6 . 等電点電気泳動を開始します（rehydration 12 時間， 500Volts-500Vhrs，1000Volts-1000Vhrs，8000Volts-60000Vhrs）。 7 . 等電点電気泳動が終了したら IPG ストリップを取 り出し SDS 平衡化バッファーA（50mM Tris-HCl pH8.0，6M Urea，30 % Glycerol，2 % SDS，1 % DTT）にいれ 15 分間振盪します。 8 . 続いて SDS 平衡化バッファーB（50mM Tris-HCl pH 8.0，6M Urea，30 % Glycerol，2 % SDS，2.5 % ヨードアセトアミド）にいれ 15 分間振盪します。 9 . IPG ストリップをアクリルアミドゲルの上にのせ 0.5 % ア ガ ロ ー ス で 封 入 し 泳 動 を 開 始 し ま す （600V-400mA-2.5W-30分，600V-400mA-100W-5）。 D 電源のオンは操作の 30 分以上前に行い，機械のウ ォームアップをします。ブルーレーザーモジュール （Cy2 励起光）は別電源となっています。最初に 1000 um ピクセル解像度でプレスキャンを行い条件設定を 行います。適切条件設定が出来てから 100 um ピクセ ル解像度で本スキャンを行います。 1 . スキャニングの 30 分前に Typhoon バリアブルイ メージアナライザーの電源をいれ，次に PC の電源 を入れます。 2 . ゲルをガラス板ごとステージに乗せます。このと きステージのガラスと直接触れないようにアダプタ ーでガラス板を挟んで乗せます。 3 . 読み込みソフトを立ち上げ，各種設定をします。
（ . 3-A） 4 . 読み込みソフトの Setup ボタンをクリックし励起 フィルターとレーザーの設定をします。（ . 3-B） 5 . スキャンを開始します。 E 本実験で最も重要なのが取り込んだゲルイメージの 解 析 で す 。 T y p h o o n （ 蛍 光 ス キ ャ ナ ー ） 附 属 の DeCyder というソフトを使用します。DeCyder は 4 つ のモジュールから構成され（ . 4），蛍光スキャナー で取り込んだゲルイメージからタンパク質スポットの 検出，数値化，スポットのマッチング及びタンパク質 発現解析を行います。今回は 4 モジュールの最初に行 う DIA モジュールの使い方の説明をします。残りの 3 つのモジュールは主に複数枚のゲル（イメージでは 無く実際のゲル）を比較する場合に使用します。
1 . PC から [DyCyder DIA] を立ち上げ [Fail/Create
. 3 Typhoon の設定 (A) 蛍光スキャナー各種パラメーターの設定；1 スキャンエリア 2 蛍光スキャンモード選択 3 蛍光スキャンパラメーターのセ ットアップ 4 トレイ設定 5 スキャン方向の設定 6 サンプ ルプレスの選択 7 フォーカルプレーン（焦点）の設定 8 取 り込みピクセルサイズの設定 9 DIGE ファイルの命名形式の 選択 10 取り込み開始ボタン (B) 励起フィルターとレーザーの設定；Emission Filter リストから 適切な励起フィルターを選択します。最大 4 種類のフィルタ ーが選べます。励起フィルターを選択すると自動的に使用レ ーザーが表示されます。また、励起フィルターとレーザーの 組み合わせを自分で選ぶことも出来ます。 . 4 DyCyder 4 つのモジュール DIA：ゲル内変動解析。タンパク質スポットの検出と同一ゲル由 来のゲルイメージの数値化を行います。 BVA：生物学的変動解析。異なるゲル由来の複数ゲルイメージを マッチングし全体で見られるタンパク質スポットの変動デ ータを統計解析します。 BatchProcessor：ゲルイメージの自動検出や複数のゲルのマッチ ングを行います。 XML Toolbox：DyCyder で作成したファイルからデータを抽出し ます。 . 5 DyCyder DIA 画面 Image View：ゲルイメージを表示。 Histogram View：タンパク質スポットをグラフ化して 表示。 3D View：タンパク質スポットを 3D 表示。 Table View：各タンパク質スポットを数値化し一覧表 示。
Workspace] を選択します。
2 . [Type of Detection] ダイアログが出ますので検出す るゲルイメージに合わせて選択します。
3 . 取り込んだゲルイメージを順番に選択します。 4 . ゲ ル イ メ ー ジ の 読 み 込 み が 完 了 し た ら
[Process/Process Gel images] を選択します。
5 . [Process Gel images] ダイアログが出ますので Estimated no. of spots という項目に「2500 ∼ 3000」 を入力してください。OK を選択するとタンパク質 スポットの検出が始まります。 6 . 検出が終わると 4 分割された画面になります（ . 5）。 で確認して下さい。これを Table View で上から下 へ繰り返して行うとある所でタンパク質スポットと 埃等のスポットの境界値が分かります。埃やゴミの スポットを除去します。 8 . Table View から変動のあるタンパク質スポットを 見つけ出して完了です。 2D-DIGE は比較的初心者であっても非常に再現性 のある，信頼できるプロテオーム解析を行い得る画期 的なシステムです。また，これまでのものに比較して きわめて微量なサンプルからも解析を行うことができ ます。大切な点は，いかに適切なコントロールサンプ ルをデザインできるかです。網羅的な解析は，たくさ んのサンプルを集めて多くのタンパク質の変化の多変 量解析から病態のプロファイリングを行う，といった 臨床での有用性がクローズアップされていますが，さ まざまな分子生物学的解析のためのスクリーニングに もきわめて有用です。本稿で述べた 2D-DIGE や質量 分析計（LC/MS/MS）を用いてそれぞれの用途に合わ せたスクリーニング法をデザインすることが可能で す。多くの場合，スクリーニングを出発点とした研究 は，理論から予想される結果を出発点とした研究に比 較して質の高いものです。これらの機器は大学院付属 先端医学研究施設の共同設備ですので是非ご活用下さ い。 . 6 スポットの見極め 上段は埃のスポット。下段はタンパク質スポット。埃のスポット は片が急で尖っています。タンパク質スポットは片が滑らかで柔 らかいカーブを描きます。
