九州大学学術情報リポジトリ
Kyushu University Institutional Repository
水素酸化細菌の培養における溶存水素の挙動と培養 工学的諸特性
武下, 俊宏
Graduate School of Agriculture, Kyushu University
https://doi.org/10.11501/3075451
出版情報：Kyushu University, 1993, 博士（農学）, 課程博士 バージョン：
5-1 緒
第五章 水素供給制限条件下における培養挙動
ー='一 tゴ
A.� utrophu sは炭素源が十分に存在する条件下で， 酸素供給を制限
したり， アンモニアや特定のミネラル成分などの栄養素を制限する と， 菌体内にエネルギー貯蔵物質であるpolyhydroxyalkanoic
acid (PHA)を生産することが知られている1-3). PHAの一種である 3 -ヒドロキシ酪酸の共重合体(PHB;polyhydroxybutyric acid)は，
1926年にLemoigne4lによってすでに発見されていたが， 当時はまだ その 利用は考えられていなか った. しかし， 近年， P H B が生分解性プ
ラスチック素材の原料となることが明ら かになって以来， 菌体を用 いた共重合依の合成や， 共重合体の生合成経路の解明 が活発に行わ れるようになった. 主. e utrophu sのPHB合成に関与している酵素は，
ß -ketothiolase， NADP-dependence acetoacetyl-CoA reductase，
poly( ß -hydroxybutyric acid) synthaseであることがわっかつてお り， これらの遺伝子群はすでにクロ)ニングされ， P H Bの合成経路も
調べられ明らかにされている5). かつて， A. � utrophu sを独立栄養的 に培養し， 炭酸ガスから菌体を生産しこれに含まれるタンパクを食，
飼料として利用使用とする計画が検討されていたが， P HBは菌体タン パクを飼料として利用しようとする際障害となっていた. P HBの利用 法が見つけられたのはほんの最近のことであり， 1 C 1社によって巌初
にその生分解性を利用した生分解性プラスチックへの利用法が開発 された. 現在では1C1などを中心に実用生産として発酵生産 が行われ
企業化されている. しかし， 現在1C1社の行っているPHAの発酵生産 は独立栄養による培養でなく， 糖とプロピオン酸を原料とし， 3-ヒ
ドロキシ酪酸と3-ヒドロキシ吉草酸をヒドロキシアルカン酸の構成 単位とする共重合体を生産している. この際， 用いる炭素源の種類 や比率を変更することによってポリマー中のモノマーの含有率を自 由に変えられることが報告されている6).
一方， 近年大気中炭酸ガス濃度の増加によって引き起こされる温 室効果が地球環境問題のーっとしてクローズアップされているが，
その対策はいろいろなアプローチが提案されている. 著者の所属す る研究室では炭酸ガスの固定化法として， A. � utrophu Sの酸素制限条 件下における培養によって炭酸ガス から生分解生高分子材料として のPHBを発酵生産させることを試み3)， ベンチプラント規模での 発酵 生産に成功している7). ベンチプラントの実験に用いた全容2 1の培 養槽の亜硫酸酸化法による酸素の総括物質移動容量係数の測定の結 果， 運転容積 11， ガス供給速度2 V V 11， 温度30・C， かくはん速度
700 rpmの条件で1470 1fhという値を得た. 同一の培養槽を用いて水 素:炭酸ガス=9: 1の混合気を2VVMで供給し， 酸 素は溶存酸素濃度が
5 kPaとなるように酸素ガスをon-off制御によって供給し， かくはん
速度700 rpmで培養したところ， 24時間の対数増殖で菌体17g/1濃度 に達した. しかしながらその後はミネラルなどの培地成分はまだ十 分存在するもかかわらず， 対数増殖期を維持することがでなかった が， この原因としてガス供給が制限されている可能性が考えられた.
前章で述べたが， 臨界溶存水素圧が臨界溶存酸素庄の3.66倍となっ ていること， 増殖の化学重論から与えられる菌体の水素要求重が酸 素要求量 の3.44倍であること， 気相の水素分圧は酸素分圧 の約3.5倍
必要である. しかし， 菌体の高密度培養を行う場合はガスの供給 が菌依の要求量を満たせなくなる可能性がある. すでに， 酸素供給 が制限された場合のA.e utrophu sの培養特性は， 田中をはじめ多くの 研究者によって明らかにされている3). しかし， 水素の供給が制限 されたときのこの菌の培養特性については水素の物質移動について の解明がされていなかったこともあって全く研究例がない. そこで 本章では， まず独立栄養条件下で水素供給が制限されたときの培養 挙動を調ベ? 酸素制限条件のときとのその違いを明かにした. 次に，
水素供給制限のまま培養が継続したとき， 本菌が何らかの有用物質 を生産するかどうか菌の生理的な変化がどの様に生じるかを明らか にする実験を行った.
5-2 水素供給制限下における基質ガスの消費速度
水素供給制限条件下で培養中の主. e utrophu sの基質ガス消費速度の 測定は以下の操作によって行った. まず， 独立栄養条件下で培養し たA .eutrophu sの培養液を無機培地で希釈し， 8.0 g- DCW/lの菌体 度になるように調製した. この液を今までと同様な全容200 mlの培 養槽に100 ml入れ， 通気かくはんを行い， そのガス消費速度をマス
バランス法で測定した. かくはん速度は1400 rpm， 培養温度は30' C，
通気量は100 ml/minである. 培養槽に供給するガスの組成は， 炭酸 ガス10%， 酸素20%で一定にしておき， 残りの70出の範囲内で水素と窒 素の混合比を70%から0%まで変化させた. 混合気の流量は， 混合気組 成を変更する毎に流量計で確認し， 第一章の表1にしたがって調節 しなおす. 通気かくはんを開始し， レコーダーに記録される溶存水 素電極と溶存酸素電極の出力が一定になった とき， 培養槽入口 と出 口のガス組成をガスクロマトグラフで測定した. ガスクロマトグラ
ブは島津G C - 8 A ， カラムは内径4 mm長さ6 mで， 充填剤には
Molecular sieve 5A とPorapack Qを用いた. Injection port温度は 60・C， カラム温度は50・Cとした. 検出器はTCDで， カレントは60 mA である. キャリアーガスにはアルゴンを用い， 圧力は0.5 kg/c がに 調整した. ガスクロマトグラブの出力はレ コーダーR-I01またはイン テグレーターC-6A Cromatopacに記録した. ガスクロマトグラブの校
正には， 水素， 酸素， 窒素および炭酸ガスの 各ガスボンべから直接 サンプリングしたガスを標準ガスとして 用いた. 使用 した各ガスの 純度は水素， 酸素， 窒素が99.9%， 炭酸ガスが99.5%である.
供給するガス基質中の水素分圧だけを変化させて供給したときの，
溶存水素分圧((PL)H)と溶存酸素分圧(P L )および排気ガス中の水素の 分圧(PH )と酸素の分圧(p)を図5-1に示す. ここで， 排気ガス中の水 素または酸素の分圧と， 水素または酸素の溶存圧の差は物質移動の
推進力を示している. 図5-1に示す様に，溶存水素分圧がほぼOまで がり， 水素の供給が制限され始めると酸素消費速度が抑制され， そ の結果溶存酸素分圧が上昇していくことが観察される. これは， 水 素の供給が制限されて 菌が水素供給制限状態になると， 酸素の消費 速度も低下することを示唆するもの である. そこで， 水素の供給を 制限したときの水素， 酸素， そして炭敵ガスの菌体による消費速度 をマスバランス法で測定し， これら基質ガス 消費速度を溶存水素濃 度(C H )に対してプロ ットしてみた. ここで用いた溶存水素濃度 は，
電極によって 測定した溶存水素分圧の値から， Henryの 法則にしたが って計算した値を用いた. 結果を図5-2に示す. この図のように， 溶 存水素分圧と各基質ガスの菌体による消費速度はMichaelis-Menten
型の関係にあることがわかった. Michaelis-Menten型の式の
Michaelis定数はLinet，.;'eaver-Burkプロ ット， Hanes-Woolfプロ ット，
E何L
‘A・圃�
ω 、ー
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」 E コ
J
3 3
L
苛冊且モ 80
PH
60
40
20
。
H2 pa吋ial pressure in inflow gas [kPa]
図5-1 水素分圧を変化させて供給したときの 排気ガス中の 水素と酸素の分圧((p) Hとp)と培養液中の水素と酸素の溶 存圧((pJHとpJ.
nu nu qζ
{(F主)\一oεE}25
C 0
+-' Q_
� g 100
ぷコ何
CJ) 句
。
300
。
C02 H2
Agitation; 1400 rpm Cell; 8.0 g/I
02
。 0.1 0.2 0.3
Dissolved H2 concentration [mmol/ �
図5-2 溶存水素濃度と菌体による水素， 酸素そして炭酸ガスの吸収速度の関係.
Eadieプロ ット， Cornish-Bowdenプロ ット等の線型化法を用いて求め られる8). このうち相関係数が最も高くなる線型化法はHanes-
Woolfプロ ットであったので， この線形化法を用いてMichaelis定数 を求めた. 図5-2 に示すデータをHanes-Woolfプロ ットすると， 図5-
3に示すように水素， 酸素， 炭酸ガスいずれについても良好な線形関 係が得られた. ここに示すこれらの直線の相関係数は， 水素が
o .999， 酸素がO. 999， 炭酸ガスが1.000である. このプロ ットから Michaelis定数を求め， これらの定数を用いて菌体による水素， 酸素，
炭酸ガスのガス消費速度を表す式を以下に示す. 水素， 酸素， 炭酸 ガスのガス消費速度をそれぞれ(r)H， r， (r)cで表すと，
(r)H=283(C)H/{0.00801+(C)H) (5-1) r=96.7(C)H/{0.00780+(C)H) (5-2) (r)c=42.6(C)H/{0.00494+(C)H) (5-3)
の関係となる. また， これらの事実から， 測定した溶存水素濃度の 範囲内では水素， 酸素， 炭酸ガスいずれの基質消費においても水素 濃度の上昇による阻害の発現， すなわち基質阻害は全く見られない ことが明らか になった. 式(5-1，_3)の最大消費速度を炭酸ガスを基 準にして比較すると水素:酸素:炭酸ガス=6.64:2.27:1の比となった.
この比は菌体の化学重論式に基づくガス要求童の比， すなわち水素 :酸素:炭酸ガス=5.22:1.52:1， よりも水素と酸素の要求量が大き
0.005 0.006
0.004 0.003 0.002 0.001
(￡)庄\{N工}
。
0.3
ガス吸収速度と溶存水素濃度のHanes-Woolf plot.
0.2
Hydrogen concentration [H2] (mmol/I)
0.1
。
図5-3
くなっていることを示している. 酸素が制限された場合の
A . e utrophu sの培養挙動は田中3 )らによって明らかにされている. そ
れによると， この 条件で炭酸ガスからPHBを生産するときは次の化必 重論式にした がうとされている.
33H2 + 1 202 + 4C02 →C4H602 + 30ιo
すなわち， この化学重論式による反応が起こっているときは， 水素 :酸素:炭酸ガス=8.2 5 : 3:1となって， 水素供給制限時の基質ガス消費
速度の比と一致しない. 酸素供給が制限されると乾燥菌体重量と PHB含量が増加するが， このとき菌体タンパク含量はほぼ一定に維持 されており， P HBだけが炭酸ガスから独立栄養的に合成されているも のと考えられている. また， 酸素制限条件下の基質ガス消費速度と 溶存酸素圧と の関係はMichaelis-Menten型の式で表すことはできな かったと報告されている18).
5-3 水素供給制限と菌体内生産物の関係
酸素が制限された条件で， 主. e utrophu sの野生株は菌体内にPHBを 蓄積し， A • � utrophusの変異株はethanol， 1-propanol 2-methyl-l- propanol， D，L-2，3-butanediol， meso時2，3-butanedio]， acetojn，
2-methylpropanoate， 2-methylbutanoate， 3-methylbutanoate，
succinate， formate， acetate， butanoate， 3-hydroxybutanoate，
cis- aconitate， a-oxo-3-methylbutanoate， 2 -oxoglutarat e， そし て分子状水素も生産されたことをD . Vollbr ec htらは報告している
1 1 ) さらに， G.A. Cod dらは主.e utrophu sの変異株を用い， 20匹以い
の酸素分圧のガスを用いた独立栄養培養で， グリコール酸が生産さ れたことを報告している12). このように， 培養の酸素分圧を変化さ
せることでA.eutrophu sに多様な 代謝生産物を生産できることが明ら かにされている. しかしな がら， A. � utrophu sの独立栄養培養におい
て， 水素の供給が制限された条件で菌の増殖や菌体内代謝生産物の 一つであるPHBの蓄積にどの様な影響を与えるかは全く明らかにされ てはいない. そこで以下に述べるように， 水素供給の制限が， 菌体 の増殖とPHBな ど代謝生産物生産にどの様な影響を与えるかを調べた.
菌体成分は菌体総タンパク量 と菌体内PHB含量について測定した.
以下それらの方法を示す. 菌体内PHB含量の定量は， B ran dlらが 用し たメタノリシス法1 3 )を用いた方法に変更を加えて使用した.
1 .培養ブロス1 .0 mlを全容1.5 mlマイクロチュープに入れ， 12000 rpmで10分間遠心分離し， 集菌する. 上澄は捨てる.
2.マイクロチューブに蒸留水1 .0 m lを加え， ボルテックスで再懸濁 した後， 1 2000 rp mで10分間遠心分離し， 集菌する. 上澄は捨てる.
この操作を2 回行い， 菌体洗浄する.
3 .洗浄菌体が入ったマイクロチューブは1050Cのオーブンに ー晩入れ，
菌体を乾燥させる.
4 .乾燥菌俸をマイクロチューブから， 全容5 mlのスクリユーバイア ルに移し， そこへクロロホルム1ml， 3%硫酸(v/v)を含むメタノール
1 mlを加え， テブロンパッキン付きのスクリユーキャップを施した後，
95.Cの恒温槽中に6時間放置する.
5 .スクリユーパイアルをキャップをしたまま- 20・Cの冷凍庫に] 0分間 放置 して冷却後， 蒸留水0.5mlを加え? ボル テックスで十分かくはん
した後， 氷冷水中に放置する.
6 .上層と下層に完全に分離させた後， 下層(油層)の2μ1をガスクロ マトグラフで定量する.
ガスクロマトグラブは島津GC-8Aで検出器はFID である. ガラスカ ラム( 3 m X 4 mm)には， 2% Reopl ex 400を充填して用いた. 水素，
空気， そしてキャリアーガスである窒素の圧力はそれぞれ0.6， 0.5
， 2.0 kg/cm2に調整した. Injection port温度は120・C， カラム温度
は110・C とした. ガスクロマトグラブからの出力はC-6A Cromatopac に記録した. P HBの定量は， 予めD，L-3-ヒドロキシ酪酸ナトリウム (ナ カライテスク製)を用いて作製した検量線を用いて求めた. 図5・
4に本実験で使用したポリ戸ヒドロキシ酪酸(PHB )の検量線を示す.
次にbiuret法1 3 )による菌体内タンパクの定霊法を示す.
1 .培養ブロス1 .0 m 1を全容1 .5 m 1マイクロチューブに入れ， 12000
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図5-4 菌体内PHBの検量線
rpmで10分間遠心分離し， 集菌する. 上澄は捨てる.
2.マイクロチューブに蒸留水1 .0 m 1を加え， ボルテックスで再懸濁 した後， 12000 rpmで10分間遠心分離し， 集菌する. 上澄は捨てる.
この操作を2回行い， 菌体洗浄する.
3 .マイクロチュープに蒸留水0.5 mlを加え， さらに 3 Nの水般化ナト リウム0.5 mlを加えた後， 95' Cの湯浴中に10分間静置 する.
4.室温放置して冷却する.
5.2.5X(w/v)硫酸銅(五水和物)0.5 mlを加え， ボルテックスでよくか くはんした後， 5分間静置する.
6.12000 rpmで10分間遠心分離 する.
7 .上澄の吸光度を波長555 nmで測定する
吸光度計はJASCOのUBIDEC- 320を用いた. 菌体内タンパク重の定量は 予めウシ血清アルブミン(SIGMA製)を用いて作製した検量線を用いて 求めた. 図5-5に本実験で使用した菌体内タンパクの検量線を示す.
水素供給が制限された条件での菌の水素， 酸素， 炭酸ガスの消費 速度の経時変化と， 菌体内代謝生産物の経時変化を以下の方法で調 べた. 菌体濃度11. 3 g/lの培養液100 mlを培養槽に入れ， 通気量10 Oml/min， かくはん速度1400 rpmで培養を行う. はじめ酸素20払 炭 酸ガス10%， 水素70%の混合気を通気して通常の条件で培養し， 途中
から混合気のガス組成を酸素20 X， 炭酸ガス10 X， 水素20%， 窒素50出
3
，...聞h、
\E 0E 3 2
- 4C Gc -3 d o tコ
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5O
L2- 1 a...0
0.00 0.1 0.2 0.3 0.4
Absorbance at
555
nm図5-5 菌体内タンパクの検量線
に変更し世 間じ通気かくはん速度で培養を継続し水素供給制限条件
を形成させた. 水素， 酸素， および炭酸ガスの消費速度は， 水素供
給制限条件に移行して1時間後をゼロ時として以後の変化を測定し
た. 結果を図5-6に示す. 図に示すように水素の供給を制限すると，
水素， 酸素および炭酸ガスの吸収速度は減少した. 次に， 水素制限
条件下に培養が維持された場合の菌体重， 菌体タンパク質量， 菌体
内PHB含量を測定した. 結果を図5-7に示す. このように水素供給が
制限された培養条件下では， 菌体乾燥菌体重量は減少した. 菌体内 部に蓄積されていたPHB童も減少した. 以上の結果， 水素の供給が制
限された場合は， 水素， 酸素および炭酸ガスいずれの基質もその消 費速度が減少し， タンパク合成もPHB合成も停止して， 乾燥菌体重且
も増加せずやがて は減少することが明らかになった. すなわち， 水
素供給の制限は菌体生産もPHB生産も共に停止してしまうことが証明
された.
R.S. SiegelとD.F. Ollis1 4 )は， A. � utrophu s ATCC 17707を用し た実験で， 溶存水素濃度が低く維持されたときに増殖速度が増大し，
溶存水素濃度が高くなると増殖速度が減少したと報告している. し
かしながら， 我々が用いた主.e utrophu s ATCC 17697の場合， 高濃度
の水素による基 質 阻 害は全くみられなかった. 一 方 酸素につ いて は， 酸素の供給が制限され， 溶存酸素濃度がゼロになると菌体内にPHSが
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• H2
• O2 A CO2
10 20 30 40 50 60
Time
(h)
図5-6 水素供給が制限された条件下のガス消費速度.
Time
(h)
図5-7 水素供給制限下の培養における菌体量
および菌体内生産物濃度変化.
蓄積される3 )が， 溶存酸素濃度が増大すると酸素による基質阻害の 影響で増殖速度が減少すること が明らかにされている1 <1 ) このよう にA.�utrophu sでは酸素に対する挙動と水素に対する挙動が全く異な ることが明確となった.
5-4 小括
酸素の供給が制限された場合のA. e utrophu sの培養挙動はすでに明 らかにきれているが， 培養液中の溶存水素圧を溶存ガス電極で測定 する技術が今まで全くなかったため， 水素の供給が制限された場ム の本菌の培養挙動は全く知られていなかった. しかし， 当研究室で
開発した溶存水素電極を用いること で水素供給制限下の培養挙動が 測定可能となった. 水素の供給が制限された場合と酸素の供給が制 限された場合のA . e utrophu sの培養挙動の遣いを比較検討するため，
まず水素， 酸素， 炭酸ガスの消費速度と溶存水素濃度の関係を調べ た. 結果， 各ガス基質の消費速度は溶存水素圧に依存して変化し，
これらの関係はl1ichaelis-Menten型の式で表すことができた. そこ で， Michaelis定数を求めるため， 溶存水素濃度と各ガス基質の消 速度をHanes-Woo]fプロ ットすると， 各ガスについて相関係数がほぼ
1の直線を得ることができた. また， このプロ ットで各ガスについ て得られる直線が原点、を通る直線であることから， 測定した溶存水
素濃度の範囲内では水素， 酸素， 炭酸ガスいずれの基質消費速度に ついても溶存水素圧の上昇による基質阻害は全く見られないことが 明らかになった. これらの事実は， 酸素制限条件下の基質ガス消費 速度と溶存酸素圧との関係がMichaelis-Menten型の式で表すことが できなかったことや， 高濃度の溶存酸素庄では基質阻害が 現れるこ とと全く異なる現象である.
次に， 水素供給制限のまま培養が継続したときの本菌の培養特性 を調べた. まず， 水素， 酸素および炭酸ガスの消費速度の経時変化 を測定した. 結果， いずれの基質も培養の経過に伴いその消費速度 が減少した. さらに菌体重， 菌体タンパク量， 菌体内PHB含量も減少 した. これらの結果， 水素供給制限条件下 では， タンパク合成も PHB合成も停止して乾燥菌体重量も増加せず， やがては減少すること が明らかになった. すなわち， 水素供給の制限は菌体生産もPHB生産 も共に停止してしまうことが証明された. これは酸素供給が制限の まま継続したとき， 舵燥菌体重量とPHB含量は増加するが， このとき 菌体タンパク含量はほぼ一定に維持され， PHBだけが炭酸ガスから独
立栄養的に合成される現象と全く異なっている. よって世 菌体生産 やPHB生産を目的生産物とする培養が水素供給制限条件に陥ると， 培 養に悪影響を与えるという結論に達した.
終 三と〉両同
水素酸化細菌は， 炭酸ガスを唯一の炭素源として利用して増殖す る能力をもち， また酸素の供給や培地の特定のミネラル成分を制限 すると， 菌体内に生分解性プラスチック素材の原料となる高分子を
多量に蓄積させること ができる. 水素酸化細菌のこのような能力を 利用し， 炭酸ガスから有用物質を発酵生産させる試みは， 温室効果 によって地球温暖化に寄与していると考えられる炭酸ガス削減の間 題と， 生態系にまで影響を与え始めた難分解性のプラスチックによ る環境汚染の問題とを同時に解決できる可能性を秘めている. 地球 環境の危機が叫ばれている昨今， 水素厳化細菌を利用する培養技術 は? 環境浄化に貢献できる一つの技術としての潜在能力を有してい るが， 実用的な水素酸化細菌の培養を行うにあたっては， 未解決の 培養工学的問題が数多く存在している. この中で， 水素酸化細菌の 独立栄養培養を行う際に最も研究 が遅れている領域は， 培養液中の 溶存水素の挙動に関する研究である. 理由は， 溶存水素の測定が技 術的に難しく， 簡便な測定方法では 溶存水素圧を正確に把握できな いためである. 今日でも実用的な培養舟の溶存水素電極はほとんど
開発されておらず， また大型で高価なものが多いのが現状である.
そのため， 水素の物質移動に関する知見もほとんどないに等しい状 態である.
当研究室では， 水素酸化細菌Alcaligenes eutrophu s ATCC 17697 を用いた実用的な独立栄養培養技術の確立に向けて研究を行ってい る. 本菌の培養は， 水素と酸素および炭酸ガスからなる混合気を通 気して行うが， この基質成分のうち水素は最も大量に消費される基 質であると同時に， 最も溶解度の小さい基質でもある. 菌体は一度 液に溶解した溶存水素を利用して増殖するので， この培養液中の溶 存水素の挙動を把握するためには， 溶存水素電極の開発が必要とな
る. 本研究の水素酸化細菌の培養は， 全容200 mlの培養槽を用いて 行っているが， この培養槽の規格に適合する溶存水素電極は見あた らなかった. したがって， 開発する溶存水素電極はこのような小容 量の発酵槽に取り付けて測定が可能な小型のものでなければならな い. そこで， 本論文では， まず全容200 mlの小型培養槽に装着可能 な， 発酵槽内掃入型溶存水素電極の開発し， ついで新たに開発した 溶存水素電極と既存の溶存酸素電極を培養槽に装着してA.e utrophu
sの培養液中の溶存水素圧と溶存酸素圧を測定し， 培養系の水素と酸 素の総括物質移動容量係数， 磁界溶存水素圧と磁界溶存酸素圧を求 めた. 一方， 気相のガス組成については水素爆鳴気とならない混ム 比を検討した. そして， 以上の諸条件を満たした水素と酸素の菌体 による要求童と， 装置特性による供給量の関係を明らかにした. 最
後に， 水素供給制限条件と酸素供給制限条件による本菌の培養挙動
の違いを明らかにすることを目的として研究を行った結果について 論じた.
第一章では， A. � utrophu sの培養に 用いる培養システム， 培地， 基 質ガスの調製と流量調節世 保存株から培養槽への継代培養法， 適応 期の短縮法について検討を加え， 以後の実験を円滑に 行えるよう準 備した. その結果， 培養槽での培養は， 閉鎖循環型培養システムお よび微量元素を補った無機培地を用いて独立栄養培養を行うことに した. 混合気の流量調節は， 正確な基質ガス消費速度を測定するた
めに重要になるが， 混合気組成と空気換算流量， 空気換算流量と流 量計目盛りの関係を数式化することで， 容易に混合気組成から流 計目盛りの値を得ることができるようにした. 保存株から培養槽へ の継代培養の過程で， 試験管の肉エキス液体培地から坂口プラスコ の無機培地へ植え継ぐ場合には， 菌体は約5時間の適応期の後対数 増殖を開始し， 培養約15時間で定常期に移行する. そこで， 無機塩 培地を入れた坂口フラスコ で一旦培養した菌株をさらに新しい無機 塩培地を入れた坂口プラスコヘ継代培養すると， 培養初期の適応期 を短縮できた. しかし， 坂口プラスコを用いたガス培養では， 肉エ キス培地で得られる菌体重の約] /7しか得られず， この原因は独立栄 養培養に用いる培地のpHの急激な低下にあると考えられた.
第二章では， 小型発酵槽内の溶存水素濃度をjn siluで測定可能な
溶存水素電極の開発の過程と， 溶存水素電極の特性について得られ た結果を記した. Clark型の溶存水素電極の構造がClark型の溶存酸 素電極の構造と類似していることに着目し， 溶存水素電極が市販の 溶存酸素電極から開発 可能かどうか実験検討した. 使用した培養周 のClark型溶存酸素電極は容易に入手でき， しかも小型培養槽に直綾
取り付けて使用できるものであった. Biott社から市販されている溶 存酸素電極DG-5Pを用い， これを改造して溶存水素電極 を開発した.
この電極は白金-白金黒および銀・塩化銀の金属の組合せからなる 極で， 電極内部液は塩酸でpHを1.0とした1M極化カリウム水溶液とし た. この溶存水素電極は， 全容が200 mlの培養槽の規格に適合して おり， 発酵槽の溶存水素圧をon-lineで測定可能であった. 溶存水素 圧と電極出力の関係から， この溶存水素電極の分極電圧は550 mVが
適しており， この条件を用いると100 kPa以下の溶存酸素分圧を正確 に測定可能できた. この電極のステップ応答に対する時定数は5.9 秒であり， 電極の時定数と総括物質移動容量係数の関係式から計算 されるgassing out法による総括物質移動容量係数の測定限界は約 610 l/hである. この溶存水素電極の時定数(5.9秒)は， 試作溶存水 素電極の時定数( 16 .8秒)よりも10.9 秒も短縮されており， 培養系の 溶存水素濃度の経時変化の測定に十分使用できるものと判断した.
培地成分がこの溶存水素電極の応答に与える妨害の影響を酸素につ
いて検討したところ， 培養に用いる酸素分圧程度では測定上全く問 題ないと判断した.
第三章では， 主. e utrophu sを独立栄養条件で培養を行う際の水素と 酸素の物質移動現象を明らかにするため， これらのガスについての 総括物質移動容量係数について検討した. まず， モデル系における の総括物質移動容量係数を求め， つづいて水素酸化細菌の培養系に おけるこれらガスの総括物質移動容量係数を求め， その関係につい
て論じた. さらに， これらの総括物質移動容量係数と， 亜硫酸酸化 法による酸素の総括物質移動容量係数との関係について検討した.
また， 亜硫酸酸化法による総括物質移動容量係数(KLa)sを知ること により， その培養槽の水素の総括物質移動容量係数(KLa)Hが予測で
きないかどうかを検討した. 最後にかくはん速度と培養系の水素と 酸素の物質移動容量係数の関係を示した.
酸素の総括物質移動容量係数の測定方法を， 水素の物質移動容 係数の測定に応用し， A. e utrophusの培養液を用いて培養系の水素と
酸素の総括物質移動容量係数の測定方法を種々検討した結果， 水素 の物質移動容量係数の測定においても， 電極の時定数を考慮する必
要のない排気ガス分析法がgassing out法よりも優れていた. しかし ながら ， 小規模の培養槽の水素と酸素のガス消費速度を測定するに
はgassing out法による溶存ガス濃度の減少量を測定する方法の方が，
培養槽の出口と入口の物質収支をとる方法よりも優れていた. そこ で， これらの長所を組み合わせた方法により培養系の水素と酸素の 培養系の総括物質移動容量係数を求め， これらの関係が以下の関係 式および相関係数
(KLa)H=0.280(KLa)1.29 (0.930)
で表せること， また， 培養液の酸素の総括物質移動容量係数と， 亜 硫酸酸化法による酸素の総括物質移動容量係数の関係が以下の関係
式および相関係数
KLa=0.347(KLa)SI.27 (0.970) で表せることを明らかにした.
さらに， 培養系の水素と酸素の総括物質移動容量係数および亜硫 酸酸化法による酸素の総括物質移動容量係数と， 物質移動容量係数 の制御因子の一つであるかくはん速度との関係は以下の関数および 相関係数で表せることが明らかとなった
(KLa)H=0.00130Nl.86 (0.953) KLa=0.0172Nl.43 (0.998) (KLa)s=0.11N1.10 (0.992)
以上の関係式から， 培養系の水素と酸素の総括物質移動容量係数は，
亜硫酸酸化法による酸素の総括物質移動容量係数から推定可能とな った. また， 亜硫酸酸化法のKLaとかくはん速度との関係が明らかと
なった培養系では， かくはん速度から水素のKLaも推算できることを 明らかにした.
第四章では， A. e utrophu sの大量培養を行う際に問題となる水素と 酸素の供給量と菌体による要求量との関係を明らかにすると共に，
システムの安全性を確保するための基質ガス組成を爆発範囲外に維 持する条件， 菌体を対数増殖させるために水素と酸素の供給が制限 とならない条件を考慮し， これらの諸条件を満足する培養条件の検
討を行った. まず臨界溶存庄の測定方法について検討を行ったとこ ろ， 小型の培養槽の場合やガス消費速度の小さい低菌体濃度の培養 の場合の磁界溶存ガス庄の測定には， ガス消費速度を正確に測定す ることができるgassing out法による溶存ガス圧の変化をガス電極に
よって測定した経時変化から求める方法の方が， マスバランス法に よりガス消費速度を求め， これと溶存ガス圧との関係から求める方 法よりも適し ていた. この方法を用いてA.� utrophu sの臨界溶存水素 圧と磁界溶存酸素 圧はそれぞれ11.6kPaと3.17kPaと求められた.
方， 基質ガス組成を爆発範囲外に維持する条件を検討したところ，
水素， 酸素， 炭酸ガスおよび水蒸気からなる四成分系の混合気中の 酸素分圧は6.9%(6.99 kPa)以下に維持しなければならないことが確 認された. この点については， 培養系の安全性を十分 に確保するた めには， ガス基質中の酸素濃度 は6.0%(6.08 kPa)を越えてはならな
いことが西部ガスの研究グループによって明らかになっている. そ こで， 対数増殖期にあるA.e utrophu sのガス要求条件， 比増殖速度を
最大に維持する条件? 爆発限界以下にガス組成を維持する条件， 培 養槽の水素と酸素の物質移動能力， 水素と酸素が同時に制限される 条件などの諸関係を総合して解析したところ， 次のような結果が得 られた. すなわち， 本菌の対数増殖における増殖菌体の水素と酸素 の要求量の比と， 本菌の磁界溶存ガス圧の比とはほぼ等しくなって いる. また， 物質吸収速度係数を水素と酸素で比較するとこれらの 値もほぼ等しくなっている. しかも， 水素と酸素の物質吸収速度係 数は， 測定を行ったかくはん速度の範囲内でほとんど等しく， 装置 特性に起因する水素と酸素の物質移動能力はほぼ等しい. 以上の結 果から， 供給される水素と酸素の気相のガス組成の比は， 水素と酸 素の要求重の比と水素と酸素の磁界溶存圧の比と等しくしなければ ならない. よって， 水素の気相分圧は酸素のそれの約3.5堵に維持さ れていなければならないことが明らかになり， この水素と酸素の比
率を維持して基質ガスを供給すれば， 前述の条件をすべて満た すこ とができると考えられる.
第五章では， A. � utrophu sの独立栄養培養で水素供給が制限された ときの培養挙動を調べ， 酸素制限条件のときとのその遣いを明かに した. 次に， 水素 供給制限のまま培養が継続したとき， 本菌が何ら
かの有用物質を生産するかどうか， 生理的な変化がどの様に生じる . か検討した.
水素， 酸素， 炭酸ガスの消費速度と溶存水素濃度の関係を調べた 結果， 各ガス基質の消費速度は溶存水素圧に依存して変化し， これ らの関係は円ichaelis-Menten型の式で表すことができた. そこで，
溶存水素濃度と各ガス基質の消費速度をHanes-Woolfプロ ットして線 形解析を行うと， 各ガスについて相関係数がほぼ1の直線を得るこ とができた. このプロ ットで各ガスについて得られる直線が， 原点 を通る直線であったことから， 測定した溶存水素濃度の範囲内では 水素， 厳素， 炭酸ガスいずれのガス消費速度についても溶存水素圧 の上昇による基質阻害は全く見られない ことが明らかになった. こ の事実は， 酸素制限条件下の基質ガス消費速度と溶存酸素圧との関 係がれchaelis-l1enten型の式で表す ことができないことや， 高濃度 の溶存酸素圧では基質阻害が現れることと全く異なる現象である.
水素供給制限のまま培養が継続されると， 全てのガス基質の消費 速度は培養の経過に伴い減少した. タンパク合成もPHB合成も停止し て乾燥菌体重量も増加せず? やがては減少することが明らかになっ た. すなわち， 水素供給の制限によって菌体生産もPHB生産も共に停 止してしまうことが証明された. 一方， 酸素供給が制限のまま継続
されると， 乾燥菌体重量とPHB含量は増加するが， このとき菌体タン
パク含量はほぼ一定に維持され， P H Bだけが炭酸ガスから独立栄養的 に合成されることが明らかにされている. よって， 菌体生産やPHB生 産を目的生産物とする培養が水素供給制限条件に陥ると酸素供給制 限条件とは異なり， 培養に悪影響を与えるという結論に達した.
以上に述べてきたように， 水素酸化細菌の培養系における溶存水 素の挙動が本研究により明らかになった. また， 本研究で明らかγ した溶存水素電極による溶存水素圧の測定方法， 水素の物質移動容 量係数や磁界溶存水素庄の測定方法などの培養液中の溶存水素の挙 動に関する現象の解析方法などは， 水素酸化細菌の実用的な培養技 術の確立に貢献するばかりに留まらず， あらゆるガス培養に応用可
能な技術である.
謝 辞
本論文を審査していただきました九州大学農学部食糧化学工学科
微生物工学講座石崎文彬教授， 九州大学農学部食糧化学工学科食品
製造工学講座藤尾雄策教授， 福岡大学工学部化学工学科中原俊輔教
授に感謝いたします.
本論文を作成するにあたり， 始終御指導いただきました九州大学
農学部食糧化学工学科微生物工学講座石崎文彬教授， 愛媛大学農品 部生物資源学科農芸化学講座発酵学研究室木場洋次郎教授， 英国ハ
ットフィールド工業大学生物科学科P.F.Stanbury教授， 九州大学農
学部食糧化学工学科微生物工学講座国元謙二助教授， 田中賢二助手，
殿川道夫助手， また講座卒業生， 在学生諸氏に感謝いたします.
技術的御指導と特殊器具を御提供くださった， エイブル株式会社
石川陽一氏， 貴社スタップの方々に感謝いたします.
使用記号
a:単位依積当たりの気液接触界面積:cm2/cm3 C :溶存酸素濃度:mol/l
C G :気相の酸素分圧と平衡な溶存酸素濃度:mol/l ( C G ) H :気相の水素分圧と平衡な溶存水素濃度:mol/l
(CG)in:培養槽入口の酸素分圧と平衡な溶存酸素濃度:mol/l (CG)out:培養槽出口の酸素分圧と平衡な溶存酸素濃度:mol/l ( C) H : 溶存水素濃度:mol/l
C i :気液接触界面における 溶存酸素濃度:mol/l
C s :亜硫酸ナトリウム濃度:mol/l
C. :定常状態を仮定したときの 溶存酸素濃度:mol/l F :ガス流速:mol/h
F i n :培養槽への ガス流入速度:mol/h
F 0 u t :培養槽からの ガス流出速度:mol/h
K d:酸素吸収速度係数:mol/(l・Pa) ( K d)H:水素吸収速度係数:mol/(l・Pa)
K G :気相濃度基準の総括物質移動係数:cm+mol/(h'l・kPa)
k G : ガス側物質移動係数:cm+mol/(h'l・kPa) K L :液相濃度基準の総括物質移動係数:c ml h
k L :液側物質移動係数:cm/h
k L e: 反応吸収における液側物質移動係数:cm/h K L a :培養系の酸素の総括物質移動容量係数: 1 I h
(KLa)H:培養系の 水素の総括物質移動容量係数: 1 I h
(KLa)s:亜硫酸酸化法による酸素の総括物質移動容量係数: 1 I h H :酸素のHenry定数: mol/(kPa.l)
( H) H : 水素のHenry定数: mol/(kPa'l)
H TR : 水素移動速度: mol/(h'l) K m :飽和定数: kPa or mol/l N :かくはん速度: rpm
OTR: 酸素移動速度: mol/(h.l) P :気相の酸素分圧: kPa
( P) H :気相の水素分圧: kPa p c :臨界溶存酸素圧: k P a (PC)H:磁界溶存水素圧: kPa
P i :気液接触界面の酸素分圧: kPa
P L : 溶存酸素濃度と平衡な気相の酸素分圧: kPa (PL)H: 溶存水素濃度と平衡な気相の水素分圧: kPa
PLof f: Gas off時点、の溶存酸素濃度と平衡な気相酸素分圧: k P a (Poff)H: Gas off時点の溶存水素分圧と平衡な気相水素分圧: kPa
Pon: Gas on時点の溶存酸素濃度と平衡な気相酸素分圧: k P a (Pon)H: Gas on時点、の溶存水素濃度と平衡な気相水素分圧: kPa R :気体定数: kPa'l/(mol・.C)
r :酸素の消費速度: mol/(h.l)
( r ) ( :炭酸ガスの消費速度:mo]/(h.l)
( r ) H :水素の消費速度: mol/(h.l)
r fTI a x :酸素の最大消費速度: mol/(h.l)
S : Laplace変数: 一 t :時間: h
T :時定数: h
V :培養液張り込み重: 1
v :菌体が生成したときの培養液量: 1
x i n :培養槽入口の酸素のモル分率: - (Xin)H:培養槽入口の水素のモル分率: (Xin)t.�:培養槽入口の窒素のモル分率:
X 0 u t :培養槽出口の酸素のモル分率: -
(Xout)H:培養槽出口の水素のモル分率: (Xout)N:培養槽出口の窒素のモル分率: X :菌体濃度: g/l
X ø :接種時の 菌体濃度: g/l ß :反応係数: -
。in :培養槽入口におけるじからの偏差: mol/l e 0 u t :培養槽出口におけるかからの偏差: mol/l
ゆi n: Laplace変換後のe i n : ー
ゆout:Laplace変換後のe 0 u t: -
序 三と〉百四
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