リン ゴ酸脱 水 素酵 素 の アイ ソザ イムに関 す る研 究 第2編
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(2) 272. 高. ザ イ ムの 変 動 をstarchgel. 安. electrophoresisに よ り追. 正. 雄. Ⅲ. 諸条件 下にお ける血 清. 非特異 因子. 仕 事 が あ る が 著 者 は寒 天 ゲ. 非 特 異 因子 の 血 清 蛋 白 との 関 係 を 明 らか に す るた. ル 電 気 泳 動 法 に よ り,詳 細 に ラ ッ ト新 生 仔 及 び成 熟. め,同 量 の血 清 を 同 時 に電 気 泳 動 した後,一 方 に蛋. ラ ッ トの 各 種 臓 器MDHア. 白 染 色 を ほ ど こ し,他 方 に 非 特 異 因子 の染 色 を 行な. 求 したWiggert等29)の. イ ソザ イ ム パ ター ン の 相. つ た 後,比 較 した.続 い て,耐 熱 性,酵 素 阻 害 剤に. 違 を 追 求 した.. 対 す る態 度 を検 討 し た.即 ち,無 処 置 の 血 清, 60℃. 第2章 第1節 Ⅰ. 実 験材料並び に実験方法. 30分 間 熱 処 理 した もの,及 mercuribenzoate(以. 実験 材料. 血 清MDH活. 性. 血清. 非 特 異 因子. 用 し た.染. と 略 す)(Sigma社 buffer. (PH. 製),. 略 す)を. methosulfate(以. NaCN.(和. 7.0〜8.0)及. 下NTBと. 非特異 因子. 染 色 液 を 用 い, 38℃,. の 測 定 に は健 常 者 の 血 清 を 使. 色 に はphenazine. イ ト と 米 国Dajack社. 下PMS. NTBは. 1). NTB. 0.4mg/ml 0.2mg/ml. 2). PMS. 3). NaCN. 国 産 ドー タ. 4). phosphate. 5). 蒸溜水. 製 の もの を 比 較 の 目的 で 使 用. し た.. 30分 間 染 色 した.. 実験 に使 用 した染色 液組成. blue(以. 光 特 級)phosphate. びnitrotetrazolium. 使 用 し た が,. 々 のパ ター ンの デ ン シ トメ トリー に よ り,定 量 的 に 比 較 した.非 特 異 因子 の 染 色 に は下 記 の処 方 に よる. 並 びにその アイソザ イムの測定 を行 なつた. 諸条件下 における血 清. 略 す)を 加 え, 15℃. 6時 間 放 置 した もの に 非 特 異 因子 の 染 色 を行 い,夫. 性 及 び ア イ ソザ イ ムの 測 定. 各種疾患 々者 の血清 及び健常者 の血 清MDH活 Ⅱ. び1mg/dlのparachlor‑. 下PCMBと. 10μM/ml buffer. (PH. 7.4). 2.2ml 全 量15mlと. す る.. 次 に 染 色 液 組 成 に よ る非 特 異 因 子 の 変 動 を み るた. Ⅲ. め にPH=7.4,染. ラ ッ ト新 生 仔 及 び成 熟 ラ ッ トの各 種 臓 器 の MDHア. イ ソザ イ ム測 定. ラ ッ ト諸 臓 器 のMDHア. イ ソザ イ ム測 定 に は 断頭. 色 温 度38℃,染. し て,第. 一 にPMSを0.2mg/ml,. と し て,. NTB濃. 色 時 間 を30分. と. CN‑を10μM/ml,. 度 を0〜1.0mg/mlと. 変 化 さ せ て,. 後 直 ち に 開 胸 及 び開 腹 を行 な つ て,心,腎,肝,胃. 夫 々の 非 特 異 因 子 を デ ン シ トメ トリー に よ り定量 し. 粘 膜 を 取 り 出 し, Ringer氏 液 で 洗 滌 した も の を 使 用. た｡(単 に し,. した. 又 成 熟 ラ ッ トの 諸 臓 器MDHア に は エ ー テ ル 麻 酔 後,直 心,腎,肝,胃. イ ソザ イ ム の 測定. ち に 開 胸,開 腹 を行 な い,. 粘 膜 を 取 出 し, Ringer氏 液 で よ く血. 液 を洗 い流 した もの を 使 用 した.. 第2節. PH. 7.4のphosphate. M‑NADH2液0.1ml, 7.4). 0.1ml,蒸. 0.1mlを. 加 え,反. の 条 件 で340mμ. buffer 0.0076Mオ. 溜 水2.4mlを. の キ ュ ベ ッ トに 入 れ,. 25℃. 0.3ml,. 血 清MDHア. CN‑=10μm/mlと. を0〜0.6mg/mlと 測 定 し た.第. 変 化 さ せ,夫. し, CN‑濃. 吸光度. 30分 と し,. PMS=0.2mg/ml,. =0.4mg/mlと. し て,. 国 のDajack社. 色 温 度38℃,染. 色 時間. CN‑=10μM/ml,. NTBに. NTB. 国 産 ドー タ イ トと,米. 製 の も の を 使 用 した各 場 合 の 非特 異 較 し た.. る た め に,染 色 液 中 のNTB=0.4mg/ml, mg/ml,. CN‑=10μM/mlと. 染 色 時 間=30分. PMS=0.2. し,先 づ,温 度=38℃,. と し, PHを7.0〜8.0と. して, PH. の 非 特 異 因 子 に 及 ぼ す 影 響 を夫 々の 場 合 の非 特異因. イ ソザ イ ムの 測 定 法. ア イ ソザ イ ムの 分 離 に はWiemeの. 度 を0〜20μM/mlと. 々 の 場 合 の 非 特 異 因 子 を 測 定 し た.最. 更 に染 色 条 件 の非 特 異 因 子 に及 ぼ す 影 響 を観察 す 清. 1単 位 は 上 記. 1分 間 に0.01の. し, PMS. 々の 非 特 異 因子を. 三 に 同 様 の 条 件 下 にNTB=0.4mg/ml,. PMS=0.2mg/mlと. 因 子 を 測 定 し,比. 上 記 の 順 に 光 路1cm に 温 度 を 平 衡 し,血. 応 を ス タ ー トす る, に お い て,. 0.0015. キ ザ ロ 醋 酸(PH. の 減 少 を 来 す 酵 素 活 性 で あ る.. Ⅱ. NTB=0.4mg/ml,. 二 に 染 色 条 件 は一定. 後 に 染 色 条 件 をPH=7.4染. 活性測 定法. 活 性 測 定 に は 島津 ベ ック マ ン型 分 光 光 度 計 を 用 い た.. D.×cm×10‑2)第. 変 化 さ せ,夫. 実験方法. Ⅰ 血 清MDHの. 位O.. 子 の デ ン シ トメ トリー を 行 な う こ とに よ り測 定 し,. 寒 天ゲル 電気. 次 い で, PH=7.4,染 を30℃. 法 も基 質 染 色 液 組 成 も前 編 の 組織MDHア. した.最 後 に, PH=7.4,染. イ ソザ イ. 〜40℃. 色 時 間=30分. 泳 動 法 を 用 い た.泳 動 試 料 に血 清 を 用 い た他 は 泳 動. と し,染 色温度. と して,染 色 温 度 に よ る影 響 を検討 色 温 度=38℃. とし,. ム の 測 定 法 の項 に述 べ た も の と 同 様 の も のを 使 用 し. 染 色 時 間 を15分 〜70分 迄 変 化 さ せ 染 色 時 間 によ る影. た.. 響 を 同 様 の 方 法 で 測 定 した..
(3) リン ゴ 酸 脱 水 素 酵 素 の ア イ ソザ イ ム に 関 す る研 究 そ の 他 染 色 後 標 本 をPH. 4.5の 醋 酸 々性 液 で 洗 滌. した 場 合 と単 に 水 洗 した場 合,染 色 中 の露 光 の 影 響. び成 熟 ラ ッ トよ り得 た 心 筋,腎,. 肝,胃 粘 膜 等 の組 織 を湿 重 量 で5%と. な る様, 0.25. M庶 糖 液 に ホ モ ジ ネ ー トし,前 編 に述 べ た と同 様 の 方法で, MDHア. 基質. 性 の上. 昇 を来 した 疾 患 で は 図2に 示 す 如 く, MD1〜MD5の. イ ソザ イ ム の 測 定. ラ ッ ト新 生 仔,及. 一 致 す るpeakは. 心 筋 梗 塞,急 性 肝 炎 の如 く,血 清MDH活. ラ ッ ト新 生 仔 及 び 成 熟 ラ ッ トの各 種 臓 器 の MDHア. MD5に. 染 色 液 よ り基 質 及 び 補 酵 素 を除 い て も染 色 さ れ た. (血 清 非 特 異 因 子 と して 別 項 に検 討). につ い て も検 討 を 加 え た. Ⅱ. 認 め られ たが, MD4,. 273. 5分 画 を 認 め,夫 々心 筋,肝 のMDHア. イ ソザ イ ム. パ ター ンに 似 たパ ター ンを 示 した が, MD6は. 認めら. れ な か つ た.. イ ソザ イモ グ ラムを 作 製 し,各 分. 図2. 血 清MDH活 性 上昇 を 来 した 疾 患 の ア イソザイムパター ン. 画 の百 分 比 を算 定 した.又 超 遠 沈 操 作 に よ り,細 胞 分 画 を ミ トコン ド リア 及 び 可 溶 性 分 画 に分 け,夫 々 のMDHア. イ ソザ イ ム を 測 定 した.. 第1節 血 清MDH活. 第3章. 実 験成 績. 血清MDH活. 性. 性 は健 常 者 で は15〜30uで. あ つ た.. 心 筋梗 塞,急 性 肝 炎 で 有 意 の 上 昇 を 認 め た が,肝. 癌. で は症 例 に よ り 著 しい 開 き が 認 め ら れ た.慢 性 肝 炎,肝 硬変 で は正 常 値 を 示 した.白 血 病. そ の他 の. 悪 性腫瘍 で は上 昇 を 認 め た も の もあ つ た.慢 性 腎 炎 で は正常値 を 超 え る もの は 経 験 さ れ な か つ た.(図 1) 図1. 各 種 疾 患 に お け る血 清MDH活. 性. 第3節. 諸条件下 における血清非 特異因子. 血 清 非 特 異 因 子 の 電 気 泳 動 像 は 大 小2つ よ り な り,血 MDHア. 清 蛋 白 のAlb.,α1,. イ ソ ザ イ ム で はMD4,. ソ ザ イ ム で は,. 60℃,. LD4,. LD5に. Glb.に MD5に,. のpeak. 夫 々 一 致 し, LDHア. 30分 間 の 熱 処 理 を 行 な つ た血 清 及 びPCMB. 処 理 を 行 つ た血 清 に つ い て,非. 特 異 因 子 を 測 定 し,. 無 処 置 の 血 清 で 測定 した も の と比 較 した が,差 め られ な かつ た.(図4)従 第2節. 血 清MDHア. 正 常 ヒ ト血 清MDHア す る部 分 及 びMD4,. イソザイム イ ソザ イ ム はMD3に. MD5に. イ. 夫 々 一 致 す る.(図3). は認. つて本因子 は熱 及 び 酵. 素 阻 害 剤 に対 して 安 定 で あ る こ とが 確 認 さ れ た. 相当. 一 致 す る部 分 にpeakが. 染 色 条 件 を 一 定 と し,即 =38℃,染. 色 時 間=30分. ちPH=7.4,染 と 定 め,ま. 色 温 度 づ,. PMS=0. .2.
(4) 274. 図3. 高. 非 特 異 因 子 と血 清 蛋 白及 び 血 清MDH, ア イ ソザ イ ム パ タ ー ン との 比 較. 図4. 熱 及 ぴPCMBに. 安. LDH. 正. 雄. 上 昇 に よ り急 に増 量 す る こ と が 認 め られ た.(図5) 図5. 染 色 液 組 成 に よ る影 響. 対 す る 安定 性. 染 色 条 件 は前 述 の 如 く一 定 と し, NTBに 国産 ド ー タ イ トと 米 国Dajackの 社 製 も の を夫 々使 用 した 場 合 の 非 特 異 因 子 を定 量 比 較 した と ころ か な りの差 が認 め られ た.(図6) 図6. 内外 二 社 のNTBを. 使 用 した 場 合 の 非特. 異因子の比較. mg/ml,. CN‑=10μM/mlと. 0〜1.0mg/mlと. 一 定 に し, NTB濃. 度 を. 漸 時 増 量 す る と非 特 異 因 子 も 濃 く. な る こ とが 明 らか に され た. 次 にNTB=0.4mg/ml,. CN‑=10μM/ml,と. PMSを0〜0.6mg/mlと. 変 化 させ た場 合 の 非 特 異 因. 子 を測 定 した と こ ろ, PMS=0の ×10‑2と な り, PMSを. し,. 場 合 も3.900×cm. 欠 く場 合 も,染 色 す る こ とが. 明 らか に な つ た. PMSの. 濃 度 を増 す と,非. 特 異 因. 子 も濃 染 す る こ とが 観 察 され た. 次 にNTB=0.4mg/ml, CN‑濃. 度 を0〜20μM/mlと. 場 合 も 非 特 異 因 子 は0と. PMS=0.2mg/mlと 増 加 し た 場 合, は な ら な い が,. し, CN‑=0の CN‑濃. 染 色 条 件 の 非 特 異 因 子 に及 ぼ す 影 響 を 観 察 す るた 度 の. め に,染 色 液 中 のNTB=0.4mg/ml,. PMS=0.2mg/.
(5) リ ン ゴ酸 脱 水 素 酵 素 の ア イ ソザ イ ム に 関 す る研 究 ml, CN‑=10μM/mlと ,染 色 液PH,染. して,染 色 液 組 成 を 一定 に し. 色 温 度,染 色 時 間 に よ る 影 響 を 観. 察 した.. 粘膜 のMDHア. 275. イ ソザ イムは全 例に陰極 に泳動 す る. 分 画 と陽極 に泳動 する分 画の2分 画 が認め られ た. 陰 極 に泳 動 す る分 画 は主 と して ミ トコ ン ドリア分. 液 色 温 度=38℃,染 〜8.0と す る と, PHが. 色 時 間=30分. と し, PH=7.0. 上 昇 す るに つ れ 非 特 異 因 子 は. 急 激 に濃 染 度 を増 す こ とが 明 らか に され た. PH=7.4,染 ℃〜40℃. 色 時 間=30分. と した 場 合,温. 染す るが, 36℃ と40℃. 夫 々m‑MDH,. c‑MDHと. と して,染 色 温 度 を36. =65%. , c‑MDH=35%で. あ つ た が,成 熟 ラ ッ トで. 度 の 上 昇 に と もな つ て 濃. はm‑MDHの. 比 率 が 増 加 し, m‑MDH=85%,. の 間 に 著 しい 差 は認 め られ. MDH=15%が. 認 め られ た.. 新 生 仔 ラ ッ トの 肝 で は,. 色 温 度=38℃. と し た場 合,染. 色時間. =10%で. あ つ た が,成. を15分 よ り70分 と延 長 す る と非 特 異 因子 の 濃 度 は増. 明 に 増 加 し, m‑MDH=52%,. 加 した.(図7). ら れ た.. 図7. して,各 臓 器 に つ い て 百. 分 比 を 算定 し た.新 生 仔 ラ ッ トの 心 筋 で は, m‑MDH. な かつ た. PH=7.4,染. 画 に,陽 極 に泳 動 す る分 画 は 可 溶 性 分 画 に 認 め られ. 染 色 条 件 に よ る 影 響. c‑. m‑MDH=90%,. c‑MDH. 熟 ラ ッ トで は,. c‑MDHが. 著. c‑MDH=48%が. 新 生 仔 ラ ッ トの 腎 で は,. m‑MDH=87%,. 認 め. c‑MDH. =13%. ,成. 15%で. ア イ ソザ イ ムパ タ ー ン の 変 化 は殆 ん どみ られ. 熟 ラ ッ トで はm‑MDH=85%,. c‑MDH=. な か つ た. 新 生 仔 ラ ッ ト の 胃 粘 膜 で はm‑MDH=80%, MDH=20%で 66%,. あ る が,成. c‑MDH=34%で,. 熟 ラ ッ ト で は, c‑MDHの. c‑ m‑MDH=. 増 加 が み ら れ た.. (図10). 図10. ラ ッ ト新 生 仔 及 び 成 熟 ラ ッ トの各 臓 器 の MDHア. 染色後, PH 4.5の 醋酸酸性液で標本 を 洗滌 した 場合 と,単 に水染 した場合 の非特 異因子を測定 した ところ,前 者の場合には著明 な低下が認 め られた. 染 色中の露光について は定量 的実験を行 なつてい ないが,非 特 異因子の濃染を促進 す ることが観察 さ れた. 第4節. ラッ ト新生仔及 び成 熟 ラッ トの各種 臓器のMDHア. イ ソザ イム. ラ ッ ト新 生 仔 及 び成 熟 ラ ッ トの心 筋,腎,肝,胃. イ ソザイムパ ターン.
(6) 276. 高. 安. 正. 雄 一 方 寒 天 ゲ ル 電 気 泳 動 法 に よ り測 定 したYakulis18). 第4章 MDHは. 総 括並び に考按. 等 は血 清MDHア. 殆 ん ど す べ て の 臓 器 に分 布 し,こ と に 心. 筋 に 多量 に 含 ま れ,肝,骨. 骼 筋,胃 粘 膜,腎,膵. 等. イ ソザ イ ムパ ター ン の変 動 を認 め. て い な い. 著 者 は,血 清MDH活. 性 の著 明 な 上 昇 を み た心 筋. の 順 に含 ま れ て い る こ と が前 編 の 実 験 成 績 よ り明 ら. 梗 塞 及 び 急 性 肝 炎 患 者 の血 清 に,寒 天 ゲ ル電 気 泳動. か に さ れ た.血 清 のMDH活. 法 フ ォル マザ ン発 色 法 に よ り, MD1〜MD5. 性 は こ う した臓 器 に疾. 認 め,夫. 小 出32)に よ る と,血 清MDH活. に 似 た パ ター ンを 呈 し,臨 床 的 意 義 を 認 め た｡. 性 は心 筋 梗 塞 で 著 明. な上 昇 が 認 あ られ た.著 者 も心 筋 梗 塞 に お い て 血 清 MDH活. 性 の 著 しい上 昇 を 認 め て い る が,心. MDH活. 性 が 著 し く高 い こと を 考 え る と 興 味 深 い.. 肝 疾 患 の 場 合Bing31)等. は血 清MDHの. 筋 に. 増加を認. 々心 筋,肝 のMDHア. 5分 画 を. 患 の あ る場 合 に上 昇 が 予 想 さ れ る. Siegal30) Bing31). イ ソザ イ ムパ ター ン. 前 編 の成 績 よ り, MD1〜MD5はm‑MDH, c‑MDHと. 推 定 され, c‑MDHは. し, m‑MDHは MDHは. MD6は. 可溶性分 画 に 存 在. ミ トコ ン ドリア 分 画 に存 在 す る. m‑. 血 清 中 に到 達 す る迄 に は 細 胞 膜 と ミ トコン. め て い るが,急 性 肝 炎 の と きが 最 高 で あ る こ とを 示. ド リア の構 造 と い う二 重 の障 壁 が あ る の に 対 し, c‑. した.又 血 清MDHは. MDHは. 慢 性 肝 炎 で は 正 常 域,肝. 癌で. 細 胞 膜 の み で あ るか ら.血 清 中 に逸 脱 し易. 急 性 肝 炎 に ま さ る増 加 を み た 例 もあ る と 報 告 さ れ. い と考 え られ るが35),こ の 様 にMDHア. た33).著 者 の 実 験 成 績 に よ る と,急 性 肝 炎 で は血 清. グ ラム 上 に 出現 しな い の は次 の 理 由 によ る もの と推. MDH活. 定 さ れ る.. 性 の上 昇 が み られ る が,心 筋 梗 塞 に 比 較 す. る とや や低 く,慢 性 肝 炎,肝 硬 変 で は上 昇 が 認 め ら れ ず,肝 癌 で は症 例 に よ り著 しい 差 が 認 め られ た. Merten等34)に MDHの. よ る とTCAサ. イ クル の酵 素 の 中,. み が悪 性 腫 瘍 で 正 常 よ り 増 加 して い る が,. 即 ち, Kaplanに. イ ソザ イ モ. よ る成 績20)及 び 著 者 が 前 編 に お. い て 行 な つ た実 験 に お い て, c‑MDHは. 基 質 リンゴ. 酸 の 濃 度 が 上 昇 す る と,阻 害 を 受 け るの に対 し, m‑ MDHは. 阻 害 され な い こ とを 認 あ て い る が,ザ. イモ. 炎 症 性 疾 患 に 比 べ る と そ の上 昇 は 著 し くな い.著 者. グ ラ ム作 製 に リ ン ゴ酸 を 使 用 す る こ と よ り,こ の基. も 同 様 の 事 実 を 認 め た.. 質 阻害 の 問 題 が 或 る程 度 関与 す る こ と も考 え られ,. 慢 性腎炎 において は活性 の上昇 は認 め られなかつ. 又c‑MDHはm‑MDHよ PCMB等. た. 以上の事実 よ り,血 清MDH活. 性 の上昇 は組 織細. 胞の急激な損傷 によ る細胞 内MDHの. 血 清中への逸. 脱 に基づ くものと推論 され る.急 激 な組 織細胞の損. り不 安定 で 失 活 し易 い(熱,. に対 し)こ と等 よ り考 え,血 中 よ り速 や. か に 消 失 し易 い と い う特 性 に よ る もの と推 論 す るこ と も 出来 るが,決 定 的 な 原 因 は 不 明 で あ る. 正 常 ヒ ト血 清MDHア. イ ソザ イ ム はMD3に. 傷がMDH活 性 を有 す る臓器 に広範 囲に起れば活性 上 昇 も著 しい ものと考え られ る.し か るに急激な組. す る部 分 及 びMD4,. 織細胞 の損傷 を来たす原因 には血管 の梗塞,炎 症,. MD5に. 悪性腫瘍等 があげ られ る.従 つて, MDH活 性 の高 い臓器 に上記 の機転で急激な細胞損 傷が起 きれ ば,. 酵 素 を除 い て も,染 色 す るの で, MDH及. 血 清MDH活. 因子. 性 は上 昇す るが,逆 に活性の上昇 か ら. MD5に. 相当. 一 致 す る部 分 にpeakが. 認 め られ た が,実 験 成 績 の項 で も述 べ た如 く, MD4, 一 致 す るpeakは. 基 質 染 色 液 よ り,基 質,補 び他 の 酵. 素 の 影 響 は きわ め て少 な い も の と 考 え て, と 名 付 け た.こ. の 非 特 異 因 子 はMD4,. 非 特異 MD5. 原因臓器及 び疾 患臓器を推定 する ことは不可能 と考. に重 な るた め,こ の2分 画 の測 定 は 不 可 能 で,正 常. え られ る.こ うした ことは,他 の酵 素活性の上昇 を. ヒ ト血 清MDHア. 論 ず る場合 に もいえ ることで あるが,ア イソザ イム. と は 出 来 な かつ た.. の発見 によ り解 決の糸 口が見 出された. MDHア. electrophoresisに 認 め ら れ, α1Glb.とAlb.の MDH活. この血 清 非 特 異 因 子 は血 清MDHア. イ ソ ザ イ ム は1958年Vesell等21)に. ト血 清 中 に 発 見 さ れ た,そ. γGlb.. れ に よ る とstarchgel. 26%は. 間 に 存 在 し,心. 性 の 上 昇 と 共 に,. の 活 性 が,著. よ りヒ. よ り 正 常 ヒ ト血 清 中 で は3分. 46%は. α3Glb.,. 画 が 28%は. 筋梗 塞の とき 血 清. 5分 画 が 出 現 し,α1. 明 に 上 昇 す る と い わ れ る.. イ ソザ イ ム パ ター ンを 決 定 す る こ. peak. ラム の み な らず,血 も 出 現 し, LD4及. 清LDHア びLD5に. イ ソザ イモグ. イ ソザ イ モ グ ラムに 重 な るた め,こ れ 等 の. 分 画 の 測 定 精 度 に 影 響 を与 え るの で,こ の本 態 を究 明 し,そ の影 響 を 除 去 し得 る方 法 を追 求 検 討 した. 血 清 非 特 異 因 子 は60℃, て も, PCMB処. 30分 間 の 熱 処 理 に 対 し. 理 に 対 して も安 定 で,こ の条 件 では. 酵 素 活 性 の 大 部 分 が 失 活 す る こ と か ら,酵 素以 外の.
(7) リン ゴ酸 脱 水 素 酵 素 の ア イ ソザ イ ム に 関 す る研 究 PH<4.7で. も の と考 え られ た. 血 清 非 特 異 因 子 の 電 気 泳 動 像 を観 察 す る と,血 清 蛋 白 の α1Glb.〜Alb.に. 類 似 し,同 時 泳 動 に よ る 比. 277. は,α1Glb.〜Alb.は. され たNTBは. 正 に 帯 電 し,吸 着. 解 離 され,非 特 異 因子 の 出現 は抑 制. さ れ た もの と考 え られ る.(図9). 較 で も一 致 した.従 つ て 本 因 子 は血 清 蛋 白 と密 接 な. 図9. 蛋 白分 子 よ り解 離 したNTB. 関係 を有 す る こ とが 推 定 され た. 染 色 条 件,即 定 と し, NTB濃. ち,PH,染. 色 温 度,染. 度, PMS濃. 度, CN‑濃 度 に よ る 影 響. を検 討 した と ころ, NTB濃 PMS,. CN‑の 濃 度 は0で. 色時 間 を 一. 度 が 上 昇 す る と 濃 染,. も染 色 す るが,こ れ 等 の 液. 中濃 度 が上 昇 す る と急 激 に濃 染 す る こ とが 明 らか に な つ た. 又, NTBの. 製 品 に よ つ て も非 特 異 因 子 に 差 の あ. る こと が判 明 した. 次 に染 色 液 組 成 を 一 定 と し,染 色 条 件 を変 化 させ 夫 々 の非 特 異 因 子 に対 す る影 響 を 検 討 した が,こ れ に よ る と, PHが. 大 き くな り,染 色 温 度 が 上 昇 し,. 染色 時 間 が 延 長 す る と,い づ れ も,非 特 異 因 子 が 増 強 す る こと が 観 察 され た,特 にPHの. 影 響 が 著 し く,. この よ う に α1Glb.〜Alb.に 吸 着 され たNTBの. アル カ リ側 に傾 む くと 寒 天 板 全 体 が 紫 色 に 帯 色 し. SH基. た.. 度, CN‑濃 度,染 色 液 のPH,染. 又 染 色 後, PH 4.5の 醋 酸 々性 液 で 標 本 を 洗 滌 す る と,非 特 異 因 子 の 低 下 が認 め られ,染 色 中 に 露 光 す る と,非 特 異 因 子 の増 強 す る こ とが 認 め られ た.. 以上 の実験成績 よ り,非 特異 因子 の染色 は血清蛋 白と密接な関係 を有 し, NTBの. 存在 を必要 と す る. ことが明 らかに され た. 染 色 液 のPH 等 電 点 がPH NTB色. 7.4よ り小 さい た め,負. に 帯 電 し,. 素 は 正 に 帯 電 して い る,従 つ て,血. モ グ ラム染 色 中, NTB色 に 吸 着 され, NTBの 子 中 のSH基. α1Glb.は. 清 ザイ. 素 は 電 気 的 にAlb.〜 α1Glb.. 還 元 電 位 が 低 い た め,蛋. 白分. 等 に よ り,非 特 異 的 に還 元 さ れ る こ と. も十 分 に 考 え られ る.(図8) 蛋 白分 子 に 吸 着 され たNTB. 色 温 度,染 色 時 間. され る こと が 経験 され た. Barnett等36)は 組 織 化 学 研 究 に おい て, NTBが, NADとPMSの. 存 在 下 に基 質 な く還 元 さ れ る現 象 を. 認 め"Nothing. dehydrogenese"と. 名 付 け た が,そ. の. 木 等37)の 研 究 に よ り,こ の 本 態 が, LDHで. あ る可 能 性 が 指 摘 され た.本 編 の 非 特 異 因 子 は こ れ とは 別 個 の非 酵 素 性 の も の で あ る こ と が本 因 子 の酵 素 阻 害 剤,熱. に 対 し安 定 で あ る こ と よ り知 られ る.. 非 特 異 因子 の 影 響 を 最 少 限 に と ど め るた め に は こ う した 促 進 因子 の 除 去 が 望 ま しい が,染 素 の 至 適 条 件,反. 色 条 件 は酵. 応 様 式 を 考 慮 す る と 自づ か らPH. 7.4染 色 温 度=38℃,染 NTB濃. 図8. 度, PMS濃. に よ り影 響 を受 け,染 色 中 の露 光 等 に よつ て も促 進. 後,沢. 7.4附 近 で は 血 清Alb.〜. 等 に よ る非 特 異 的還 元 は, NTB濃. 度, PMS濃. 色 時 間30分. と な る の で,. 度, CN‑濃 度 を最 少 限 に抑 え,染. 色 中 遮 光 に 留 意 し,染 色 後 標 本 をPH. 4.5の 醋 酸 々. 性 液 で洗 滌 す る こ と が望 ま しい と考 え られ た.染 色 に使 用 す る薬 品 に は 純 度 の 高 い もの を 用 い るべ き は 当然 で あ る. 著 者 はPH=7.4,染 30分,. NTB(ド. mg/dl. (Sigma). CN‑=10μM/mlの. 全 に 遮 光 し て,染 時 間 洗 滌 後,一. 色 温 度=38℃,染 ー タ イ ト)=0.4mg/ml.. 色 後 はPH 夜 水 染 し,非. 色 時 間= PMS=0.2. 条 件で染色 中は完 4.5の. 醋 酸 の 性 液 で3. 特異 因子の少 いザ イモ. グ ラ ム を 得 て い る.. MDHア. イ ソザ イ ム に ミ トコ ン ドリア 由 来 のm‑.
(8) 278. 高. 安. 正. 雄. あ り,こ れ に. 上昇 をみた心筋梗塞及 び急性肝炎で特 徴的パ ター ン. つ い て は 前 編 で 詳 細 に論 じた が,本 編 で は 個 体 の 発. が認 め られ,そ の測定 は臨床上有意 義な もの と考え. 育 過 程 に お け る両 者 間 の変 動 を 追 求 した.. られ た.. MDHと. 可 溶 性 分 画 由 来 のc‑MDHが. 心 筋 で は発 育 に 伴 な つ て, m‑MDHの. 比率 に 増加. 3). ヒ ト血 清 中 の 脱 水 素酵 素 の寒 天 ゲ ル 電 気 泳 動法. イ クル に 直 結. フ ォル マ ザ ン発 色 法 に よ るザ イ モ グ ラ ムを 作 製 中,. した酵 素 で あ り,発 育 に 伴 な い,心 筋 の 仕 事 量 も増. 基 質 補 酵 素 を 除 い て も染 色 す る分 画 が 認 め られ,血. 加 し, TCAサ. 清. が 認 め られ た が, m‑MDHがTCAサ. イ ク ル の 回 転 も活 溌 にな る もの と 考. え られ るの で,そ. の間 の 関 係 を 無 理 な く 説 明 出 来. る.. 非特 異因子. 電 し たNTBが. 肝 で は逆 に 発 育 に 伴 な つ て, c‑MDHの. 比率の上昇. が み られ た.こ れ は肝 で は 物 質 相 互 の代 謝 が 活 溌 で. と 名 付 け た.こ れ は, PH 7.4で 負. に帯 電 した 血 清 蛋 白 中 のAlb.〜 吸 着 さ れ,蛋. た もの と考 え られ,こ. 昇,染 色 時 間 の延 長,染 PMS,. と推 定 さ れ,発 育 に伴 な い そ の 傾 向 が 強 ま るた め に,. され た.. 近 い 活 性 を もつ に 至 る もの と. CN‑の. 従 つ て,酵 NTB,. 腎 で はm‑MDH,. c‑MDHの. 比率は新生仔 において. 白分 子 中 のSH基. 等に. PH. PMS, 4.5. ォル マ ザ ンを形 成 し. れ は 染 色 液 のPH.温. を 通 じて,エ ネ ル ギ ー が有 効 に 使 用 さ れ て い る もの. 思 わ れ る.. に帯. よ り,非 特 異 的 に 還 元 さ れ,フ. 前 編 に 述 べ た ミ トコ ン ド リア と 細 胞 質 問 のshuttle. c‑MDHがm‑MDHに. α1Glb.に,正. 度 の上. 色 中 の 露 光 に よ り,又NTB,. 濃 度 上 昇 に よ り促 進 され る こ と が確 認. 素 至 適 条 件,反 CN‑濃. (PH<4.7)の. 応速度 を 考慮 しつ つ. 度 を 最 少 限 に と ど め,染. 色 後. 醋 酸 々性 液 で 洗 滌 す る こ と. も成 熟 体 に お い て も ほぼ 変 動 な く一 定 で あ るが,こ. に よ り非 特 異 因 子 の 少 い ザ イモ グ ラ ム を得 る こ とが. れ は発 育 途 上, MDHの. 出 来 た.. 関与 す る代 謝 に は余 り 著 明. 4). な 変 動 が な い もの と推 論 され る. 胃 粘 膜 で は発 育 に伴 な い, c‑MDHの れ るが,胃 粘 膜 で も肝 と 同様,塩. 増加が み ら. ラ ッ トの 心 筋,肝,腎,胃. 粘 膜 のMDHア. イソ. ザ イ ムの 発 育 に よ る変 動 を 追 求 した. ラ ッ トの 臓 器MDHア. 酸,消 化 酵 素 の 合. 成 等 物 質 相 互 間 の 代 謝 が 発 育 に 伴 な い,活 溌 化 す る. c‑MDHの2分. もの と考 え られ る.(図10). m‑MDHの. イ ソザ イ ム に は, m‑MDH,. 画 が 検 出 さ れ,心 筋 で は 発 育 に よ り 比 率 に,肝 で はc‑MDHの. 比率 に 増 加 が. びc‑MDHの. 発育 に 伴 な. 認 め られ た.腎 で は 発 育 に伴 な う変 動 はみ られ な か. う変動 を 追 求 す る こ と に よ り, MDHの. 関 与 す る代. つ た.胃 粘 膜 で は 発 育 に 伴 な つ て, c‑MDHが. 以 上 の如 く, m‑MDH及. 謝 調 節 機 構 の 一端 を 明 ら か に し得 た もの と考 え る.. 第5章 1). 血 清MDH活. 結. 語. 擱 筆 す るに 当 た り終 始 御 懇 篤 な る御 指 導 と御 校 閲. 性 は 心 筋 梗 塞,急 性 肝 炎,肝 癌 の. 一 部 に上 昇 が み られ た .白 血 病 そ の他 の悪 性 腫 瘍 で. を 賜 わ つ た 恩 師平 木 教 授,並. 血 清MDHア. (本 論 文 の 要 旨は 第23回 臨 床 病 理 学 会 総 会 に お い. イ ソザ イ ム は,血 清MDH活. 考. 1) Markert, C. L. & Moller.F.: Proced.Nat. Acad. 753,. て発 表 した.). 性に. 参. Sc., 45:. び に 浅 野 講 師 に深 甚 の. 謝 意 を 表 し ま す.. も一 部 に活 性 の上 昇 が 認 め られ た. 2). 増加. し た.. 1959.. 文. 献. 6) Thurnberg, T.:. Skad. Arch. Physiol.. 124: 23,. 1911.. 2) Vesell, E. S. & Bearn, A. G.: Ann. New York Acad. Sc., 75: 286, 1958.. 7) Wolfe, R. G. & Neiland, T. B.:. 3) Wieme, R. J.: Clin. Chim. Acta. 14: 313, 1959.. 8) Davies, D. D. & E, Kun:. 5) Hogeboom,G. H., Schneider, W. G., & Palade. G.E.: J. Biol. Chem., 172: 619, 1948.. 307, 1957. 9) Batelli, F. & Stern. L.: Biochem. Z. 31: 478,. 5) Batelli, F. & Stern, L.: C. R. Soc.Biol. Paris 162: 11, 552, 1956.. J. Biol. Chem.,. 221: 61, 1956,. Biochem.J., 66:. 1911. 10) Lowenthal, A., Van Sande, N.,. Karcher. D.:.
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(10) 280. 高. Studies. 安. on Malic. 正. 雄. Dehydrogenese. Isozyme. Part ‡U.. A Study. on Malic and. Dehydrogenese Rat. organs. Isozymes. during. of Human. Serum. Development. By Masao Department. of Internal. TAKAYASU. Medicine,. (Director:. Okayama. Prof.. University. Kiyoshi. Medical. School. Hiraki). Malic dehydrogenese (MDH) activities in human serum of various diseases were studied. Elevation of MDH activities were observed in myocardial infarction, acute hepatitis, and some malignant tumors. Characteristic dial. MDH. infarction. and. During or lactic. the. and. specific. reactions. on. 〜 α1. Alb.. These. PMS. tetrazolium. named. by. reactions. staining and. which. and. the. the. minimum. use. acid. Sol.,. complete. of. these by. prolonged. staining. of. a reduction. accelerated. NTB,. serum the. staining. medium. PMS. shading. and. during. of. substrate. of. patients. MDH. peaks. of. tetrazolium. the. with. were. myocar. activities. separated. and. These. serum. co-enzyme,. two. considered. a kind. salt. malic. peaks. were. of. non. electrostaticaly. adsorbed. proteins. elavation. time,. as. CN,. procedure. of. well. Considering Na. serum of. electrophoreticaly. without. factor".. from. elevation. staining. agargel,. from. SH-groups. obtained. marked. for. on. "non-specific. were. CN- in the. and. procedure. resulted. were. showing. isozymes serum. , Glb.. patterns. hepatitis. dehydrogenese. noticed. during. isozyme. acute. as. PH. or. the. temperature,. exposure. the. rise. of. concentrations. of NTB,. of optimal. washing could. conditions. stained minimize. agargels the. of enzyme with. influence. PH of. reaction, 4.5. this. acetic factor.. Two MDH isozymes were demonstrated in agargel isozymograms of rat organs, one mig rating towards the cathod and the other toward the anode. The cathodal fraction was con sidered mitochondrial MDH (m-MDH), and the anodal one cytoplasmic MDH (c-MDH), respec tively. During this, hand. cMDH the. development, of ratio. liver. and. of m-MDH. m-MDH gastric and. showed mucosa. c-MDH. marked. increased in. kidney. increase in. in. procedure. remained. heart. muscle.. of development.. constant. through. In. contrast On. the. development.. to other.
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