リンゴ酸脱水素酵素のアイソザイムに関する研究第1編
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(2) 260. 高. 安. 正. 雄 (4). を 使 用 した.. NTB. (Sigma). 0.4mg/ml. (nitro tetrazoriumblue) 第2節. 実 験方法. Ⅰ. 組 織 のMDH活. (5). Na. CN.. (6). phosphate. (7). 蒸 溜水. (0.1M) buffer. 1ml (PH=7.4). 3ml. 性 及 び ア イ ソザ イ ム 測 定 法. 1) 組織抽 出液 の作製 組 織 片 は一 旦deep. 全 量15mlと. す る.. 4.5醋. 酸 々性 液. 染色原 理. freezerに 入 れ,凍 結 させ た後. 取 出 し,蒸 溜 水 数 滴 を 加 え,急 速 に融 解 させ た.こ れ は細 胞 及 び ミ トコ ン ド リアを 破 壊 し易 くす る た め で あ る.組 織 片 は細 片 と し湿 重 量 で10%と. な る様1/4. M庶 糖 液 を 加 え,氷 水 で 冷 却 しな が らテ フ ロ ン ホモ ジ ナ イザ ーを 用 い, 5分 間,十 分 に ホ モ ジ ナ イ ズ し た.こ の 粗 抽 出液 を3000r.p.m.で15分 も の の上 澄 液 をMDHの. 活 性,及. 間遠 沈 した. び ア イ ソザ イ ム測. 赤血 球 は,血 清 を 分 離 した 後, 3回 生 理 的食 塩 水 で 洗 滌 し,凍 結 融 解 を 繰 り返 し溶 血 させ た もの を 用. 2) 組織MDH活. 用 した.基 質 に オ キ ザ ロ醋 酸(シ 1分 間 にNADH(シ. グ マ 杜 製)を 用 い,. グ マ社 製)の. 吸光 度 が0.001減. 少 す る と き の 活 性 を1単 位 と して,組 当 りに 換 算 し た も の をspecific (Wro'blewski単. 織 湿 重 量1g. activityと した.. 位)赤 血 球 の 場 合 は ヘ モ グ ロ ビ ン. りに 換 算 した. 組 織MDHア. 衝 液(PH=8.4イ. mmの. ア イ ソザ イ ム は 泳 動 に よつ て6分 画 に分. か ら順 に, MD1, MD2, MD3, MD4, MD5, MD6と た.各. MD3は. 命名し. 分 画 を 同時 に 泳 動 した ヒ ト血 清 蛋 白 の 各分. 画 と 比 較 した と こ ろ, MD1, βグ ロ ブ リ ン, MD4は. MD2は. γ グ ロブ リン,. α2グロブ リン, MD5. は α1グロ ブ リン〜 ア ル ブ ミ ンに,. MD6は. ア ル ブミ. ン 〜 プ レア ル ブ ミ ンに 夫 々相 当 した.(図1) 図1. 正 常 ヒ ト血 清 蛋 白 とMDHア. イ ソザ イム. の電 気 泳 動 パ タ ー ンの 比 較. イ ソザ イ ムの 測 定 法. ア イ ソザ イ ムの 分 離 に はWiemeの 泳 動 法3)を 用 い た.即. 570mμ の 波 長 の フ ィル ター を用 い,. 各 分 画 の 濃 度 を 測 定 後 百 分 比 を 計 算 した.. け られ る が 各 分 画 を 陰 極 側 に最 も早 く泳 動 す る もの. 性の測定法. 活 性 測 定 に は,島 津 ベ ック マ ン型 分 光 々度 計 を 使. 0.8%の. 京 光 電 製)で,. MDHの. い た.. 3). イ ソ ザ イ ム分 画 は紫 色 調 を 呈 した.固 定 した標 本 は デ ッキ グ ラス に 載 せ 乾 燥 させ た後,光 電 濃 度計(東. 定 に供 した.. 1g当. 染 色 の 完 了 した寒 天 ゲ ル は, PH. に 黄 色 調 が な くな り,透 明 に な る ま で 浸 した.各 ア. 寒 天ゲル電気. ち,支 持 体 に は ベ ロ ナ ー ル緩 オ ン強 度 μ=0.05)に. 割 に 溶 解 した もの を,デ. 寒天 末を. ッキ グ ラ ス上 に2. 厚 さの ゲ ル と した も の を 用 い た.. この ゲ ル の ほぼ 中 央 に 幅1mm,深. さ1mm溝. を. 切 り,濾 紙 片 で 水分 を 十 分 に 吸 い とつ て お き,組 織 抽 出液 を 皮 内 注 射 針 で20滴,注 Vで,. 入 した もの を 直 流80. 1時 間 泳 動 した.電 気 泳 動 は 寒 天 ゲ ル を 石油. エ ー テ ル に 浸 し,氷 室 中 で 行 つ た. ア イ ソザ イ ム発 色 検 出 に は下 記 の処 方 に よ る染 色 液 を 使 用 し,光 を 遮 ぎ り,水 浴 中 で, 38℃. 40分 間. 染 色 した.. 基質染色液組成 (1) (2) (3). リ ン ゴ 酸 ソ ー ダ(東 NAD PMS. Ⅱ 京 化 成). (Sigma) (Sigma). (phenazine methosulfate). 100μM/ml 0.3mg/ml 0.2mg/ml. MDHア. イ ソザ イ ム の細 胞 内 局 在性. 新 鮮 な ヒ ト心 筋,及. び肝 組 織 片 を 細 片 と し,テ フ. ロ ンホ モ ジ ナ イザ ー を 用 い,氷 冷 下 で0.88M庶 液 に10%の 10mlを. ホ モ ジ ネ ー トと した.こ. 糖. の ホ モジネー ト. 先 づ,冷 凍 下 で600G〜300Gで10分. 間遠沈.
(3) リ ン ゴ酸 脱 水 素 酵 素 の ア イ ソザ イ ム に関 す る 研 究. を 行 い,核. い で 高 く,剖 検 体 に よ る活 性 の変 動 は な くて,一 定. 及 び 未 破 壊 細 胞 を 除 き次 い で, 24000G. で30分 間 遠 沈 上 清 を 可 溶 性 分 画(細 胞 質 分 画)と た.沈 渣 は0.88M庶. 糖 液10mlに. し. 懸 濁 し再 び24000G. した活 性 を示 した.膵 で は 剖検 体 に よ り変 動 が 大 き い.成 熟 赤 血 球 に は ミ トコ ン ドリア が 存 在 せ ず,. で30分 間 遠 沈 した.. TCAサ. 本 操 作 を2回 繰 り返 して,得. た沈 渣 の ア セ トン乾. 燥 粉 末 よ り,蒸 溜 水1mlで20分. 261. イグ ル も存 在 しな い と さ れ て い るが,比. 高 いMDH活. 間酵 素 を 抽 出 し,ミ. 較的. 性 が 認 め られ た.(図2) 図2. 各 臓 器 のMDH活. 性. トコ ン ドリア分 画 と した.こ の 際,ア セ トン処 理 を しな い 沈 渣 よ り抽 出 液 を 少 量 作 製 し,未 処 理 ミ トコ ン ドリア分 画 と した.夫. 々の 分 画 よ り既 述 の 方 法 に. よ りザ イ モ グ ラム を 作 製 し各 分 画 を定 量 した.ミ コ ン ド リア の 分 離 法 は, Hogeboom. 方法4)に 基 づ き超 遠 沈 機 は,日 立40P型 Ⅱ. PHのMDHア. ト. & Schneiderの を 使 用 した.. イ ソザ イ ム に 及 ぼ す 影 響. 前 記 の 基 質 染 色 液 中 の リン ゴ酸 ソ ー ダ及 び 燐 酸 緩 衝液 を 夫 々, PH. 6.4及 びPH. を使 用 し,染 色 液 をPH. 9.0に 調 製 し た も の. 6.4及 びPH. た.心 筋 及 び 腎 の 組 織 抽 出液(ホ PH 6.4, 9.0の2種. 9.0に 補 正 し. モ ジ ネ ー ト)よ り. の染 色 液 を 用 い て,各. グ ラムを 作 製 し,各 分 画 を 定 量 し, PH. 々ザ イ モ. 7.4の 染 色. 液 を用 い た 場 合 と比 較検 討 した.. Ⅳ 染色 液基質濃度 のMDHア. イザ イムに及ぼす. 影響 前 記 処 方 の 基 質 染 色 液 中,リ μM/mlと. ン ゴ酸 ソー ダ を20. した も の,及 び500μM/mlと. 種 の染 色 液 を 調 整 し,心 筋,腎. した も の, 2. 組 織 のMDHザ. イモ. グ ラム を 作 り,各 分 画 を 測 定 し,リ ン ゴ酸 ソー ダ の 濃度100μM/mlの Ⅴ. PCMB. もの と比 較 した.. のPCMBを. (parachlormercuribenzoate)のMDH. 加 え40℃,. 用 い, MDHザ. 5時 間incubateし. 図3. た もの を. イ ソザ イ ム を. 同 時 に 作 製 し,参 考 と した. MDHア. イ ソザ イ ム の 耐 熱 性. 心 筋,肝 組 織 抽 出 液(ホ 分 間 熱 処 理 した後MDHア. モ ジ ネ ー ト)を50℃. 30. イ ソザ イ モ グ ラム を 作 製. 各 分 画 を定 量 した.. 第3章 第1節. 実験成績. 各臓器のMDH活. ヒ トの 臓 器MDH活. 性. 性 で は,心 筋 で 最 も高 く,他. 臓 器 と の 間 に 大 き な 相 違 が み られ る.次 い で 活 性 は 肝 で高 いが,肝. で は 測定 に 用 い た 剖 検 体 に よ り活 性. にか な り変 動 が み られ た,骨 骼 筋,腎. 著 し く高 く,次. イソ のパ ター. い でMD5が. 高 い.(図3). 定 量 した.乳 酸 脱 水 素 酵 素 の ア イ ソザ イ モ グ ラ ム も. Ⅵ. イソザイム. の分 画 が 認 め られ た が,そ. ンの特 徴 と してMD3が. モ ジ ネ ー ト)に1mg/dl. イモ グ ラム を 作 製,ア. 各 臓 器 のMDHア. ザ イム に は6つ. ア イ ソザ イ ム に対 す る阻 害 作 用. 心 筋,腎 組 織 抽 出 液(ホ. 第2節. 寒 天 ゲ ル電 気 泳動 法 に よ り,心 筋 のMDHア. は これ らに 次. 心 筋 のMDHア. イ ソザ イ ムパ タ ー ン.
(4) 262. 高. 腎 で も6分 画 が認 め られMD3が. 安. 支配 的な 分 画 で. あ つ た が,比 較 的心 筋 に 似 た パ タ ー ンが 得 られ た. (図4). 正. 雄. は,. MD4〜MD6が. も多 く, MD1は (図5,. 図4. 腎 のMDHア. 欠 くこ と. 6). イ ソザ イ ム パ タ ー ン 図5. 骨 骼 筋 はM.. 著 し く低 くて, MD6を. 前 者 に比 べ て高 い 比 率 を 示 し た.. pect. maj,とM.. rect. abd.に. M.. pect. maj.のMDHア. イ ソ ザ イ ム パ タ ー ン. ついて測. 定 を 行 つ たが 両 者 の パ タ ー ンに は 有 意 の 差 が 認 め ら れ た.即. ちM.. め ら れ,心 rect. abd.で 図6. M.. pect. maj.で. は 多 く の 場 合6分. 画が認. 筋 に 似 た パ タ ー ン を 示 す の に 対 し, M. は,. 6分 画 を 認 め る こ と も あ る が,多. rect. abd.のMDHア. く. イ ソ ザ イ ム パ タ ー ン. 肝 で は6分 画 を 認 め る こ と が 多 く, MD6がMD3 と ほ ぼ 同 程 度 の 比 率 を 示 し たが, MD4, MD5は す る こ と も あ り,ま たMD1は. 比 較 的高 い 比 率 を 示. した.(図7) 図7. 肝 のMDHア. 欠如. イ ソザ イ ム パ ター ン.
(5) リンゴ酸脱 水素酵 素の アイ ソザ イムに関 する研究 膵 で は 肝 と同 じ くMD6とMD3が. 同程 度 の 比 率 を. が, 50例 で はMD3,. MD6の2分. 263 画 が 認 め られ た に過. 示 すが, 14例 中7例 に お い て は6分 画 は み られ ず,. ぎ な い.ま た 胃の 部 位 に よ るパ ター ン の 相違 は認 め. 2分 画(MD3とMD6)が. られ な か つ た(図9,. 認 め られ た に 過 ぎ な い.. 10, 11).. (図8) 図8. 膵 のMDHア. イ ソザ イ ム パ タ ー ン. 図9. 胃 粘 膜(小 彎)のMDHア. イ ソザ イム パ タ ー ン. 胃粘 膜 は 手 術 切 除 胃 よ り,部 位 別 に 採 取 して 凍 結 融 解 す る こ とな く,ホ モ ジ ネ ー トを 作 製 した もの を 測定 に供 した. 54例 中4例 に6分 画 が,認 図10. 胃 粘 膜(大. 彎)のMDHア. め られ た. イ ソザ イ ム パ ター ン. 図11. 胃粘 膜(幽 門部)のMDHア ムパター ン. イ ソザ イ.
(6) 264. 高 図12. 肺 のMDHア. イ ソザ イ ム パ タ ー ン. 安. 正. 雄 肺 で は7例 中3例 に6分 画 が 認 め られ4例. て は, MD3が. に おい. 認 め られ た に過 ぎな か つ た(図12).. リンパ 腺 に は7例. 中1例 の み に6分 画 が認 め られ,. 6例 に はMD3とMD6の2分. 画 の み が 検 出 さ れ た.. MD6の 比 率 は,心 筋,腎,骨. 骼 筋 と,肝,膵. の 中間. の 値 を示 した(図13). 脾 で は15例 中5例. に6分 画 が 認 め られ た が,他 の. 例 に お い て は, MD3とMD6の2分. 画 が 認 め られ た に. 過 ぎ な い(図14). 赤 血 球 はMD3,. MD4, MD5の3分. あ り, MD1, MD2, MD6の 白血 病 細 胞 のMDHア. イ ソザ イ ムパ タ ー ンで は5. 例 全 例 に6分 画 が 認 め られ,そ. 図15 図13. リ ン パ 腺 のMDHア. 図14. 脾 のMDHア. 画 を 有 す るのみ で. 分 画 を 欠 く(図15).. 赤 血 球 のMDHア. の パ ター ン は心 筋,. イ ソザ イ ム パ タ ー ン. イ ソザ イ ム パ ター ン. イ ソザ イ ム パ ター ン. 図16. 白血 病 細 胞 のMDHア. イ ソザ イ ム パ ター ン.
(7) リン ゴ酸 脱 水 素酵 素 の ア イ ソザ イ ム に 関 す る研 究. 腎の そ れ に 似 る(図16). 大 脳 皮 質 で は3例 中全 例 に6分 MD6の 比 率 は心 筋,腎. 画 が 検 出 され た が,. よ り高 く,肝,膵. よ り低 い. 265. 器 共6分 画 が 染 色 さ れ,夫 々 のパ ター ンは ホ モ ジ ネ ー トの も のに 類 似 した が ,両 者 共 や やMD6の 比率 に 上 昇 が み られ た(図18). 第4節. 値 を示 した(図17).. PHのMDHア. イ ソザ イ ム に及 ぼ す. 影響 図17. 大 脳 皮 質 のMDHア. イ ソザ イ ム パ ター ン. 心 筋 と腎 の ザ イモ グ ラム 作 製 の た め の 染 色 液 の PHを6.4と. す る と, MD3とMD6の2分. 画が認 めら. れ た に過 ぎな い. PH. 9.0の 場 合 で は心 筋,腎 共 に6分 画 を 示 し そ. のパ ター ンに はPH. 7.4の 場 合 と の 間 に 有 意 の 差 が. 認 め られ な か つ たが,染 色 液 中に 夥 し い 還 元NBT 粒 子 を 生 じ,紫 色 に 混 濁 して,標 本 全 体 が 紫 色 に着 色 した.従 つ て 至適PHは7.4附. 近 で あ る と考 え ら. れ た.. 第5節. 基質濃度 のMDHア. イソザイム に及. ぼす影響 20μM/mlの. リン ゴ酸 ソー ダ を 基 質 に 使 用 した 場 合. は, 100μM/mlの. 濃 度 の もの を 使 用 した もの と比 較. してMD1〜MD5特 し, MD6の. にMD3の. 活 性 が 低 下 し これ に 比. 活 性 上 昇 が観 察 され た. 500μM/mlの. 基. 質 を 使 用 した場 合,心 筋,腎 共 そ の ア イ ソザ イ ムパ タ ー ン は100μM/mlの. 第3節. MDHア. イ ソザ イムの細 胞内局在性. 心 筋及 び 肝 の ミ ト コ ン ド リ ア分 画 の ア セ トン乾 燥粉 末抽 出液 に はMD1〜MD5が は欠 如 した.ア. 検 出 され た が, MD6. セ トン処 理 を 行 わ な い,ミ. リア分 画 に はMD1〜MD5が. 強 い が, MD6も. 認 め られ た.細 胞 質 分 画(可 溶 性 分 画)で 図18. MDHア. トコ ン ド. 基質 を用いた場合 の分 画 とほ. ぼ 一 致 した(図19). 図19. 基 質 濃 度 のMDHア A.. 心 筋(左)及. イ ソザ イ ム に 及 ば す 影 響. び 腎(右)の. に お け るMDHア. 基 質 濃 度20μM/ml. イ ソザ イ ム パ タ ー ン. 僅 かに は,両 臓. イ ソザ イ ム の 細 胞 内 局 在 性. 第6節. PCMBのMDHア. イソザイ ムに及. ぼす影響 心 筋 及 び 腎 の ホ モ ジ ネ ー トをPCMBで MD1〜MD5の5分. 処理す ると. 画 は 検 出 され る が, MD6は. 消失 し.
(8) 266. 高. た.一 方 対 照 と して 測 定 したLDHア. 安. イ ソザ イ ム は 全 く. 雄. 臓 器 に分 布 し,こ と に心 筋 に 多 量 に含 まれ,肝, 骨 骼 筋,腎. 検 出 さ れ な くな つ た(図20). 図20. 正. PCMBの 心 筋(左)及 ぴ 腎(右)MDHア ム に 対 す る 阻害 作 用. イ ソザ イ. に も多 い と され て い る9)が,こ れ は. 今 回 著 者 が ヒ トの 組 織 に つ い て 測 定 した成 績 と よ く一 致 す る.即 ち,心 筋 に 最 も高 く,肝,骨 骼 筋,胃 粘 膜,腎,膵. の順 で あ つ た が,赤 血球. に も比 較 的高 い 活 性 が 認 め られ た.肺,脾,リ ンパ 腺 は 著 し く低 い 活 性 を示 した .肝,膵. の活. 性 にバ ラつ きが 目立 つ の はautolysisに. よるも. の と 考 え られ る. MDHの. ア イ ソ ザ イ ム は1958年,. よ り,ヒ. ト血 清 中 に 発 見 さ れ た.. ctrophoresisに. よ り,単. 出 し, MDHを. 抽 出 し て,各. 分 画 が 認 め ら れ,. 第7節. MDHア. 心 筋 及 び肝 の ホ モ ジ ネ ー トを50℃ と, MD1〜MD5の5分. 30分 間 熱 処 理 す る. 画 は 検 出 され る がMD6は. 失 活 し. ま た,. MDHア. イ ソザ イ ム の耐 熱性(50℃. 30分 熱 処 理). 3つ の α2 Glb.,. 間 に 存 在 し,心. 筋梗塞. 活 性 の 上 昇 と 共 に5つ Peakの. 活 性 が,著. の分. 明 に上 昇 す. る と い わ れ る.. た(図21). 図21. βGlb., 26%は. α1Glb.とAlb.の. 画 が 出 現 し,α1. ele. 分 画 の 定 量 を行 つ. 常 人 血 清 で は,. 46%は. の と き 血 清MDHの. イ ソザ イ ム の耐 熱 性. starchgel. 位 幅のブ ロックを取 り. た 彼 の 成 績 に よ る と,正. 28%は. Vesell等2)に. Lowenthal10)等. phoresisに. よ り,羊. は,. starchgel. の 脳 に は6分. clectro. 画 のMDHア. イ ソ ザ イ ム が 存 在 す る こ と を 認 め,陰 番 目 の 分 画 に 最 大 活 性 が あ り,全. 極 よ り3. 体 の2/3を. 超. え る こ と を 報 告 し た.. 一 方MDHに MDHが. は抽 出 の 難 易 に よ り2つ の型の. 存 在 す る こ とがDelbruck11)等. ッ トの 肝 及 び子 宮 のEpitheliomaを ら か に され,夫. 々細 胞 質 と ミ トコ ン ドリアに存. 在 す る こと が 確 か め られ て,細 MDH,ミ MDHと. 呼 ば れ た.こ. れ 等 はThorne12)に よ り. さ れ,. び,. Wolfe7)等. Thurnberg6)に に よ つ て,. 即 ち, m‑MDHはAmberlite樹 &. Stern. よ り夫 々独 立 に 発見 1956年. ブ タ心 筋 よ り 純. 補 酵 素 と し て,. l‑リ. ン ゴ酸 の 脱. 水 素 に よ る オ キ ザ ロ 醋 酸 の 生 成 を 触 媒 す る が,そ 他 メ ゾ 酒 石 酸 に も 作 用 し て, acid. dehydrogeneseと. α‑hydroxy. の. dicarboxylic. も い う こ と が 出 来 る が8),. d‑リ. ン ゴ 酸 に 対 し て は 全 く酵 素 活 性 を 示 さ な い と さ れ て い る.. ま たMDHは. 脂 にc‑MDHはDEAE. セ ル ロ ー ズ に よつ て 別 々に 捕 捉 され,ま (PH 8.6)に. よつ て もm‑MDHは. に 対 し, c‑MDHは. た電気 泳動. 原 点 に と どまるの. 陽 極 に 移 動 して,明. らか に 異 つ. た 性 質 を示 す こ とが 認 め られ た.. 粋 な 非 結 晶 性 の も の と し て 取 り 出 さ れ た. MDHはNADを. ロ マ トグ ラフ ィー上 で. 明 らか に異 つ た 態 度 を 示 す こ とが 明 らか に され た.. 総括 並びに考按. リ ン ゴ 酸 脱 水 素 酵 素(MDH)はBatelli (1910)5)及. 胞質MDHはc‑. トコ ン ドリア に 存 在 す るMDHはm‑. 更 に詳 し く検 索 され,ク. 第4章. に よ りラ. 使 用 して 明. そ の 後 牛 心 筋,ブ タ心 筋 のc‑MDH,. 精製. す る こ と に よ り,更 に 詳 細 に 研 究 が 行 わ れ た.13)14) 15)16)こ れ 等 の報 告 に よ る と , m‑MDHはc‑MDHに 比 し分 子 量 が 大 き くて,約62000で. あ り,高 濃度の. リン ゴ酸 に よ り,阻 害 され ず,か. え つ て賦 活 される. が,オ 従 来 の 報 告 に よ る と殆 ん どす べ て の. m‑MDHを. キザ ロ醋 酸 の 濃 度 が 上 昇 す る と阻 害 され る.. 電 気 泳 動 を 行 う と, c‑MDHよ. り陰 極 側 に 泳動 され,.
(9) リン ゴ 酸脱 水 素 酵 素 の ア イ ソザ イ ム に 関 す る研 究. 等 電 点 が 小 さい. PCMBに. よ り,オ キ ザ ロ醋 酸 を 基. 267. 下 は 認 め られ るが,失. 活 す る に は 至 らな か つ た.但. 質 に す る と き は完 全 に阻 害 さ れ る.ま たm‑MDHは,. し,耐 熱 性testに 使 用 す る酵 素 標 品 が 純 粋 な もの で. c‑MDHに. な く,組 織 粗 抽 出 液(crude. 比 し,ア. スパ ラギ ン酸,ト. ミ ノ酸 組 成 で,ア ル ギ ニ ン,ア リプ トプ ァン を多 く含 み, 1/2シ. ス チ ンを1分 子 に12個 持 つ とい わ れ る. これ に対 し, c‑MDHは,分. で,他. 結. ミ トコ ン ドリア分 画 に 由 来 す る. も の で,上 清 分 画 中 に認 め られ るMD1〜MD5はcon. 晶 と して取 り出 され て お り15),高 濃 度 の リン ゴ酸 に. taminationに よ る も の と考 え て,(後. よ り阻害 さ れ るが,オ. をm‑MDH,. キ ザ ロ醋 酸 に よ つ て は 阻 害 さ. れない17).電 気 泳 動 に よ り,陽 極 側 に移 動 し, PCM. あるの. の 因子 の 混 入 も否 定 は 出 来 な い.以 上 の 結 果. よ り, MD1〜MD5は. 子 量 が 約52000で. homogenate)で. MD3の. MD6をc‑MDHと. 述)MD1〜MD5. 結 論 し た.. み を 認 め る場 合 は試 料 の 活 性 の低 い場 合 で. Bに よつ て,オ キ ザ ロ醋 酸 を 基 質 とす る と き は 余 り. あ る こ とが 確 認 さ れ, MD1,. 阻害 され な い.構 成 ア ミノ 酸 で は,グ. 性 が 低 く検 出 さ れ な い か ま た は 失 活 し た も の と考 え. リシ ン,プ ロ. MD2,. リン,ス レオ ニ ンを 多 く含 み, 1分 子 中 に6個 の1/2. られ る.従 つ て, m‑MDHは. シス チ ンを 有 す る.. 画 に 分 れ る も の と考 え ら れ る.こ. 以 上 の如 く,従 来MDHア. イ ソザ イム は 主 と して. の ブ タ心 筋m‑MDEに. 生 化学 者 の手 で 研 究 され,臨. 床 応 用 を 目的 と した 研. m‑MDHがMD1〜MD5,. 究 は きわ め て 少 い.即. ち 臨 床 的 研 究 と して は, 1962. 年Yakulis18)等 に よ り, MDHア. イ ソザ イ ム の 分 離. が寒天 ゲ ル電 気 泳 動 法 に よ り試 み られ,死 後8時. 間. MD4,. MD5は. 活. 活 性 の高 い場 合 は5分 れ は, Kaplan20). つ い て の所 見 と一 致 す る. c‑MDHがMD6に. 相当す. る とす る と,超 遠 沈 操 作 に よ り得 た 細 胞 質 分 画 中 に m‑MDHが. 多 量 に 検 出 さ れ るの は如 何 な る理 由 に よ. る もの で あ ろ うか.ホ モ ジ ネ ー ト作 製 中,あ. るい は,. の剖 検組 織 の ホモ ジ ネ ー トに つ い て, 4分 画 のMDH. 超 遠 洗 操 作 中 に ミ トコ ン ドリア が 損 傷 を 受 け, m‑M. ア イソザ イム が 検 出 さ れ た が,臓 器 特 異 性 は 認 め ら. DHが. れなかつ た と い う報 告 を み る に す ぎ な い.. 可 能 性 は 十 分 に考 え られ る.. Yakulisは ま た,血 清MDHア. イ ソザ イム に つ い て. も測定 した が 一定 の 傾 向 を認 め て い な い.. ト諸 臓 器 の ア イ ソザ イ ム の 検 索 を 行 つ た結 果,心. の例 に, 6分 画 のMDHア 肺,リ. ンパ 腺,脾. 筋,. 血 球 に お い て,大 多 数 イ ソザ イ ムが 認 め ら れ,. に お い て は2〜6分. 大 部 分 に2分 画,少 数 で6分. 画 が,胃. では. 画 が 検 出 され た.赤 血. 球 で は3分 画 が 認 め られ た.. け る こ と が 出 来 る が,. layerミ light. トコ ン ド リ ア に 分. layerミ. トコ ン ド リア は. 破 壊 さ れ た ミ トコ ン ド リ ア よ り な る と い わ れ て い る. ミ ト コ ン ド リ ア は 更 に, (ETP)及. び,. electron. phospholyrating. ticle (PETP)に. transfer. electron. 分 解 出 来 る が,こ. particle. transfer. イ. よ りみ て も,操. par. のsubcomponent. は リ ン ゴ 酸 を 酸 化 す る こ と が 出 来 る21).以. ヒ ト諸 臓 器 に お い て お お む ね6分 画 のMDHア. 起す. 事 実 ミ ト コ ン ド リア は そ の 比 重 に よ り, light layer ミ ト コ ン ド リ ア とheavy. 本 実験 に お い て,寒 天 ゲ ル電 気 泳 動 法 に よ り,ヒ. 腎,骨 骼筋,肝,膵,脳,白. 漏 出 し,細 胞 質 分 画 にcontaminationを. 上 の事 実. 作 中 に 漏 出 し たm‑MDHに. よ り,. ソザ イ ムが 検 出 され る こ と を確 か め た ので 続 い て,. 細 胞 質 分 画 が 汚 染 され て い る と考 え る の が 妥 当 で あ. MDHア. ろ う.更. イ ソザ イム の 細 胞 内局 在 性 に つ い て 実 験 を. 行 つ た.ミ. トコ ン ドリア分 画 に は, MD1〜MD5迄. め られ, MD6を. 認. 欠 い た が,細 胞 質 分 画 で はMD6に. 比 し, MD1〜MD6の. 濃 度 が低 い が, 6分 画 が 検 出 さ. に ア セ トン 処 理 を 行 わ な い ミ ト コ ン ド リ ア. がc‑MDHを. も つ こ と はc‑MDHが. の 表 面 にlooseに. PHの. ミ トコ ン ド リ ア. 付 着 し て い る と い う 推 定 を 許 す.. 影 響 に 関 す る実 験 で はm‑MDHとc‑MDH. れ た.ま た ミ トコ ン ド リアを ア セ トンで 処 理 しな い. の 間 に差 は 認 め られ な か つ た. PH6.4の. で,ア. 色 時 間 を延 長 して も,十 分 な 濃 度 のザ イモ グ ラムが. イ ソザ イ ムパ ター ンを 測 定 す る と, 6分 画 が. 得 られ た.ミ. トコ ン ド リア よ り脱 水 素 酵 素 を 抽 出 す. る方 法 はDrysdale ま たPCMB阻 MD1〜MD5迄. & Lardy19)に. 害 をMDHア. よ る もの で あ る.. イ ソ ザ イ ムに 適 用 し,. は 阻害 さ れず, MD6が. 完 全 に 阻 害 され,. 失 活 す るこ と を 観 察 して い る. MDHア の耐 熱 性 に つ い て み ると, 50℃ よ り. MD6は. イ ソザ イ ム. 30分 間 の 熱 処 理 に. 失 活 す るが, MD1〜MD5は. 活 性 の低. 場 合,染. 得 られ ず,反. 応 速 度 の 低 下 の た め と考 え られ, m‑. MDHは5分. 画 に 分 れ な か つ た. PH9.4に. お ける. 実 験 で も各分 画 の 染 色 が遅 延 した が, m‑MDHは5 分 画 に 分 れ,各. 分 画 の 比 率 はPH7.4の. 場合 の比率. と異 な ら な か つ た. 基 質 濃 度 を20μM/mlと と比 べ, m‑MDHの. す る と, 100μM/mlの. 時. 染 色 が 遅 く,反 応 速 度 の 低 下 が.
(10) 268. 高. 考 え られ, c‑MDHで. 安. は や や 活 性 の上 昇 が 認 め られ. た.従 つ てm‑MDHのc‑MDHに. 対 す る比 率 が 低 下. す る.基 質 濃 度 を500μM/mlと. し た場 合 は100μM/. 正. 雄. MDHの. 比 率 が 接 近 して い る.即 ちc‑MDHの. が 高 い グ ル ー プ で あ る. 第3の. グル ー プ は,こ れ 等 の 中間 に位 置 し,脳,. mlと した 時 の 比 率 と変 らな い.こ の 事 実 は 既 に 牛. リンパ 腺,脾,胃. 心 筋m‑MDH及. 率 も 中間 の 値 を 示 す.. びc‑MDHを. て い る15)が. 用 い て十 分 に確 立 され. ヒ トの 場 合 に もあて は ま る もの と思 わ. 比率. 粘 膜 が これ に 入 り, c‑MDHの. 赤 血 球 に は, c‑MDHと. 比. 思 わ れ る も のが 認 め られ. な い の で 第1グ ル ー プ に入 れ る こ と も出来 よ う.赤. れ る. 以 上 の 実験 成 績 に よ つ て, MDHの. 関与す る 触媒. る こ と を考 え る と興 味 深 い.. 反 応 式 は 次 の 様 に表 現 す る こと が 出 来 る. 1). 心 筋,骨. l‑リ ンゴ 酸 → オ キ ザ ロ醋 酸 +NAD←+NADH2 オ キザ ロ 醋 酸 →l‑リ +NADH2←+NAD. コ ン ド リ ア に はcristaeが. ンゴ酸. る.. c‑MDH. 22)23)24)ミ. 多 い が,肝. の ミ ト. 少 い こ とが 知 ら れ て い. ト コ ン ド リ ア のcristaeはTCAサ. イ. ク ル と密 接 な 関 係 を 有 す る も の と 考 え られ て い る の. 又 これ 等 の 結 果 か ら生 体 に お け る リ ンゴ 酸 の 代 謝 に 関 して はKaplanの. 骼 筋 で に ミ トコ ン ド リ ア の 数 が 多 く,ま. た ミ トコ ン ド リア に もcristaeが. m‑MDN. 2). 血 球 に は ミ トコ ン ドリア が 認 め られ な い と され て い. 述 べ て い る如 く,一 つ の サ イ. クル を 仮 定 す る こ と が 出来 る.. で25),こ. の よ う なMDHア. イ ソザ イムパ ター ンの違. い が 形 態 的 な 相 違 と も よ く一 致 し て い る こ と は 興 味. 深 い.な お 機 能 の上 か ら も肝,膵. で は物 質 相 互 の. 代 謝 が 活 溌 で 前 述 の ミ トコン ドリア,細. 胞質 間 の. schuttleに よ り,化 学 的 エ ネ ル ギ ー が 有 効 に使 用 さ れ て い る もの と考 え られ る.一 方 心 筋,骨 骼 筋 で は 化学 的エネルギ→ 的 エネルギ. 力学 的 エ ネ ル ギ ー,腎 で は化学. →物 質 のactive. transportが 主 た る任. 務 で あ る. 肝,膵 この サ イ クル の重 要 な点 は,リ 醋 酸 が,ピ. ン ゴ酸 と オ キ ザ ロ. リジ ン補 酵 素 の 細 胞 質 と ミ トコ ン ド リア. の ザ イ モ グ ラ ムを 作 製 中, c‑MDHに. す るMD6の. 濃 度 がMD1〜MD5を. あ る い はMD3の. 相当. 加 算 した もの,. 濃 度 に比 し,変 動 の大 き い ことが. 間 の水 素 運 搬 に 寄 与 して い ると い う こ とで あ る.細. 観 察 さ れ た が,各 分 画 の 百 分 比 と,総 活性 に よ り,. 胞 質 に 存 在 す るNADHは. MD6及. さ れ,リ. ン ゴ酸 を作 り,リ ン ゴ酸 は ミ トコ ン ド リア. 内 に 入 り, m‑MDHと NADに. オ キ ザ ロ醋 酸 に よ り酸 化. ミ トコン ドリア に 結 合 し た. よ り,オ キ ザ ロ醋 酸 とな り, NADHを. 生成. す る.オ キ ザ ロ 醋 酸 は 再 び,細 胞 質 に 帰 り,別 NADHに. よ り還 元 され る.こ. う して 細 胞 質 のNADH. の 水 素 は ミ トコ ン ドリア に運 ば れ,ミ のNADHの. の. 呼. 生 成 と 共 軛 し得. る. MDHア. れ て 来 たが18),臓 器 別MDHア. イ ソザ イ ムを 注 意 深. も, c‑MDHはm‑MDHに. 下 で あ る.而. 酵 素 を 機 能 の 上 か ら 分 類 す る と,生. enzymeと,条. 件 に よ り 変 動 し,代. るregulatory. enzyme25)に. 験 成 績 よ り, c‑MDHは regulatory. 須 田26)は. 骼 筋,白 血 球,. は10%前 後 を 占 め る の み で あ る. 第2の. グ ル ー プ に は 肝,膵. が 属 し,. 分 け ら れ る が,以. 上 の実. 条 件 に よ り可 成 の 変動 が推 enzymeで. あ る こ と が 推 論 され. は5つ. 白 の. 理 学 的機 能 の 異 な る酵 素群 を. 呼 ぶ こ と を 提 案 し て い る が,こ. 従 う とm‑MDH. う.更 m‑MDHとc‑. 謝調節に あづ か. 同 一 の 化 学 反 応 を 触 媒 す る が,蛋. heterozymeと. 大 き な 比 率 を 占 め, c‑MDH. 体 に十 分 に存. る.. る. グ ル ー プ に は 心 筋,腎,骨. 比 し. 件 に よ る 活 性 の 変 動 の 少 いconstitutive. 物 理 的 性 状 及 び,生. 第1の. あ るの に, MD3は. 常 に低 率 で あ る.. く検 討 す る と, 3つ の グ ル ー プ に分 け る こ とが 出 来. 肺 が 属 し, m‑MDHが. の 散布 度 を変 異係. 10%以. 定 さ れ,. イ ソザ イ ム に は 臓 器 特 異 性 は な い と い わ. 活 性 を求 め,そ 30〜45%で. 在 し,条. トコン ド リア. 濃 度 が 上 昇 す る.こ のm‑NADHは. 吸 系 酵 素 に よ り 酸 化 さ れ, ATPの. びMD3の. 数 で表 わ す と, MD6. c‑MDHはheterozymeで,. れ に m‑MDH. の ア イ ソザ イ ム に分 れ る と い う こと も出来よ にc‑MDHは,. regulatory. cnzyme,. m‑MDH. は 細 胞 の 基 本 的 要 求 を ま か な つ て い るconstitutive.
(11) リン ゴ 酸 脱 水 素 酵 素 の ア イ ソザ イ ム に関 す る研 究. enzymeで. あ ろ う.. 同 様 の こ とは,他. 画 が 検 出 さ れ た.. の酵 素 で も認 め られ る.即. ち,. ヘ キ ソキ ナ ー ゼ と グ ル コキ ナ ーゼ はheterozymeで あ り,グ ル コキ ナ ー ゼ がregulatory. enzymeと. なつ. 3). MD1〜MD5はm‑MDH,. 4). m‑MDHと,. てい る27).こ の よ うな 例 は他 に も見 出 され て お り, これ か ら代 謝 調 節 機 構 の研 究 が 進 展 す る に つ れ,ま. 類 し た.. イ ソザ イ ム はLDHア. イ ソザ イ ムに 比 し確. かに臓 器 特 異 性 に 乏 しい が, m‑MDHとc‑MDHに. ので,詳 細 な 研 究 を 行 い,疾 患 別 に 検 討 を 重 ね る と 代 謝 の メ カニ ズ ム に迫 る 重要 な デ ー タが 得 られ る も. m‑MDHは MDHは. ミ トコ ン ドリア と 結 合 して お り, c‑. 細 胞 質 に存 在 す る等 の条 件 に よ り,き. れい. な アイ ソザ イモ グ ラム を 作製 す る上 に 困難 な点 もあ るが,今 後 の 努 力 で 克 服 さ れ るで あ ろ う. 血 清MDHア. 筋,腎,骨. イ ソザ イ ム の 研 究 に も こ う した 困 難. 第3グ 脾,胃. ル ー プ(中. ヒ ト臓器 のMDH活. 結. 語. 度 に よ る変 動, PCMBに. 対 す る感 受 性,耐. 質濃. 熱性等 の. 比 率 がm‑MDHの. そ. ン パ 腺,. リン ゴ酸 → オ キ ザ ロ醋 酸 を 主 と. して触 媒 し, c‑MDHは. 逆 の 反応 を 主 と して 解 媒 す. る も の と 推 論 され た.リ MBはc‑MDHの. ン ゴ酸 を 基 質 と し た 際PC. み を 阻 害 す る. 30分 間 の 熱 処 理 で はc‑MDHの. みが. 失 活 した. 6). MD5及. びMD3の. 活 性 の 散 布 度 を み る と前 者 c‑MDHはregulatory enzymeで. enzyme, あ る もの と 推 定. 擱 筆 す るに 当 り終 始 御 懇 篤 な る御 指 導 と御 校 閲 を 賜 わ つ た 恩 師 平 木 教 授,並. びに 浅 野 講 師 に 深 甚 の 謝. 意 を表 し ます. (本 論 文 の要 旨 は 第12回 臨 床 病 理 学 会 総 会 に お い. 諸 性質 を調 べ た. 活 性 は心 筋 に最 も高 く,肝,骨. 骼 筋,腎,脳. て 発 表 した.). の順 で これ に次 い だ. 臓 器 のMDHア. 少. 性 及 び そ の ア イ ソザ イ ムを 測 定. ると と もに,各 ア イ ソ ザ イ ムの 局 在 性, PH基. 2). c‑MDHが 血 球,肺. さ れ た.. し,各 臓 器 に お け る ア イ ソザ イ ムパ ター ンを 検索 す. 1). く,. 血 球,赤. 間 グ ル ー プ)脳,リ. m‑MDHは. m‑MDHはconstitutive. 第5章. の グル ー プ に 分. 粘 膜.. に 変 動 が 激 し く,. 得 る ことも十 分 に 考 え れ る.. 器. 多. 骼 筋,白. ル ー プ(c‑MDHの. ま た50℃,. が予想 され るが,細 胞 の破 壊 の 度 合 等 の 目 安 に な り. 比 率 に よ つ て,臓. れ に ほ ぼ 等 し い.)肝,膵.. 5). の と期 待 され る.. c‑MDHの. ル ー プ(m‑MDHが. い.)心 第2グ. 分 れ代 謝 調 節 機 構 に関 与 して い る も の と考 え られ る. あ. イ ソ ザ イ ム パ タ ー ン を3つ. 第1グ. すます 多 くの 事 実 が 明 らか に され るで あ ろ う.. MD6はc‑MDHで. る こ と が 確 認 さ れ た.. MDHア. MDHア. 269. イ ソザ イ ム は 多 くの 例 に6分. (文 献 後 掲).
(12) 270. 高. Studies. 安. on Malic. 正. Dehydrogenese. on Malic. Dehydrogenese. of Various. Isozyme. I.. Part. A Study. 雄. Activities. Human. and. Isozymes. Organs. By. Masao Department. of Internal. TAKAYASU. Medicine,. Okayama. University. Medical School. (Director: Prof. Kiyoshi Hiraki). Malic dehydrogenese (MDH) activities and isozymes of various human organs were measured The assays of isozyme were carried out by means of agargel electrophoresis. The highest MDH activity was demonstrated in heart muscle. Liver, skeletal muscle, kidney and brain showed considerably high MDH activities. Six fractions were distinguished in many MDH isozymograms. In order of movility towards the cathod, each MDH isozyme was named MD1, MD2…MD6.. Intracellular tionation,. distribution MD1〜MD5. and. of each were. MDH. confirmed. isozyme. was. mitochondrial,. investigated MD6. by. means. cytoplasmic,. of. cell. frac. in origin.. MDH isozyme-patterns of human organs were divided into 3 groups according to the ratio of mitochondrial MDH (m-MDH) and cytoplasmic MDH (c-MDH). heart muscle, kidney, skeletal muscle, white blood cell, Group I (m‑MDH>c‑MDH): red Group. II. Group. III. blood. liver,. (m‑MDH≒c‑MDH):. cell. and. lung-tissues.. pancreas.. (This group situates between Group I and Group II):. brain,. gastric. mucosa,. and spleen.. Studies on inhibitory effect of p-chlor-mercuri-benzoate (PCMB) on each MDH isozyme and heat stability of each MDH isozyme demonstrated that m-MDH was not inhibited by PCMB and. stable. to. a. also observed. that. According. to. latory. enzyme. and. heat. test. m-MDH the. at. was. standard. m-MDH. 50℃. for. 30,'. activated deviation. constitutive. when. by of. MD6. enzyme,. 1-malate. a high and. was. concentration MD3. respectively.. activites,. used. as. substrate.. It. was. of 1-malate. c-MDH. considered. regu.
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