海藻酸分解酵素（アルギナーゼ）の研究（第一報）

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(1)Title. 海藻酸分解酵素（アルギナーゼ）の研究（第一報）. Author(s). 南波, 哲; 斎藤, 恒行. Citation. 北海道學藝大學紀要. 第二部, 5(1): 70-73. Issue Date. 1954-02. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/5435. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) . ｈ、. ９年２月昭和２. 北海道学嚢大学紀要. 第５巷第１号. ．・. ゼ）の研究海藻酸分解酵素、（アルギナー（第. 、 ′. 南. ．. 波. 一. 哲. 報）斎藤. 亘オデ恒. 北海道学整大学札幌分校化学教室. ｉｉＩ１）ｓａｕｄｅｓ。ｎＡｎａｓｅ（，ｔ。ｓｈｉＮＡＭＢＡａｎｄＴｓｕｎｅｙｕｋｉｓＡＩＴＯ美：Ｓｔｇ. γ. せしめ布片にて絞り、蒸溜水に膨潤し数回洗僻した後稀. 疑酸ソーダ溶液に溶かし櫨紙パルプ層にて吸引滋過す. 裾藻類に多量含有される海藻酸、（アルギン酸）を分解する酵素は大島氏により飽、ぅに、さゞえ等の内臓より. 発見せられ海藻鱗分解酵素（アルギナーゼ）と命名されＩＪ２）其の後濠藤氏のミあめふらしの消化酵素た（１９３１）。１ミ）３ｉの研究ミ。海藻駿分解酵素の生化学的研究ミ及び分解１がある。更にＷａｋｓｍａｎは海水よりアル生成物の研究５６）９３４）。Ｅを報告している（１ｉギン酸を分解する細菌の単廟. アルギン酸の化学構造は多くの研究者によりｄ－マンヌロ）が構成分子であるとされ、こ，のピン酸無水物（ＣＧＨ６. 、 ′. ラノマソヌロン酸の１・４－αグルコシッド結合による直鎖重合体であるポリウロナイドと考えられ第１図の如き構. 造式が輿えられていろり。第１図 . . ．Ｈｔ. アルギナーゼの一般的性質及び酵素作用による分解生 ′. 成物がテトラマンヌロン酸であるとの報告がなされてい）るが鮫その後の研究は二三報告されているに過ぎない８）の一部として行ったア筆者らはウロン酸代調の研究９. ′ｒ. ルギナーゼの精製及び酵素分解過程について報告する。. 実. 験. の肝臓臓部分を. 用いた。先ず原料を充分に磨りつぶした後５倍重量の蒸溜水を加えて２時間抽出する。抽出時間は２時間が適当. でそれ以上の長時間は窒素量に対する酵素力が低下す上澄液を漉紙パルプ層を通してる。抽出液を遠心分離し－吸引滋過し清澄な櫨液をうる。この際に癌過助剤として. 桂藻±を使用して自然櫨過を行う報告もあるがｉ意趣に１. り幅紙が破れ易くなる点が筆者らの実験により明らかになつた。. ’. ′. （Ｂ）酵素作用の測定法酵素作用の測定法には基質アルギン酸ソーダの分解による反感液の粘度降下を測定する方法及び分解生成物即ちウロン酸を定量する方法とがある。. （ｉ）粘度法ｌｄの粘度計を用いる。ｔｗａ通常の粘度測定の如くｏｓ基質の濃度は１％前後を使用する。酵素反感一定時間後加熱により酵素作用を停止せしめて反騰混液１ｏｃｃをとり一定温度にて粘度を測定し粘度降下率で表わす。酵素. （Ａ）材料の調製（１）アルギン酸ソ← ダの調製基質として可溶性のアルギン酸ソーダを使用した。市販のアルギン酸ソーダを蒸溜水に溶解し櫨紙パルプ層を｛. ｉｉｌｔ酵素原料は飽（Ｈａｔｅｏｕｓｇｔｇａｎ. され且溶出し難い点及び内臓に含まれるセルラーゼによ. アルギン酸の化学構造. ｃｕ１Ｃ. （２）酵素液の調製. 時間以上を要する場合には酵素の約６０％が珪藻土に吸着. ｏ。巻ｏ酵。。ｏｔｏｔＩｆｒｒ. る。この操作を反覆、脱色精製しソーダ塩を多量のアルし中にそそぎ脱水、エーテルにて乾燥し白色糸状のコー〉２％。アルギン酸ソ． ← ダを得た。衣分約０．. による粘度の降下は反照の極く初期に著るしく見られる現象であるから作用力の比較に好適であるが反騰停止の加熱方法により多少測定値が異ってくるので注意を要す. ５％塩酸でアルギン酸をゲル紙に遊離通し吸引櫨遇し０．－７０－. ※現在北海道大学水産学部.

(3) . 海藻酸分解酵素（アルギナーゼ）の研究（第一報）る。酸或は酸性の蛋白質除剤を用いて酵素作用を停止せしむる際には未分解の基質がゲル紙になるので測定し蔓Ｇ. ２，飽和度部分に６％，０２～０４飽性酵素量の分布は０～０．．．和度部分に２５％０４～０，６飽和度部分に６５％に分けら. Ｌ・０. ３～０５飽和度の部分に多量の酵素が含まれる。依って０．．れると考えられこの部分について精製を繰返した。先ず. ｉ）反願生成物の定量（ｉアルギナーゼによる分解生成物はウロン酸（叉はウロ. ３飽和度になる様に固体硫安を加えて生ずる酵素液に０．. ソ酸の数分子重合物）と考えられ反悪液はウロメ酸の特. 沈澱を除き上澄液に固体硫安を添加して０６飽和度にて．. 有反願であるナフトレゾルシン反感を呈する。ウロソ酸ｏ）の定量法には種々の方法が報告されておりｌ、炭酸ガスｌｌノｌＦＭｌ発生法によるＢ，Ｔｏの方法が最も正ｅｎｎｎａｓ．. 生ずる沈澱を遠心分離し上燈液は廃棄する。この沈澱を. 確であるといわれているが、定量に長時間を要するので還元力の測定によった。還元力の測定にはＳｏｌｎｏｇｙｌ ‐ Ｈａｉ銅試薬を用 ‐Ｓｈａ”ｅｒ法を改良した新Ｓｏｌｔｍａｎｌｎｏｇｙ２）をと２００いＮ／．チオ硫酸ソーダ溶液にて滴定する方法１った。また一部ではウロメ酸と濃硫酸及びカルバゾールの反感による墨色を光電比色計で定量するＺｃｈｅの方，Ｄｉ３）も悪用した。法１. １酵素の精製酵素精製には第２図に示す如く硫安分別法及び数種の. 酵素の精製. 流水及び蒸溜水に透析して酵素液をうる。これを３倍量のアセトンで沈澱せしめアルコ←ルで脱水、員塞デシケ」ター中に乾燥し衣白色の粉末をえた。ｉ）吸着及び？（ｉ容出による精製. ３ｇ０吸着：吸着剤として水酸化アルミニウムＣγ （／１．３ｇｒ１ｏｃｃ）３ｇｒ１０ぐｃ）／／１ｏｃｃ），．，アルミナ（０，カオリン（０，. ４ｇ０１ｏ／）シリカゲル（ｒｃｃ．，について行った。酵素液と等量の吸着剤及び燐酸塩緩衝液を加えて振湯し１時間後に. 水酸化アルミ，ニウムＣγ. . 篇Ｋ”〆働き遇. レミナルアノカオ１リン . ＩＯ１５会話ｔ. ，いｔト夜 . . ′ Ｌ ′. . . 厳守瀞ォ漆ｉ吸着率. 吸着剤及び最適ｐＨ. . はし戦分別沈没Ｌ，. ．，. ｊＪ、・、 ′ ′. ● ．・． ● ． ′ ● ． ● ● ．， ● ． ● ： ● ． ● ● 、．，. 第１表各種吸着剤に対する吸着率. . . ≠. ３～０５飽和度の部分を集め最後に量の固体硫安を加え０．．. 遠心分離し吸着残液について酵素力を測定した。結果は第１表の如し。. 吸着剤による吸着及び？容出を行った。第２図. 流水に透析して再沈澱を行う時には透析に長時間を要し酵素が不活性になりやすいので次の方法をとった。即ち遠心分離管中の容量を測り管中にて蒸溜水に溶かし計算. . . . . ｒｆｄテんガ ‐ 子Ｔ ‐ ，１，ｒル虚－ま分別１，，（虜）洛彰子. ンれ噂バト. . ｐＨＰＨｐ. シリカゲル. Ｈｐ日ｐＨ. 対. 試. 照. ６６．. ６６．. ６８８． ≧ ６６．. 験１. ．. ８７０．. ９５三０．２２６１，０３６９．. ８１２．. ９４７．５１ｏ，. ９２０．. 反隙液組成：基質２％アルギン酸ソ← ダ・ＰＨ燐酸塩緩衝液ｐＨ７，２酵素液（吸着残液）還元力：反感１時間後ｃｃ／２ｃｃ. ｌｏｃｃ１０ｃｃ. ２ｃｃ. ？容出：前言巳の吸着剤を遠心分離したものを燐酸塩緩衝液及びクエン酸ソーダで椿出を試みた。即ち沈澱に溶. ０分放置後遠心分離後上澄液を透析叉はｐＨ出剤を加え３. たソナー券ｚモ瞬鏑デ. ・のｐＨは０％溶液が最適でこの時出にはクエン酸ソーダ１. . . 、、 ′ ．、. ４６２ｉ．. 」. ．. を調整して酵素力を測定した。結果は第２表の如し。椿７０～７１である。．．. 以上の結果より硫安分別沈澱及び吸着には水酸化アル（ｉ）硫安分別沈澱４２～００～０２．．．，，０分に分けると６飽和以上の各飽和度の部及び０．６飽和度にて殆んど沈澱する。沈澱活液中の蛋白質は０．前言巳の酵素原液を固体硫安にて. ０４～０６．．. ０％クエン酸ソーダを用いてミニウムＣγ を、？害出には１. 第２図の右に記せる如き操作を行って相当精製された酵素を得た。このものは酵素抽出液に対し単位窒素当り約４０倍の酵素力を有する。. －７１－. マ.

(4) . 南波哲・斎藤恒行第２表吸. 着. 剤. アルミナ、. 出. 第４図酵素分解；粘度降下. 率チオ硫酸ソ溶出率 . 誇出剤及び憐件％クエン酸ソーダ. 水酸化アルミ. ニウムＣγ ６ｐＨ６．. 溶. ３２Ｏ．. ０）（ＰＨ８．１０％クエン酸ソーダ０）（ＰＨ７，. ６燐酸塩緩衝液ｐＨ６．. シリカゲル６ｐＨ６．. ８）（ｐＨ７．１０％クエン酸ソーダ０）（ｐＨ７．. ４２６．２９６．３２３．４２．４Ｏ．. 対照試験第１表に同じ溶出率は酵素原液に対する率を以て表わす。溶出剤及び篠件は良好のもののみについて記す。. ＝酸素作用）の如くｏｐｔアルギナーゼの一般的性質は既報５．ｐＨｏｔ２（燐酸緩衝液）、ｏｐ０～７．３５～４０Ｃで塩類の．Ｔｅｍｐ．. ｉ影響はＮａＣ１ｚ，が僅かに酵素作用を賦活するの，ＭｇＣ. ０. ０１. ４０３０２０ . 澱を生じなくなるといわれているが筆者らの実験によると分解途中に新しい酵素を添加しても完全に分解されることなく還元力は一定となって増加せず、且酸及び塩化カルシウム溶液で沈澱を生ずる残盗が存在することが判. 明した。この残掻を検討するために第５図の如き定性実. 験を試みたｏ. が見られる。. 第５園. 酵素による分解過程を粘度法及び還元力測定法によっ. 酵素分解と酸による加水分解. て示すと第３図、第４図の如し。酵素作用は図に示され０分後にはる如く粘幽峰下は反騰の初期に著るしく、約３微小の変化を示すにすぎず之に反して還元力の増加は粘. 度降下の著るしい反態の初期には現われず粘度変化が殆んど見られなくなってから現われる。これらはアミラーゼやビアルドニダ← ゼに於て見られる現象に類似している。. よると酵素作用的２週間でアルギン酸こ従来の報告のむ、ソーダは完全に分解せられ塩化カルシウム溶液により沈. 第３図酵素分解；還元力増加Ｅｅ股ガメＰ婚音 ≧ そで . Ｒｉ飴＊手刷ヒギ度ｒゐｔリマハＬＯ１～ ” ””．イ電；. たに轟きすみれ遺覧. ｉ. ＲＩはアルギン酸ソーダをアルギナｒゼで分解せしめ還元力が一定になったものに稀硫酸を加えて酸性にしてＥし稀炭酸ソーダ溶液に溶かし生じた沈澱で、これを分離脱色精製しアルコールで乾燥した白色粉末のソーダ塩。ｉ）Ｒ，の１％溶液を基質とし再びアルギナ←ゼを作用. せしめても還元力は生ぜず酸素作用を受けない。. ぇ. ４ ‐. ６．」. ｈ～〕 ’ ，時間（反た. ｉｉ）Ｒ２はＲ，を０５％塩酸で数分間沸騰せる重湯煎中．. で加熱して得たろ残遊のソーダ塩である。この際塩７２－.

(5) . ．・. 海薬酸分解酵素（アルギナーゼ）の研究（第一報）酸によりＲ・は加水分解を受け液は還元力を示す。ｉｉｉ）Ｒ２をｉ）と同様にアルギナーゼを作用せしむると. 酵素作用を受けて再び分解せられ還元力を示すが還元力は約３時間後に一定となり分解は進まなくなり且酸及び塩化カルシウム溶液で沈澱を生ずる。 ′ はアルギン酸ソーダをＥ．Ｓｃｈｏｅ”ｅｌ一方ＲＩ，Ｋ．Ｐ．. ５時間加熱加水分解して５２Ｌｉろ硫酸で１ｎｋの方法により０，生じた残澄のソーダ塩で櫨液からはマンヌロソ酸が得ら ′を上記の方法と同様に処理れる。第５図に示す如くＲＩこの処理を繰り返すと次第に酵素して同じ結果を得た。作用を受けがたくなり完全に分解されることはない。この残盗についてはアルギン酸ソーダに含まれる不純物で. あるか叉はアルギン酸の構成々分であるか未決定である ’ がこの物質はカルバゾール反照陽性でウロメ酸を含むので後者と考えられる。分解生成物について：. ラフイーは第３表の如き結果でＲｒ値はマンヌロメ酸に一致するがＲｆ値が小なので決定的なことは云えない。. 他の一つのスポットについてはアニリンフタレートに対して桃色を呈するが如何なる物質か明らかでない。. １）硫安分別沈澱法と吸着法により相当精製せる酵素粉末が得られ、粗製酵素に比較すると初速度は著るしく. 大きいが分解後に示す還元力は粗製酵素が大きい傾向が. はテトラマンヌロソ酸であるが筆者らの追試では未だ確. 活性菱にて脱色したろ後固体淡酸バリウムにて正確に中和しこれを４０ｏＣ以下で減圧濃縮し５倍量の９９％アルコ. ２）アルギン酸ソーダはアルギナ←ゼにより酸及び塩. 化カルシウム溶液等で沈澱を生じなくなる様な重合度の非常に小なる低分子迄全体が分解されない。 ● ノ・３）アルギメ酸ソ← 卿まある程度分解きれると酵素に作用されない歌態となり、鉱酸により一部が破壊される. る。. ５）アルギナ← ゼによる分解生成物はテトラマンヌロン酸であるか否か確認できなかった，交. であるとの結論は得られていない。一方アルギン酸の硫酸加水分解によって得られたマン ‐ ヌロン酸を対照として分解生成物のペーパークロマトグ. ６）Ｓ．Ａ．Ｗａｋｓｍａｎ：Ｊ，ｏｆＢａｃ［．２８．２１３（１９３４）っβ １９３４）Ｊ，Ａ，Ｃ，Ｓ，，，２７０１（．. ７）Ｈｉｒｓｔ，Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ，Ｊｏｎｅｓ，Ｊｏｎｅｓ：Ｊ，Ｚ２９，１８８０９（１９３）. 第３表. Ｒｒ. １紬輯. 酸・水. ８）右田、谷川：日水誌. １０）町田：化学の領域. ９５３（１）. ２３（０１２）ｏ．．. ２２０．. ※ Ｓｃｈｏｅ什ｅｌｎｋの方法によりアルギン酸ソーダを，Ｌｉ. 硫酸加水分解して得たるもの。発色剤アニリン・フタール酸及ブタノール. Ｚ５，１３（１９４９），. ６１キ簿本、芳野、小野間：日水誌ヱ５１，２５３４９）（１９９）南波、斎藤：日化第５年回講演（１９５２）. ０１２（０２４）．，. エタノール・フェノール・水（５：２；５）. 歓. １９３１）大島：日本農化誌７），３３２，（１２１９３６））大島、板谷：札幌農林学会報２８，１３２（１９４３３５１３）遠藤：動物学雑誌４６（），４）遮蔽：北京大学理学院（１９３９）５９９４１）遠藤：植物学雑誌５５），３，（１. 徴黄色の粉末を得た。何れもナにて除鉛後同様な処理で，トレゾルシン反隙は陽性であるがテトラマンヌロン酸フ・. コ. ′. ン酸ソーダは最初から低分子に分解されることなく大きく分裂されつ次第に低分子のものが生ずると考えられ. 得た、叉塩基性酷酸鉛溶液を用いて鉛塩を作り硫化水素. （１０：３：２）. ・. ると考えられる。４）粘度降下及び還還元力の増加の過程より見てアルギ. ールでウロメ酸バリウム塩を沈澱せしめ徴黄・色の粉末を. エタノール・酢. ． ●. 見られる。. ．. 認出来ていない。即ち酵素反騰液を櫨遇し稀硫酸にて酸性にし末分解のアルギン酸の沈澱を除去し、温水強化バ，リウム飽和溶液にて殆んど中和、硫酸バリウムを除去、. ブタノール ▼酢酸・水（４：１：２）. ・ ●. と再び結合が切られるが叉作用されない様な結合が存ず. 遠藤氏の研究によればアルギナーゼによる分解生成物. 展開溶媒－. 察. 考. Ｖｏ１７．Ｎｏ‘１０，１１，１２. １１）Ｂ．Ｔｏｌｌｅｎｓ．２の．１５５，Ｆ．Ｍａｎｎ：Ａｎｎ．（１８９６）ｉ：Ｊ１２）Ｍ．Ｓｏｍｏｇｙｌｏｌ．Ｂｉ，Ｃｈｅｎ．ヱ６０．（１９４５）．６１１３）Ａ．Ｄ．Ｄｉ５２７７５（ｃｋｓｏｎ：Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．・．．１９３０）１４）Ｚ．Ｄｉｏｃｈｅｍ．巧．４０９ｓｃｈｅ：Ａ・ｃｈ．Ｂｉ．（１９４８）Ｊｏｌ．Ｂｉ．４８９．Ｃｈｅｍ．ＺＳ３．（１９５０）ＢｉＣｈ／２Ｊｌノ７７５ｅｍｏ．．．．．（１９４８）. －７３一. ● ‘ 」.

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