検 活性 同時 出法 素 素 新鮮骨格筋 凍結縦 断 片 酸脱水 酵

金沢大学 十 全 医学 会雑 誌 第朗巻 第5号 6 2 3 ^‑6 3 0 (1 9 7 9)

新 鮮 骨 格 筋^の凍 結 縦断切片 ^{の コ ハ} ク酸 脱水素酵素^と

コ リ ^{ン エ ス} テ ラ ^ー ゼ 活性 ^の 同 時検出 法

金沢 大学 医学 部神経情 報研究 施設 (神 経 物性研究部門)

中 村 俊 雄

鳥 越 甲 順

金沢大 学 医学 部解剖 学 第三講 座

高 橋 暁

金 沢大学 医 学 部解剖学 第^一講座

山 下 利 夫

( 昭和^{5 4}年⁸ 月^{2 0}日受付)

本 給文の ^一 部は

,

第^{3 7}回 日本 解剖学 食 中部地方合に お いて発 表し た

｡

6 2 3

1 9 5 2年Padykula^l)によって酵 素組 織 化 学 的研究 法 が^, 骨格 筋^の検 索に導 入さ れ るに及 び

,

骨格 筋は

,

組 織化学 的 特徴を 異^にす る数種^の筋 線維がモザ イ ク状^に 入 り 混 じ^った複 雑な構 築を有す ること が判 明し^2I,さ ら に筋線 維^の酵素 組 織 化 学 的特 徴が^, 筋 線維の生理学 的 特徴と 密接^に関連し^{て い}る^こと が明ら か^に な ^って き が^州 .そ して筋線 絶の分 類と して組 織 化 学 的 分類^{が 一} 般^に広く 用^いら れ る よ うにな り^引〜川. こ の分 類は

,

正常 骨格 筋^のみ な ら ず種^{々 の}骨 格 筋疾 患^の 病理診 断 上^に も^. 重要^な地 位を占めて いる.ところで こ の筋 線維^は

^,

成熟し た 骨格 簸でも

,

不変のもの でな く^. 支 配 神経に よ^っ て強く影 響を受け

,

異 な る 骨格 筋 間^の支配神経 交 叉縫合実 験で筋線 維型の相互転換を起^こせ ること も可 能^にな^っ て いる^{12113 I.} ま た筋 線維 型と神 経 筋 接 合 部の 形態間^にも密 接な相関 が あ る^こと が示 唆さ れて い る^14卜1引. ところで

.

筋線維 型 と神 経筋 接合 部^の相 関を 検索す る手段と して , Ko r n eliu s s e n ら は^{1 5)1 6)}筋線 維 型 お よ び神経 筋 接 合 部^の型^の分 布を そ れ ぞ れ独 立に調

べ. 相互の分布を対比 す る 間接 法を採^っ て いる^. し か し^, 筋 線 維型 と神 経筋接 合 部を同 時^に検 出す る直 接 法

の方が

.

こ のよ う な検 索につ い て は. は る かに優って いること は^, 論 を侯た な^{い .}

現在

,

神 経 筋 接 合 部を確 実^かつ容郵^{こ検 出す る方法}

は, コリン エス テ ラ ^ー ゼ(以下 ｢ch E｣ と略 記) 活 性 検 出 法で■

ぁ る^{‑ 7I.} こ の Cb E 活 性 検 出法と筋線 維型^の同 定 指 標と な る酵 素 活 性^の検 出法^を組み合わ せ れ ば

,

筋 線 維 型と神経 筋 接 合 部^の型 と^の対 応を直 接に観 察できる 訳であ る が

.

後 述のよ うに

,

模 本作 製 上^の困難 性^に阻 ま れ^て

t

そのよ う な^二重検 出法の報告は少な く

,

著 者

の報 告^岬を含めて

.

わ ず か数 報を見るに過 ぎ な^い柑I2り し か も

,

これ らの報 告^で用^いら れ た方 法は

,

な お不 備 な 点 が多く. 定量的な検 索には応_{用 し}にく^い.

筋線 推 型と神 経 筋 接合 部の同 時 検 出標 本作 製 上^の難 点は^, 神経筋接 合 部^の全貌を観 察す るには

,

骨格 筋の 厚^い縦 断切 片を 必要と す る点と^. 筋線 維型^の同定 指 標 と な る酵 素の大 部 分は 固定 剤^によ^って著し く活 性が低 下ま た は消 失す る点にあ る. 換 言す れ ば

,

酵 素 活 性^を 保存す る た め新 鮮骨格筋^の凍 結 切片, し か も 3 0/上以上

の厚い縦 断切片を 必要とする^ことであ る^. こ のよ う な切 片を 通常の方 法で作 製す れ ば, 凍結 切 片^の融 解 時^に起

こる 筋線維^の収 縮^のた め

t

著しい変形が起き^細雪 同 時

に

,

神 経 筋接 合 部^の形も変化す る^{2 2l}.今臥 わ れ わ れ は,

こ の よう な収 縮によ る人工的 変 化を^. Ethyle n ed ia^‑ min e‑ ^tetr a a C et_ate( 以下 ｢ E D T A ｣ と略記) を 塗布

Si_{m u}lta n e o u s De m o n stratio n of Su c cinic Deh_ydr oge n a s e a nd C holi_{n e s}te r a s e A ctivitie s

in the Fto ze n Lo ngi^{tud in al Se ctio n of the F}r e sh S keletal m u s cle. T o shi｡ N aka m ur a

& Eoj^{u n T o ri}g^{o e,} I k _pa rtm e nt of B ioph_ysic s

_,

N e u r o^‑Info r m atio n Re s e a r ch In stitute

,

Scho ol of M ed icin e

_,

A k ir a T akaha sh i & To shio Y a m a shita, Dep^{a r}tm e nt of A n ato my

,

Scho ol of M edicin e

,

K an a Z a W a Uⁿiv e r si_{t y}.

6 2 4 中村

^･

鳥越

^｡

高橋

^･

山下

し た カ^{バ ー} グラス の使用^によ^っ て抑え

,

コ ^ハ ク酸 脱 水 素 酵 素 ( 以下｢ S D H ｣ と略記) ^{とch E} 活 性の両者を同

時に検 出す る方 法を案 出し たの で報 告 する^. 材料^{お よ}び 方法

材料と して

.

d dN 系マ ウ ス前 脛骨筋を用いた^. 頸 椎 戚臼によ^っ て屠 殺し た^マ ウ スか ら

,

直ちに前 脛 骨 筋を

,

そ の起始か ら停 止ま^{で の}全 長にわ た^っ て取り出し

,

前 報^{2 2Iの}方 法^に従^{っ て}

^,

^クリオ スタッ ト(^{サ ク ラ}

^･

^{コ ー ル}

ド ト^ー ムC M ^‑ 4 1 型) 中^で急 速に凍 結さ せ

,

1 5〟ま た は 3 0〝凍結 切 片を作 製し た^.

ま ず

,

先^に報じ た筋 線維^の人工的 収 縮 抑 制法^{2 2 I}

^,

す な わ ち冷 却^{し た}寒天^塗布^{カバ ー} グラ ス で凍^っ た ま まの切 片を採取 し

,

4⁰c で1分 間^{ホ ル} マリ^ン蒸 気 処理 を行^っ

てか ら

,

Na ch la sら^の方 法^珊に準L; てS D H 活 性 検 出法を 行^ってみ た.その模 本^を観 察 す^{る と}

^.

^{S D H} 活 性^は完 全

に消 失して いること が判 明し た^. そこ で. ホ ルマ リ^ン 蒸気 処理 以外^の方 法で

,

人工的 筋 収 縮を抑え. 同時^に S D H な ら び^にCh E 活性を保 存さ せ る方 法を探してみ た^. その結 果

^.

筋収 縮連 関^に関 与 する カ^ルシ ウ ムイオ

ン2 4)2 5)を

,

E D T A

^･

寒天溶 液塗布^{カバ ー} グラ ス の使用

によ^って除 去す る と

,

人工的 筋 収 縮が抑 制さ れ^, 同 時

に

.

S D H と^cもE活 性^{の い}ずれ も保 存さ れ る^こと が判 明し た. 次^{に こ の}知 見^に基づい て

_,

S D H と Ch E 活 性

の同 時検 出法を開発し たの で

,

その操作 法を記 載 する^. S D H 活性 検 出法ほ Na ch la sらの方 法²³⁾

,

C H E活 性 検 出

法は Ka r n o v skyら^の方 法^{珊 の}著 者^の変法^{2 2)に}よっ た.

1) E D T A 塗 布カ^{バ ー} グラ ス の作製

0.3 % 寒天水 溶液(6 5⁰c) 10 0 m=こ

,

E D T A ^‑ 2 N A と E D T A ^‑ 4 N A ( 和 光純 薬) を各5g 溶 解し, こ の E D T A ^一寒天溶 液に

,

カ^{バ ー} グラ スを浸してか ら

,

3 7^qC で1 晩乾 燥 後

.

クリ オスタッ ト中で 冷や して お β⁼

2) ク リ オスタッ ト切 片 作製

新 鮮 骨 格 筋^の3 0〟凍 結 切片を前 述^の方 法^に従 ^{っ て}

クリオ スタ^ット( ^‑ 2 0^Oc) ^で作 製し

,

冷や し た E D T A 塗布カ^{バ ー} グラ スを

,

凍 結 切片の上か ら圧 迫し, 切 片

を^カ′ヾ‑ グ^{ラ ス に}付 着さ せ る^. 次^{い で}

.

カ^バ

^ー

グ^{ラ ス} に付 着し た切 片を^{, ク}リオ スタッ ト か ら取 出すと同 時

に

,

手 早く

,

ヘア

^･

ド ライ ヤ ^ー で室温 約1 0 分 間乾 燥す る^.

3) C^e1l^oi din ･^‑ C O atiⁿg

S D H お よ ぴch E 基 質液^に切 片^を浸 溝 申^. 酵 素^の拡 散と カ^{バ ー} グラ スか らの切片の剥 離が おこる が^, そ^の

防止^のた め

.

C hristie の方 法^{2 7 1}に準L: て

.

0.5 %

c e1loi d in 溶 液で切片^{を コ N テン ダ す る. c elloi d in}

はethyl alc ohol : ethyl ethe r : a C etO n の3 者 等 量i 昆合液に0^.5 % ^の割に溶か し

.

あ ら か じ め ク リオス

タット申^で冷や してお く^{. こ の}溶液に切 片を約2 秒間 浸し, 余 分^{の液 を}濾紙で吸い取った後

^,

^クリオスタ^ッ

ト申で約5 分 間 乾燥さ せ

,

次い で

,

室 温で ^ヘ ア

^｡

ド ラ イヤ ^ー を用い て約10 分 間乾燥さ せ る.

4) S D H 活 性 検出法

基 質 液 〔0^.2 M ^{コハ ク}酸^{ナ ト}リウ ム水 溶液 5 mエ,

0 .2 M リ^ン酸緩 衝 液₍pH 7.4) 5 mL ショ糖1.5g

,

ニ

ト^ロブル^ー テ ト ラ^ゾリ ウム 10 mg^,蒸 溜 水1 0 m抽こ3 7⁰c で 1 5分 間 浸 潰す る^.

5) cb E 活性 検 出法

切 片を 1 0 % ^{ホ ルマ} リ ^ン の 0^.9 % 食塩水 溶 液でt

4⁰c

,

2 0分 間 固 定 後

.

0 .9 % 食塩 水で, 約1 分 間洗 源 し

,

基 質 液 〔_{1 / 7 M} ^ベ ロ ナ ^{ー ル ･} 酢 酸緩衝 液

(pH 5 ^.5) 5^.5 mエ

,

0^.1 M ク^エ ン酸ナ トリウ ム水溶液 0.5 mL,3 0m M 硫酸銅水 溶 液1 .O mL .5m M 赤 血塩水溶 液 1 ^.O ^m￡

.

1 0 ⁵M D F P の0^.9 % 食塩 水溶液 1^.O mエ. ホ

ル マリ^ン 1^.0 山^, 沃 化アセテルチ オ^コ リ^ン5 ^mg〕に

37⁰c

,

1 5 分 間浸 潰^し

^,

^蒸潜 水^で1分 間洗 樅後

^,

^エタノ

ー ル脱 水

^｡

キシ^{ロ ー} ル透 徹 後

^,

^{エ ンテ ラン}( 和 光純薬)

に封じ た^.

成 績

通常の方 法で作 製し た新 鮮 前 脛骨 筋^の凍結 横 断切片 に S D Ii 活性 検 出を施し た標 本を 写真 1^,2 ^で 示 し た^. S D H 活性反応 産 物^であ る fo r ma z a n の青 色沈 澱 の多 寡^によ り

,

S D H 活 性の強^い筋 線経と活 性^の弱^い 筋 線 継が判 別でき る∴活 性^の強^い筋 線 維は

,

Engel の

分 類^7IのⅠ型^に

^.

活 性^の弱^い筋 線 推は

.

その‡塾に相当 する. 以下^の筋線 維型 をこ の分 頓^に従^っ て記述 する^.

Ⅰ 型の筋 線 推は

,

‡ 型^の筋線 維^に比 して

,

一般^に細い.

そ れ ぞ れ^の型^の筋 線 維は

.

数 本集^って群を な して いる 場 合が多^いが

,

1本だ け 孤立して存 在 する場 合も 認 め ら れ る^. こ の両 種の型の筋線 維群が お 互い に入り 混 じ

っ て

,

モザ イク状^の外 観を 呈 L て いる(写真1)^. 強拡 大で観 察す る と S D H 活 性 反 応 産物は

,

微細な蝮粒と し^て言忍 め ら れ る( 写 真2)^. S D H 癌 性が ミ トコ ン ド リ ヤ^に局 在して いること は

,

すで に生 化 学 的^28Iにも電 子顕 微鏡的 細 胞 化 学^{2 別}によ^っても明ら かにさ れ^{て い}る こと か ら

,

S D H 活 性 検 出 法^によ^っ て見 出さ れ た鰭 粒 状 構 造 物は

,

ミ トコ ン ドリ ヤに相 当す る と判断でき る^･

Ⅰ.型の筋線 絶に分 布す る S D H 活 性を示 す 青色顆 粒 は

,

ⅠⅠ型^のそ れに比 して ^一 般に大き^{い. こ の こ}と は^, 可視 光庶微 鏡所 見と電 子 顕 微 鏡 所 見^の対 比 実 験^の結 果^{3 0I}と も 符合す る^.