ロ シ ン水 酸 化 酵 素 活 性 およ び
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(2) 38. 三. Centre,. Amersham). ml(蛋. 0.05μCiを. 白 量 約0.5mg)を. mlと. した.な お,L‑〔U‑14C〕. めNagatsuら9)の. 用 い,酵. 加 え た.最. 好. 公. 明. ク ロ ル 酢 酸0.3mlを. 素 液0.1. 入 れ た.一. チ ロ シ ンは あ らか じ. 方 法 に 従 っ て ア ル ミナ に よ り精 製. /Searle)で. 栓 し た.と れ を チ ロ シ ン脱 炭 酸 反 応 測 定 の 場 合 は120 分 間,L‑ド. 37℃ で イ ン キ ュ ベ ー ト し た.側. 10,000×gで20分 に0.2Mエ. 間 遠 沈 して 上 清 を 分 離 し た.と. チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸2ナ. mlと,. 0.2M酢. 0.3gを た.. 反 応 を と め,. 5分. ト リ ウ ム0.2. 酸 ナ ト リ ウ ム5mlお. 加 え て1Nア. れ. 合 せ. 間 マ グ ネ テ ィッ クス ター ラーで 静 か に撹 拝. した の ち静 置,上. 清 液 を 捨 て て,ア. さ15cmの. カ ラ ム 管 へ 水 で 洗 い と み,更. 50mlを. 流 し て 未 反 応 の チ ロ シ ン を 除 い た.つ. 0.3N酢. 酸6mlで,ド. ー パ を 溶 出 し,溶. に水 いで. 出 液 の2ml. を と り ジ オ キ サ ン シ ン チ レ ー タ‑7mlを. 酸 を 加 え て 反 応 を 止 め,更. 片 を7mlト ン チ レ‑シ 白1mg当. に37℃ で30分. ョ ン カ ウ ン タ ー で 測 定 し た.反 り,. 1時. フ ェ ニ ー ル ア ラ ニ ン12)お よ び チ ロ シ ン13)の 定 量 は そ れ ぞ れ 蛍 光 法 に よ っ て 行 な い,蛋. mg当. た り1時. あ っ た.酵. ドーパ(New の回収 率. 糖 値 はO‑ト. 白 質 量 はLowry. ル イ ジ ン ・ホ ウ 酸 法15)に. よ っ て 測 定 し た.. 素 活 性 は 蛋 白1. 間 に 生 成 さ れ るL‑ド‑パ. スク. に よ って 河 合 ら11)の 方. 法 で 行 な っ た.. 加 えて 液. 用 い てL‑ド‑パ. 体シ. 応 量 は蛋. 血 漿 お よ び 脳 内 カ テ コ ラ ミ ン値 の 測 定 は,ガ ロ マ ト グ ラ フ ィ‑(ECD)法. 法14)に よ り,血. Nuclear)を. の瀕 紙. 間 に生 成 され る炭 酸 ガ スの 量 で. お ア ル ミ ナ に よ り精 製 し たL‑〔U‑14C〕. を求 め た と と ろ76.3%で. 間 振 盪 し て,. ル エ ン シ ン チ レ ー タ ー に 浸 し て,液. 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー に よ り測 定 した.な. England. 間,. 室 よ り ト リク ロル酢. 表 わ し た.. ル ミ ナ を 内 径5. mm,高. ー パ 脱 炭 酸 反 応 測 定 の 場 合 は30分. 発 生 し た 炭 酸 ガ ス を 瀕 紙 片 に 吸 着 させ た.と. よ び アル ミ ナ. ン モ ニ ア 水 でpH8.6に. ッ ト. 湿 らせ た もの を 試 験 管 内 に つ る し て 密. た 後,. リ ク ロ ル 酢 酸0.2m1で. 紙 片(ワ (Amersham. し た も の を 用 い た. 37℃ で30分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 25%ト. 方,〓. マ ンNo. 4,15×25mm)を50μlのNCS. 終 反 応 液 量 を1.0. 結. 量 に よ り表. 果. ラ ッ トに イ ン ス リン また は 生理 食 塩水 を注 射 して. わ し た. 芳 香 族 ア ミノ 酸 脱 炭 酸 酵 素 活 性 は, ら期の 方 法 に 準 じ て 測 定 し た,脳. Christenson. は酵 素 活 性 が最 も. 高 い 線 条 体 とつ い で 高 い 活 性 の 認 め ら れ る 間 脳 を 合. 60分 後 の血 糖 値 と血 漿 お よ び脳 の皮 質 部 分 の フ ェ ニ ール アラニ ンとチ ロシン値 の測 定 結果 を表1に 示 した . 血 糖 値 は イ ンス リン群 で 有 意 に 低 下 して お り,そ. わ せ る か.ま た は 小 脳 を 除 く 全 脳 を 用 い た.脳 ま た は. の平 均 値 は対 照 群 の47.3%で. 肝 を5倍. 量 の 生 理 食 塩 水(0.2%ト. 研 究 で 用 い た少 量 の イ ンス リン投 与 に よ って も血糖. 含 む)で. ホ モ ジ ナ イ ズ し た の ち, 10,000×g,. リ トンX‑100を. 遠 沈 し た 上 清 を 酵 素 液 と し た.チ 応 測 定 に は0.02Mト. ロシ ンの脱 炭 酸 反. リ ス 緩 衝 液pH7.8を. と し て4×10‑4MのL‑チ. 用 い,基 質. New. England. 方 法 に よ り,あ. 精 製 し た も の を 用 い た.L‑ド 定 に は0.08Mリ い て,基. ‑〔1一14C〕 chemical. ド ー パ(7. た も の を 加 え た.側. 用. ー パ お よ びL. .9mCi/mmo1,. The. いず れ に お い て も変 化 が み. ンス リン また は生 理 食 塩 水投 与 後60分 おけるカテコ. ラ ミンお よ び チ ラ ミンの 測 定 結果 で あ る.血 漿 中 ド ーパ ミンお よ びノ ル エ ピネ フ リン値 は イ ンス リン群 で有 意 に低値 を示 し,エ ピネ フ リンお よ び チ ラ ミン 値 は イ ン ス リン群 で逆 に有 意 に高 値 を示 した.一 方,. Radio‑. 脳 で も血 漿 と同様 に,イ. ンス リン群 で ドーパ ミン,. 0.1μCiを. 合わせ. ノル エ ピネ フ リンが有 意 に低 下 して お り,チ ラ ミン. 室 を 有 す る 内 径18mm,長. さ10. は有 意 に増 加 し,エ ピネ フ リン に も増 加 傾 向 が み ら. Amersham). cmの. 試 験 管 を 用 い て,緩. ‑メ. ル カ プ ト エ タ ノ‑ル,. リ ン酸,酵. らか じ め. ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液pH7.0を. Centre,. チ ロ シ ン値 に は血 漿,脳. の血 漿 お よ び脳(小 脳 を除 く全脳)に. ーパ の脱 炭 酸 反応 測. 質 と して3×10‑3MのL‑ド. 漿,脳 と もに イン ス リン群 で 有 意 な 低下 を示 した が,. 表2は,イ. Nuclear). 混 合 し た もの を 加 え た.L‑〔1一14C〕. チ ロ シ ン はNagatsuら9)の. 値 は明 らか に低 下 した.フ ェニ ー ル ア ラニ ン値 は血. られ なか った.. ロ シ ン とL‑〔1一14C〕. チ ロ シ ン(54.6mCi/mmol, 0.1μCiを. 10分 間. あ った.す な わ ち,本. 素 液0.4ml(蛋. 衝 液0.6ml, 7×10‑5Mピ 白 量 約4mg)を. れ た.. 1×10‑2M2 リ ドキ サ ル 入 れ て37. 表3は,チ. ロ シ ン水 酸 化 酵素 活 性 を イ ンス リン ま. た は生 理食 塩 水 を注 射 して60分 後 に,脳(線. 条 体). ℃ で10分. 間予 備 反 応 を行 つたの ち氷 冷 して基 質 を加. お よ び副 腎 で測 定 した結 果 で あ る.脳,副. え た.最. 終 液 量 は1.5m1で. に お いて もチ ロシ ン水酸 化 酵 素 活 性 は イ ンス リン注. あ る.側 室 に は35%ト. リ. 腎いずれ.
(3) ラ ッ ト脳 内 ア ミン代 謝,チ ロシン水 酸 化 酵 素 活性 お よ び チ ロシ ン脱 炭 酸 反応 に 及 ぼ す イ ンス リンの効 果 射 群 で有 意 に高値 を示 した. 表4に. ン水 酸 化 酵 素 活 性 とチ ロシ ン脱 炭 酸 反応 が い ず れ も. は,同 じ く注射60分 後 に お け る チ ロ シ ンの. 対 照 群 よ り上 昇 して い る こ と を示 す,. 脱炭 酸 反 応 を測 定 した結 果 を示 した.脳 は線 条 体 と 間脳 の部 分 を合 せ て 用 い た.脳,肝. つ ぎに,イ ン ス リン注 射 後 の チ ロ シ ン水 酸 化 酵 素. と もに イ ン ス リ. 活 性 な らび に チ ロシ ン また はL‑ド. ン群 で 酵素 活 性 に有 意 の 上 昇 が 見 られ た.. 血 糖 値 お よ び血 漿,脳. 内 フ ェ ニ‑ル. 数 値 は 平 均 値 ± 標 準 偏 差, ()内 対 照 群 と の 有 意 差(t‑test):. 表2. 対 照 群 と の 有 意 差(t‑test):. 化 を検討 した。. ア ラ ニ ン,チ. **. P<0.025,. ***. P<0.05. ラ ミン 値 に お よ ぼ す イ ン ス リ ン の 影 響. 数字 は例 数 * P<0.005, ☆ P<0,01,. 表3. ロ シ ン値 に お よ ぼす イ ン ス リンの影 響. 数 字 は例数. * P<0.005,. 血 漿 お よ び 脳 内 カ テ コ ラ ミン,チ. 数 値 は 平 均 値 ± 標 準 偏 差,()内. **. P<0.025,. ***. P<0.05,. ☆ ☆ P<0.10. 脳 お よ び副 腎 の チ ロ シン水 酸 化 酵素 活 性 にお よ ぼす イ ンス リンの影 響. 数 値 は 平 均 値 ± 標 準 偏 差(nmol 対 照 群 と の 有 意 差(t‑test):. 表4. L‑DOPA/mg * P<0.005,. protein/hr) **. P<0.025. 脳 お よ び肝 の チ ロシ ン脱 炭酸 反 応 に お よぼ す イン ス リンの影 響. 数 値 は 平 均 値 ± 標 準 偏 差(nmol 対 照 群 と の 有 意 差(t‑test):. ー パ を基質 とし. た場 合 の芳 香 族 ア ミノ酸 脱炭 酸 酵 素 活 性 の経 時 的 変. 以 上 の 結 果 は,イ ン ス リン注 射60分 後 で は チ ロ シ. 表1. 39. CO2/mg * P<0.005. protein/hr).
(4) 40. 三. 好. 公. 明. 図1は イ ンス リン注 射 後5時 間 まで の血 糖 値 の 推 移 を 示す.結 果 は2例 の平 均 値 で あ る,イ ンス リン 注 射後30分 です で に 血糖 値 は明 らか に低 下 して お り, 60分 か ら120分 にか けて最 低 値 とな っ た が, 3時 間後 に は上 昇 し,以 後 は対 照 群 と同様 とな っ た. 図2は 脳 線条 体 に お け る チ ロ シ ン水 酸 化酵 素 活 性 の経 時 的変 化 で あ る.イ ン ス リン注 射 後60分 の チ ロ シ ン水 酸 化 酵素 活 性 は,イ ン ス リン群 で 有意 に高 値 を示 した. 図3は 副 腎 に お け る結 果 で あ るが,イ ン ス リン群 で は注 射後30分 か ら90分 まで,対 照群 よ り有 意 に高 活 性 を示 した.. 図2. 図4お よ び図5は. イ ンス リ ン注射 後 の 脳 お よ び肝. イ ンス リン注 射 後 の 脳(線 条 体)内 チ ロ シン 水酸 化 酵 素 活 性 の 経 時 的 変 化. にお け るチ ロシ ン脱 炭 酸 反応 の経 時 的 推 移 で あ る.. 4例 の平 均 ±標 準 偏 差. 脳 は小 脳 を除 く全 脳 を用 い た.脳,肝 いず れ で も30分,. 対 照 群 との有 意 差(t‑test):. * P<0.05. 60分 後 に は対 照 群 よ り有意 に高 くな り,特 に60分 後 には著 し く高 い値 を示 した. 図6,図7は. 脳 お よ び肝 にお け るL‑ド. ー パの 脱. 炭 酸 反 応 を測 定 した 結果 で あ る.脳 は小 脳 を除 く全 脳 を用 い た.脳 に お け るL‑ド. ーパ の脱 炭 酸 反 応 は. イ ン ス リン注 射90分 後 に対 照 群 よ り有 意 に高 くな っ た が,肝 で はイ ンス リン注 射 に よ る変 化 は全 くみ ら れ なか った. 図8に ラ ッ ト脳 チ ロ シン脱 炭 酸 反応 の至 適pHを 示 す.基 本 反 応 溶 液 は方 法 の 項 で述 べ た と う りで, 図 に示 した 緩 衝 液 を 用 い てpH5.0よ で を調 べ た結 果,至 適pHは7.8で. りpH10.0ま. あ った. 図3. イ ン ス リン注 射後 の副 腎 内 チ ロシ ン水 酸 化 酵 素活 性 の経 時 的変 化 4例 の平 均 ±標 準偏 差 対 照 群 との 有意 差(t‑test):. 図1. イ ンス リン注射 後 の血 糖 値 の 変 化. 図4. イ ン ス リ ン 注 射 後 の 脳(小. * P<0.01. 脳 を 除 く全 脳)に. お け る チ ロ シ ン脱炭 酸 反応 の経 時 的 変 化 対 照 群 と の 有 意 差(t‑test):. * P<0.005.. **. P<0. .05.
(5) ラ ッ ト脳 内 ア ミン代 謝,チ ロシン水 酸 化 酵 素 活 性 お よ び チ ロ シン脱 炭 酸 反応 に及 ぼす イ ンス リ ンの効 果. 図5. イ ン ス リ ン 注 射 後 の 肝 に お け る チ ロ シ ン脱 炭. の 平 均 ± 標 準 偏 差,対. (t‑test):. ラ ッ ト脳 に お け る チ ロ シ ン 脱 炭 酸 反 応 の 至 適 pH. 酸反 応 の経 時 的 変 化 4例. 図8. 41. * P<0.005,. 照 群 との 有 意 差 **. P<0.05. pH. 5.0‑6.0:0.08Mク. エ ン酸 緩衝 液. pH. 6.5‑7.0:0.025Mリ. ン酸 緩 衝 液. pH. 7.5‑9.0:0.02Mト. pH. 9.5‑10.0:0.08Mグ. リス 緩 衝 液 リシ ン緩 衝 液. 以 上,イ ン ス リン投 与 後60分 で,血 漿 お よ び脳 内 の フ ェニ ー ル ア ラ ニ ンが 減 少 し,血 漿 お よ び脳 内 で と もに ドー パ ミン,ノ ル エ ピネ フ リン が減 少 し,エ ピネフ リンが増加 し,ドーパ ミンおよび ノル エ ピネ フ リ ンの代 謝 回転 の促 進 を示 す 結 果 を得た また,チ ラ ミ ン も増 加 して いるこ とか らチ ラ ミンへ の代謝 亢 進 を 示 す 結 果 を得 た. ま た,同 様 に イ ン ス リン投 与 後短 時 間 で脳,肝 臓, 副腎 に お いて,チ 図6. ロ シン水 酸 化 酵 素,ド ー パ脱 炭 酸. イ ンス リ ン注射 後 の 脳(小 脳 を除 く全 脳)に. 酵素(芳 香 族 ア ミノ酸 脱炭 酸 酵 素)の 活性 化,お. お け るL‑DOPA脱. チ ロシ ン脱 炭 酸 反応 の亢 進 を示 す 結 果 を 得 た.. 炭 酸 反応 の経 時 的 変 化. 対 照 群 との有 意 差(t‑test):. * P<0.025. 考 本研 究 で は,表1に. よび. 察 示 した ご と くイ ンス リ ン投 与. 60分 後 に,血 漿 お よ び脳 内 の フ ェニ ール ア ラニ ンが 有 意 に減 少 す る と い う結 果 を得 た.ま た,同 じ時 点 で 血漿 お よ び脳 内 の ドー パ ミン とノ ル エ ピネ フ リン は減 少 し,エ ピネ フ リンは 逆 に増 加 して い る(表2). これ らの 成 績 は イ ンス リン が ドー パ ミンお よ び ノル ェ ピネ フ リンの 代 謝 回転 を促 進 す る こ と を示 唆 す る もの と考 え られ るが,さ. らに イ ン ス リン投与 後 血漿. お よ び脳 内 チ ラ ミンの 増 加 も認 め られ る こ とか ら, チ ロ シ ンか らチ ラ ミンへ の 代謝 を も亢 進 させ る可 能 性 が あ る.こ こで血 漿 お よ び脳 内 い ず れ に お い て も 図7. イ ンス リ ン注射 後 の 肝 にお け るL‑DOPA脱. チ ロシ ン量 に変 化 が 見 られ な い の は,カ テ コ ラ ミン. 炭 酸 反応 の経 時 的 変 化. 代謝 に お いて チロ シ ン水 酸化 酵 素 が律 速 酵 素 で あ る. 4例 の平 均 ±標 準 偏 差. た め で あ ろ うと考 え られ る..
(6) 42. 三. Tagliamonteら16)は. 好. ラ ッ トに 本 研 究 で 用 い た イ ン. ス リ ン 量 の 約10倍. 量(2.0I.. U/100g体. 重)を 腹 腔 内. 投 与 し, 30〜90分. 後 に血 清 トリプ トフ ァンお よ び チ. 公. 明. 述 の ドーパ ミンお よ び ノル エ ピネ フ リン の代 謝 回 転 の亢 進 に大 きな影 響 を及 ぼ してい る ことが考 え られ る. 本 研 究 で 得 られ た イ ンス リンに よ るチ ロシ ン水 酸. ロ シ ン量 が 減 少 す る 一 方,脳. 内 の そ れ らが 増 加 し て. 化酵 素 の活 性 化 の 機 序 は 明 らか で な い が,本 酵 素 活. い る こ と を 報 告 して お り,こ. れ を イ ン ス リンが血 液. 性 の短 時 間 内 での 調 節 機構 に つ い て は す で に い くつ. か ら脳 へ の ト リ プ ト フ ァ ン お よ び チ ロ シ ン の 取 り込. か の報 告 が あ る.す な わ ち, Morgenrothら21)は. み を亢 進 させ た 結 果 と 解 釈 し て い る.し. イ ク リ ック アデ ノ シ ン3´,5´‑モ ノ フ ォス フ ェ イ ト. 究 で は,脳. か し,本. 研. 内 フ ェ ニ‑ル. ア ラ ニ ン量 は 血 漿 の そ れ と. 同 様 に減 少 し て お り,さ. らに チ ロ シ ン 量 に は 有 意 の. 変 化 が 認 め ら れ な か っ た.ラ は,チ. ッ トの 血 液‑脳. 関門で. ロ シ ン と ロ イ シ ン は 同 じ 機 構 で 取 り込 ま れ る. こ と が 知 られ て い る17)が,ラ. ッ ト横 隔 膜 へ の ロ イ シ. (cAMP)の. 増加 に伴 い, cAMP依. ン酸 化 酵 素 が 活 性 化 され,チ. サ. 存 性 タンパ クリ. ロシ ン水酸 化 酵 素 が リ. ン酸 化 され る こ とに よ っ て酵 素 活 性 の上 昇 が見 られ る と して い る.本 酵 素 自体 の リン酸 化 は未 だ証 明 さ れ て は い な いが,こ の機 構 は低 血 糖 ス トレ ス に よ り. ン 取 り込 み 機 構 は イ ン ス リ ン 不 感 応 で あ り18),さら に. 神経 細 胞(あ. 最 近Pardridge19)に. カテ コ ラ ミンが,シ ナ プ ス後 膜 受 容 体 に結 合 して ア. よ っ て 血 液‑脳. 関門 を通 して の. るい は副 腎髄 質 細 胞)か. ら放 出 され た. ア ミノ 酸 の 輸 送 は お そ.ら く イ ン ス リ ン不 感 応 で あ る. デ ニ レー トサ イクレースが活 性 化 され,つ い でcAMP. こ と が 報 告 さ れ て い る.き. が増 加 す る と い う機 構 に連 続 す る もの で あ る.し か. ら に,. MacKenzieら20）. は ラ ッ ト大 槽 内 に イ ン ス リ ン を 直 接 投 与 し た 場 合 に. し,脂 肪 細 胞 で は,イ ン ス リン がcAMP分. は 脳 内 ト リ プ ト フ ァ ン 量 に 変 化 が な く,セ. ロ トニ ン. で あ るフ ォス フ ォジ エス テ レー ス 活性 を上 昇 させ る. 酢 酸 に も変 化 が な か っ. こ とが報 告 されて お り22),イ ンス リンに よ るチ ロシ. 腔 内投 与 の 場 合 に 見 られ る脳 内 トリ. ン水 酸化 酵 素 の 活 性 化 を上 述 の機 序 で説 明 す る こ と. や5‑ヒ. ド ロ キ シ イ ン ド‑ル. た こ と か ら,腹. プ トフ ァ ン 量 の 増 加 は,イ. ン ス リン が 直 接 ア ミ ノ酸. の 脳 内 へ の 取 り込 み を 亢 進 さ せ る 結 果 で は な い で あ ろ う と推 論 し て い る.し. たが って イ ン ス リン に よ る. 解 酵素. は 現在 の とこ ろで きな い. また, in vitroに お け る ト リプ シン に よる限定 分 解 に よ っ て切 断 され,本 来 の チ ロ シ ン水 酸化 酵 素9.2. 低 血 糖 ス ト レ ス を介 し た 取 り込 み 亢 進 の 可 能 性 な ど. sが3.7sと. 検 討 す べ き問 題 を 残 し て い る.. 上昇 す る とい う こ と23)から,生 体 内 で は こ の よ うな. と 著 者 の 成 績 の 相 違 は,用. Tagliamonteら16). い た イ ン ス リ ン量 の 差 に. よ る 可 能 性 を 否 定 で き な い が,イ. ンス リンに よ る前. 駆 ア ミノ 酸 の 脳 内 取 り込 み へ の 影 響 自 体 に つ い て も, さ ら に追 求 す る 必 要 が あ る と思 わ れ る.. 上述 の ご と く,本 研究 で は ラ ッ ト血 漿 お よ び脳 内 の 前 駆 ア ミノ酸,カ テコラ ミンお よ びチ ラ ミンの 測 定. 小 さ くな った時,そ. の活 性 は3〜5倍. 活 性化 機 構 も考 慮 され な け れ ば な らな いで あろ う. つ ぎに,本 研 究 で は イ ン ス リン投 与 後30分 と60分 に脳 お よ び肝 臓 の チ ロシ ン脱 炭 酸 反 応 の 亢 進(表4, 図4,. 5)と,投. 与 後90分 に お け る脳 の ドー パ脱 炭. 酸反 応 の亢 進 が認 め られ た(図6).こ. れ らの成 績 も,. イ ン ス リン投 与 に よ るカ テ コ ラ ミンお よ びチ ラ ミン. 結 果 か ら,イ ンス リン が ドー パ ミンお よ びノ ルエ ピ. へ の代 謝 亢 進 とい う前 述 の 結 果 と うま く符 合 す る も. ネ フ リンの 代 謝 回転 の亢 進 お よ び チ ロ シ ンか らチ ラ. の で は あ る が,チ ロ シンお よ び ドーパ脱 炭 酸 酵素 に. ミンへ の 代 謝亢 進 を引 きお こす可 能 性 が 示 され た が,. つ い て は この よ うな 短時 間 内 で の 活 性化 の報 告 は末. つ ぎに これ ら代謝 経 路 に関 与 す る酵 素 活 性 に つ い て. だ見 あ た らない.し た が つて,い か な る機構 に よ っ. 得 られ た成 績 に つ い て述 べ る.. て脱 炭 酸酵 素 の 活性 化 がお こ るか に つ い て ば現 段 階. まず,チ. ロシ ン水 酸 化 酵 素 につ いて は,イ ンス リ. ン投 与 後60分 で脳(線 条 体)で の有 意 の 活 性上 昇 が 認 め られ た(表3,図2).副. 腎 に お いて も同 様 に活. 性 上 昇 が 認 め られ るが,経時 的変 化 を調 べ た もの で は. で は 全 く不 明 と言 わ ざる を得 ない. 本 研 究 で は,脱 炭 酸 酵 素 活 性 は チ ロ シ ン,ド ー パ につ いて,い ずれ もカル ボキ シル‑14Cか. らの 放 射. 性 炭 酸 ガス の放 出量 を測 定 して お り,ま た,芳 香 族. 脳 の成 績 と異 な り,投 与 後30分 お よ び90分 に も活 性. ア ミノ酸脱 炭 酸 酵 素 は基質 特 異 性 の極 め て低 い とと. 上 昇 が見 られ る(図3).チ. ロ シ ン水酸 化 酵 素 は カ テ. が 知 られ て い る10).また,万 法 の項 で述 べ た ご と く粗. コ ラ ミン生 合 成 の律 速 酵 素 で あ り,そ の 代謝 調 節 に. 酵 素 を用 い て い るの で,チ ロ シ ン脱炭 酸 酵 素 活 性 測. 重 要 な役 割 を果 して い る こ とは周 知 の 通 りで あ ろ.. 定 の 際 に も ドーパ 脱 炭 酸 酵 素 や,イ. したが って,イ. て活 性 化 され る こ との 知 られ て い るチ ロ シン ア ミノ. ンス リン に よ る本 酵 素 の 活 性化 が上. ンス リン に よ っ.
(7) ラ ッ ト脳 内 ア ミン代 謝,チ ロ シ ン水 酸 化 酵 素 活 性 お よ び チ ロ シ ン脱炭 酸 反 応 に及 ぼ す イ ンス リン の 効 果 転移 酵 素24)を経 た後 の脱 炭 酸 酵 素 活 性 な どを含 めて 測定 した可 能 性 は否 定 で きな い.し か し,表2に. 結. 語. 示. した ご と く,ラ ッ トに イン ス リン を投与 した60分 後 の脳 内 チ ラ ミンの 増 加,な. 43. らびに脳 お よ び その 他 の. ウ イ ス タ ー 系 雄 ラ ッ トに0.1IU/100g体 ス リ ン を 筋 注 し て,フ. 重の イン. ェ ニ ー ル ア ラ ニ ン,チ. 臓 器 で の チ ラ ミン生 合 成 を反 映 す る血漿 中 の チ ラ ミ ン量 が 増加 して い る こ とは,少 な くと もチ ロ シ ン脱. 素 活 性,芳. 炭 酸 酵 素 が 活 性化 され た こ とを示 す もの で あ る と考. イ ン ス リ ン の ア ミ ン 代 謝 に お よ ぼ す 影 響 を 検 討 し た.. え られ る.ま た,酵 素 標 品 に混 在 す るチ ロシ ン水 酸. 結 果 は 次 の と お りで あ っ た.. 化 酵 素 を介 した,ド ー パか ら ドーパ ミンへ の脱 炭 酸. 1.イ. テ コ ラ ミ ン と チ ラ ミ ン値,チ. ロシン. 値,カ. ロ シ ン水 酸 化 酵. 香 族 ア ミ ノ 酸 脱 炭 酸 酵 素 活 性 を 測 定 し,. ン ス リ ン 注 射 後60分. で,生. 理 食 塩 水 を 注射 し. 反応 を含 め て測 定 した可 能 性 につ いて は,こ こで 用. た 対 照 群 に 比 べ て,血. い た チ ロ シ ン脱炭 酸 反応 液 のin vitroの 条件 では チ. お よ び脳 内 フ ェニ ー ル ア ラ、 ニ ン値 は低下 した が チ ロ. ロシ ン水 酸 化 酵素 活 性 が全 く認 め られ な か っ た(未. シ ン値 に は 変 化 が な か っ た.. 発表)と とか ら否 定 され よ う.一 方, Sundaresan25). 2.イ. に よ れ ば,チ ロ シ ン脱炭 酸 酵 素 の 至 適pHは5.5と. ノ ル ェ ピ ネ フ リ ン は 有 意 に 低 下,エ. され て い る が,本 研 究 で用 い た酵 素 標 品 にお け る至. ラ ミン 値 は 有 意 に 増 加 し た.脳. 適pHは. ノ ル エ ピ ネ フ リ ン は 有 意 に 低 下,エ. 図8に 示 す こと く7.8と 大 き く異 なる結 果 を. 糖 値 は47.3%に. ン ス リ ン 注 射 後60分. 得 た.こ れ らの こ と を含 め,イ ン ス リン投与 に よ っ. 加 の 傾 向 を 示 し,チ. て 活性 化 され た脱炭 酸酵 素 の同 定 確 認 に つ い て,今. 3.脳. 後 な お検 討 の 余 地 を残 して い る.. は イ ン ス リ ン 注 射 後60分. 最後 に,本 研 究 で は比 較 的少 量 の イ ンス リ ンを投. で,血. 低 下 し,血. 漿. 漿 中 ドー パ ミ ン, ピ ネ フ リ ン,チ. で は,ド‑パ. ミ ン,. ピネ フ リン は増. ラ ミン は 有 意 に 増 加 し た.. 線 条 体 お よ び副 腎 の チ ロ シ ン水酸 化 酵 素 活 性 で は,対. 照 群 よ り有 意 な 活. 性 増 加 を 示 し た.. 与 す る こ とに よ つて,チ ロ シ ン水 酸 化 酵 素 の 活性 化 に よ る と考 え られ る ド‑パ ミン お よ び ノル エ ピネ フ. 4.脳. 線 条 体 お よ び肝 の チ ロ シ ン脱炭 酸 反 応 は,イ. リンの 代謝 回転 の 促 進,お よびチ ロシ ン脱 炭 酸酵 素 の. 示 した.. ンス リン注 射 後60分 で,対 照 群 よ り有意 に高 い値 を. 活 性 化 に よ ろ チ ロ シンか らチ ラ ミンへ の代 謝 亢 進 が認. 5.イ. め られ た.カ テコラ ミンの 生 合 成 に焦 点 を合 わせ た 場. で は,チ ロ シ ン水 酸 化 酵 素 活 性 は,脳(小. 合 に はチ ロシ ン水 酸 化酵 素 が律 速 酵 素 で あ り,と の. 全脳)で は イ ンス リン注 射 後60分 で,副 腎 で は30分. 酵 素 が最 も重 要 な 調 節 の 役 割 を果 して いる ことは よ く. か ら90分後 に わ た って 活 性 の増 加 を認 め た.. ンス リン注 射 後 の 経 時 的変 化 を追 求 した結 果. ロ シ ン脱 炭 酸 は,脳,肝. 脳 を除 く. 知 られて いる ことで ある.しか し,内在 性 ホル モ ン で あ. 6.チ. る イ ンス リン の との よ うな効 果 を考 え た場 合,通 常. 分後 に高 い値 を示 した. L‑DOPAを. い ず れ で も30分, 60. の カテ コラ ミン代 謝 経路 だ け で な く,チ ラ ミンへ の. 合 の 芳 香族 ア ミノ酸 脱 炭 酸 酵素 活 性 は,脳では インス. 基 質 と し.た場. 代 謝 経路 お よ びp‑ヒ ドロキ シフェニ ル ピル ビ ン酸 へ. リン注 射後90分 に反 応 の 有 意 な増 加 が認 め られ た が,. の 経 路 とい っ た カ テ コ ラ ミン代 謝 の 側 副 経路 へ の代. 肝 で は対照 群 との間 に相 違 を認 め な か っ た.. 謝 を介 した間 接 的 な カテ コ ラ ミン生 合 成 の調 節 に も. 以 上 の結 果 か ら,イ ンス リンが チ ロシ ン水 酸 化 酵. あ らためて注 目 しな けれ ばな らな い と考 え られ る.沖. 素 活 性 を短 期 間 の うち に高 め,ド‑パ. 田5)はフェニールケ トン尿 症 患 者 に イ ン ス リンを投 与. ル エ ピネ フ リ ンの 生 成 を増 加 させ る もの と考 え られ. した後 の カ テ コ ラ ミンお よ びア ミノ酸 の変 動 を検 討. た,同 時 にL‑DOPAの. した成 績 か ら,イ ンス リンの 治療 的応 用 の可 能 性 に. てお り,こ の点 で も ドー パ ミンお よ び ノル エ ピ ネ フ. つ い て言 及 して い る,本 研 究 で の 成 績 が示 す よ うに,. リンの 代謝 回転 の 速 ま る.ことが推 測 され た.ま た,. ミン お よ び ノ. 脱 炭 酸 反応 も,脳 で 増 加 し. インス リンが単 に脳 中 フ ェニール アラニンを減 少 さ せ. チ ロ シ ン脱 炭 酸 反応 の 著 明 な増 加 は,血 漿 あ るい は. るば か りで な く,チロシ ン水 酸化 酵 素 や 脱 炭 酸酵 素 の. 脳 内 チ ラ ミン値 の 増加 と一 致 し,イ ンス リンが チ ラ. 活性 化 を介 して ド‑パ ミン お よ び ノル エ ピネ フ リン. ミン を経 る代 謝 経 路 を促 進 す る こ と を推 論 した .. の代 謝 回転 を促 進 させ る こ とは,フ. ェニ ール ケ トン. 尿 症 に対 す るイ ン ス リン治 療 の試 み に対 して も新 し い 論 拠 を与 える もの と考 え られ る..
(8) 44. 三. 好. 公. い た小 林 清 史 講 師 お よ び脳 代 謝 研 の皆 様 に厚 く御 礼. 稿 を終 え るに の ぞ み,御 指 導,御 校 閲 を賜 わ りま した高 坂 睦年 教 授 に深 く感 謝 い た します.ま. 明. た,終. を 申 し上 げ ます.. 始 御 助 言 と御協 力 を い ただ きま した盛 政 忠 臣博 士,. (本 論 文 の 要 旨 は 第7回 九 州,中 国,四 国 合 同生. 沖 田美 佐 子 博 士,論 文 作 製 にあ た っ て御 教 示 い た だ. 化 学 支 部 総 会(昭 和53年5月,松. 文 1.. Luft,. R.. line 2.. and. and. Elmadjian,. F.,. nephrine 16, 3.. 4.. von. Euler,. U. S.:. noradrenaline. in. Lamson,. and. E. T.,. 6.. A.,. nephrine. and. norepinephrine. Endocr.. Metab.. 21,. Patrick,. Moore,. R.. and. R.,. Freeman,. 7.. S.,. 296-304,. 7,. N.:. 山 医 誌,. Nadler,. H. L. Biol.. Curtius,. 87-96,. 88,. 107,. H.-Ch.,. 721-723,. Baerlocher,. L.:. Excretion. methacholine.. J.. adrena 1956. of. Clin.. epi. Endocr.. L. L.. Boling,. L.. and catecholamine. 42,. 235-239,. 1972.. Levitt,. M.. and. induced. Thorn,. G. W.:. hypoglycemia. Plasma. in. man.. epi. J.. Clin.. of. stimulation. on in. the. intact. level. and. of. tyrosine. denervated. hydroxylase,. rat. adrenal. glands.. 一編. カ テ コ‑ル. ア ミン 代 謝 に 及 ぼ す. Epinephrine. metabolism. in phenylketonuria.. Proc.. Soc.. 1961. K.. of dopa. and Vollmin,. synthesis. J. A.:. Pathogenesis. in patients. with. of phenylketonuria:. phenylketonuria.. in rat brain-cofactor requirements, 21, 1935-1944. 1972.. and Udenfriend,. S.:. Tyrosine. hydroxylase.. Clin.. regional J.. Biol.. Inhibi. Chim. Acta. and subcellu Chem.. 239,2910. 1964.. Christenson,. 141,. J. G., Dairman,. aromatic. 356-367,. 11 . 河 合 聡,今. L-amino. W. acid. and Udenfriend, decarboxylase. S.:. Preparation. from. and properties. hog kidney.. Arch.. of a homo. Biochem.. Biophys.. 1970.. 井 一 洋:生. 体 試 料 の 分 析 法(V)‑カ. テ コ ー ル ア ミン お よ び 代 謝 物 の 分 析(1)‑代. 謝6,. 915‑. 1969.. McCaman,. M. W.. in serum.. J. Lab. Clin.. Waalkes,. T. P.. and Robins,. and Udenfriend,. and tissues.. Lowry,. O. H., Rosebrough, phenol. 佐 々 木 禎 一: 病 理16,. Tagliamonte, of insulin. J.. reagent.. Lab.. J.. o‑Toluidineを. 45‑54,. Fluorimetric 885-890, S.:. Cln.. N. J., Biol.. method. A fluorometric Med.. Farr, Chem.. for. the. determination. of phenylalanine. for. the. of. 1962. method. 50, 733-736, A. L.. tyrosine. in. 1957.. and Randall,. 193, 265-275,. 用 い る 血 糖 の 簡 易 定 量 法‑特. estimation. R. J.:. Protein. measurement. with. the. 1951. にo‑Toluidine‑硬. 酸 法 を 中 心 と し て‑.臨. 床. 1968.. A., DeMontis, in the. E.:. Med. 59,. plasma. folin. 16.. and. of. 1017-1025,. 1976.. D. H.-Y.:. tion. geneous. 15.. Varjabedian,. insulin. insulin. catecholamines. Nagatsu,. 14.. excretion 16,. 1971.. 697‑708,. and Hsia,. Med.. T.,. Havens,. Effect. 9.. 13.. and. of. urinary. Endocr.. 1961.. Coyle; J. T.: Tyrosine hydroxylase lar distribution. Biochem. Pharmac.. 12.. R.. Clin.. ェ ニ ー ル ケ トン 尿 症 に 対 す る イ ン ス リ ン の 効 果.第. 影 響.岡. 924,. on. J.. Neri,. during. and. 沖 田 美 佐 子:フ. -2917,. H.,. levels. 8.. 10.. hypoglycemia. administration. Zileli,. Kirshner,. Pharmacol.. Exp.. insulin. hypophysectomy.. after. dopamine-ƒÀ-hydroxylase,. 5.. 献. 1956.. Goldfien,. Mol.. of. after. norepinephrine. 876-886,. Effect. man. 山)に て 発 表 した.). transport. M. G., Olianas,. M., Onali,. P. L.. of tyrosine. tryptophan. from. and. and blood. Gessa,. G. L.:. to brain.. Possible. Pharmacol.. role Res..
(9) ラ ッ ト脳 内 ア ミン代 謝,チ ロシン水 酸 化 酵素 活性 およ びチ ロシ ン脱 炭 酸 反応 に及 ぼす イ ンス リンの 効 果 Commun. 17.. Wade, the. 18.. 19.. L. A.. phragm. in. Kuczenski,. J.. hydroxylase V.. Biol.. by. and. and. brain. P. R.. and. An in. tyrosine ,. R. M.: J.. Biol.. Coursin,. apodecarboxylase.. L-dopa. transport. at. of. L-alanine. into. rat. dia. neutral. amino. acid. transport. across. act. directly. on. the. brain. to. increase. try. 1978.. C.. effect fat. transport. of. insulin. and. chelator.. M:. 2261-2265 Flora,. nature.. tyrosine. calcium. Vaughan,. 248, and. I. Hormon. Sundaresan,. a. of. 103-108,1977.. 1205-1208, M.. activity Rat. Chem. F. T.. 30,. nature. 1973.. 28,. Boadle-Biber,. on. inhibition. Does. the. 1975.. insulin. 6450-6455,. competitive. M. E.:. and. 837-842, of. Neurochem.. Neurochem. V. H.,. R.:. Kenney,. - 1-14C. Trulson,. phosphodigsterase. liver. 25.. and. acids. 25,. 248,. of J.. amino. Action. Chem.. barrier.. III,. Manganiello,. K. J.:. Kinetics. R. G. levels.. Synthetic Neurochem.. Biol.. M.:. brain. Morgenroth. J. 24.. J.. W.. tyrosine. R.: J.. McKirahan,. vitro.. MacKenzie,. - phate 23.. Katzman,. and. Pardridge, blood. 1975.. barrier.. T. R.. of 22.. and. Riggs,. ptophan 21.. 493-499,. blood-brain. the 20.. 7,. 45. of. cells.. Roth,. R. H.:. Mol.. Pharmacol.. insulin J.. Biol.. hydroxylase -. on. Dopaminergic. cyclic. Chem. activation. neurons;. 12,. 41-48,. adenosine 248,. 3•L,. 7164-7170.. by. activation. 1976. 5•L-monophos 1973.. limited. tryptic. proteolysis.. 1973. Induction Chem. D. B.:. of 236,. tyrosine-ƒ¿-ketoglutarate 2699-2702,. Microassay Methods. of in. transaminase. in. 1961. pyridoxal. Enzymology. phosphate 18. A,. using 509-512,. L-tyrosine 1970.. rat.
(10) 46. 三. Effects of catecholamines,. 好. of insulin. tyrosine. on. 明. the. hydroxylase in rat Kimiaki. Institute. 公. for Neurobiology, (Director:. metabolism and. tyrosine. decarboxylation. brain MIYOSHI. Okayama University. Medical School. Prof. M. Kohsaka). Wistar strain albino male rats (100g-150g) were injected intramuscularly with insulin (0.1 IU per 100g body weight). Quantitative analysis of phenylalanine and tyrosine in plasma and the brain cortex, and of catecholamines and tyramine in plasma and whole brain was per formed. The activity of tyrosine hydroxylase in brain striata and the adrenal glands, and the activities of tyrosine decarboxylase and aromatic amino acid decarboxylase in both the whole brain (except cerebellum) and the liver were also studied. The quantitative analysis of plasma phenylalanine wass performed using the method of McCaman and Robins. Tyrosine was analysed by the method of Waalkes and Udenfriend. Tyrosine hydroxylase activity was measured by the method of Coyle, and aromatic amino acid decarboxylase activity by the method of Christenson. Catecholamines were quantitated by the method of Kawai. All activities (Results 1-4) were determined 60 minutes after the insulin injection, the time by which hypoglycemia had definitely developed. The results were as follows; 1. Blood glucose decreased to 47.3% sixty minutes after the insulin injection. Phenylalanine in plasma and in the brain decreased significantly but tyrosine levels did not show any change. 2. In the blood, dopamine and norepinephrine decreased significantly whereas epinephrine and tyramine increased significantly. In whole brain (except cerebellum), dopamine and nor epinephrine decreased significantly, tyramine increased significantly, but epinephrine increased only slightly. 3. Tyrosine hydroxylase activities in striata and in the adrenal glands increased significantly. 4. Tyrosine decarboxylation in diencephalon combined with striata and in the liver was also high. 5. Tyrosine hydroxylase activity in whole brain (except cerebellum) was high 60 minutes to 90 minutes after the insulin injection. Tyrosine hydroxylase activity in the adrenal glands was high 30 minutes to 90 minutes after the insulin injection. 6. Tyrosine decarboxylation in the whole brain (except cerebellum) and in the liver was sig nificantly high 30 minutes to 60 minutes after the insulin injection. When L-DOPA was used as the substrate, the activity of aromatic amino acid decarboxylase in the brain increased 90 minutes after the insulin injection. The activity of this enzyme in the liver, however , was not different from that of in the liver of the control rats. These results suggest that insulin causes an increase in the activity of tyrosine hydroxylase and an increase in the production of catecholamines. It also accelerates the metabolic pathway from tyrosine to tyramine by increasing the activity of tyrosine decarboxylase ..
(11)
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In order to detect the changes in brain activity induced by PMR and control conditions, we first used 6.. whole-brain analysis
Pharmacological Effects of Benzodiazepines and Their in vivo Binding Sites in the Brain of Rats. 著者名(英)
