プロバイオティック乳酸菌由来免疫刺激性DNAのToll様受容体9を介する免疫修飾機構に関する研究

プロバイオティック乳酸菌由来免疫刺激性DNAの

Toll様受容体9を介する免疫修飾機構に関する研究

著者

下里 剛士

号

864

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/15960

氏

名(本籍)

学 位 の 種 類

学 位 記 番 号

学位授与年月 日

学位授与 の要件

研 究 科 専 攻

学 位 論 文 題 目

しも さと た け し

下

里

剛

士

博

士(農

学)

農

博

第864号

平

成18年3月24日

学 位 規 則 第4条

第1項

該 当

農 学研 究科 生物 産業創 成 科学 専攻

(博士 課程)

プ ロバ イ オ テ ィ ッ ク乳 酸 菌 由来 免 疫刺 激 性DNAのToll

様受 容体9を 介す る免 疫修 飾機 構 に関す る研 究

論 文 審 査 委 員

澤

藤

井

生

川

北

齋

駒

麻

白

授

授

授

授

授

教

教

教

助

教

教

助

助

 

 

査

査

主

副

(

(

春

樹

忠

夫

三千夫

久

仁

論

文

内

容

要

旨

緒言

プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス は,腸 内 菌 叢 を 改 善 し宿 主 に 有 益 な 生 理 効 果 を も た ら す 微 生 物 の 総 称 で あ り,昨 今 の 健 康 ブ ー ム の 追 い 風 を 受 け 広 く世 の 中 に 浸 透 した.こ れ ま で,プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス の 代 表 で あ る 乳 酸 菌 は,「 お な か の 調 子 を 整 え る 」 と い っ た 整 腸 作 用 が と く に 注 目 さ れ,厚 生 労 働 省 認 可 の 特 定 保 健 用 食 品 に 多 く 利 用 さ れ て き た.さ ら に2001年 に は,プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 の 経 口 摂 取 に よ り,ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 な ど の ア レル ギ ー 症 状 が 軽 減 した と い う ト ピ ッ ク が 拍 θL∂ ηo就 誌 に 掲 載 さ れ,プ ロバ イ オ テ ィ ク ス と腸 管 免 疫 系 の 関 係 に つ い て 食 品 分 野 の み な ら ず,医 薬 分 野 か ら も 注 目 さ れ る よ う に な っ た. 現 在,我 が 国 で は ス ギ 花 粉 症 や ア ト ピー 性 皮 膚 炎 な ど,若 年 層 を 中 心 に 国 民 の お よ そ1/3が な ん ら か の ア レル ギ ー を発 症 して お り,大 き な 社 会 問 題 に 発 展 して い る. こ の よ う な 社 会 背 景 か ら,平 成13年 に は 「花 粉 症 等 ア レル ギ ー 症 対 策 議 員 連 盟 」 が 結 成 さ れ,ア レル ギ ー 関 連 国 家 予 算 は こ こ τ0年 間 で 約40倍 に 増 え て100億 円 を 突 破 し,ア レル ギ ー 予 防 ・改 善 に 関 す る 研 究 が 急 務 の 課 題 と な っ た. そ こで 本 研 究 で は,プ ロバ イ オ テ ィ ック 乳 酸 菌 の 抗 ア レル ギ ー 作 用 に 注 目 し,「 プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 の ど の 成 分 が,何 を 介 して,ど の よ う に 免 疫 系 に 作 用 す る の か?」 と い う 疑 問 っ い て 科 学 的 に 証 明 す る こ と を 目 的 と し,と く に,プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 成 分 の 中 で も,未 解 明 な ゲ ノ ムDNAお よ びDNAモ チ ー フ の 免 疫 賦 活 作 用 に つ い て,免 疫 細 胞 に 発 現 す るCpGDNA受 容 体 「Tol}一likereceptor9 (TLR9)」 に 着 目 し て 追 求 した.

第 二 章

ブタTbll様 受 容体9の

ク ロー ニ ング

【目 的 】 当 研 究 室 で は 免 疫 賦 活 化 機 能 を有 す る 食 品 の 開 発 を 目 指 す 上 で,ヒ トモ デ ル 系 と して の ブ タ 腸 管 に 注 目 し て き た.ブ タ は 単 胃 動 物 で,消 化 器 系 が ヒ トに 近 い こ と か ら,腸 管 に お け る 食 品 機 能 を 解 析 す る 上 で そ の 有 用 性 が 大 い に 期 待 で き る 。 プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 由 来 免 疫 刺 激 性DNAの 腸 管 免 疫 系 に 与 え る 影 響 に つ い て 解 析 す る た め に は,ま ず 初 め に ブ タTLR9遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ が 必 要 不 可 欠 で あ る.そ こ で 本 章 で は,腸 管 免 疫 系 の 主 役 を な す 腸 管 バ イ エ ル 板 か ら ブ タTLR9遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ を 行 っ た.

【結 果 】 ブ タ 回 腸 由 来 バ イ エ ル 板 よ り抽 出 し たmRNAを テ ン プ レ ー ト と し て 各 種 プ ラ イ マ ー に よ りRT-PCRを 行 い,得 ら れ た ブ タTLR9cDNAフ ラ グ メ ン トの オ ー バ ー ラ ッ プ に よ り_{,cDNA全 塩 基 配 列 を 決 定 し た.そ の 結 果1,030の ア ミ ノ 酸} 残 基(MW;]15.9kDa)を コ ー ドす る3,093bpのORFを 含 む3,329bの ブ タTLR9 cDNA塩 基 配 列 を 決 定 す る こ と が で き た.ブ タ 丁LR9cDNAヌ ク レ オ チ ド配 列 は マ ウ ス や ラ ッ トな ど の 趨 歯 類 に 比 ベ ヒ トや ネ コ に 対 して 高 い 相 同 性 を 示 した(稔bie 1) .ア ミ ノ酸 配列 に つ いて,シ グナ ルペ プ チ ド(SP),ロ イ シ ン リ ッチ リピー ト(LRRs), トラ ン ス メ ン ブ レ ン(TM)領 域 お よ びTbl1/interleukin-1レ セ プ タ ー(TIR)ド メ イ ン を タ ンパ ク ドメ イ ン 解 析 ソ フ ト 「SMART」 に よ り 解 析 し た(Fig.逢).そ の 結 果,ブ タTLR9はC末 端 に 近 い 部 分 ほ ど相 同 性 が 高 い こ とが 特 徴 的 で,TMを 境 に 細 胞 質 側 のTiRド メ イ ン領 域 に つ い て は 極 め て 高 い ホ モ ロ ジ ー を 示 した(iable2). 【考 察 】TLRフ ァ ミ リー は そ の構 造 的 特 徴 と し て,細 胞 外 にLRRs,細 胞 内 にTIR ドメ イ ン を 持 つ.ブ タ,ヒ ト,マ ウ ス お よ び ネ コTLR9の ア ミ ノ 酸 配 列 を 基 に し た タ ンパ ク ドメ イ ン 解 析 で は,細 胞 外 のSP,LRRsよ り,TM領 域 か ら 細 胞 内 側 のTIR ドメイ ン で 相 同 性 が 高 く,種 を 超 え て 保 存 さ れ て い る こ と が 分 か っ た.こ め こ と は, TLR9に お い て,CpGDNAと 接 触 し,認 識 す る 領 域 に は 種 特 異 性 が あ る 一 方 で, 認 識 後 の シ グ ナ ル 伝 達 を 促 す 細 胞 内 ドメ イ ン 領 域 で 起 こ る 反 応 機構 に,種 間 を 超 え て 共 通 性 が 高 い と い う こ と を 意 味 す る.す な わ ち,LRRs部 分 が 種 を 超 え て 保 存 性 が 低 い こ とか ら,認 識 さ れ るDNA配 列 とTLR9と の 相 互 作 用 が,種 に よ っ て 多 様 で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ た.

第三章

ブタ τbll様受容体9の

腸管免疫 組織 にお ける発 現解 析

【目 的 】 丁LR9は 主 と し て 樹 状 細 胞 や マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど の 自 然 免 疫 系 の 細 胞 の 濾 胞 膜 表 面 に 発 現 し,病 原 細 菌 由 来 の ゲ ノ ムDNAを 認 識 す る 受 容 体 タ ン パ ク 質 で あ る. し か し な が ら,各 種 腸 管 組 織 に お け るTLR9の 発 現 程 度,発 現 部 位 の 詳 細 は 未 だ 解 明 さ れ て い な い.そ こ で 本 章 で は,タ ン パ ク 質 レ ベ ル でTLR9の 発 現 解 析 を 行 う た め に,成 熟 ブ タ お よ び 初 生 仔 ブ タ の 各 種 臓 器 お よ び 腸 管 免 疫 組 織 を 用 い て,TLR9 の 発 現 量 と局 在 性 に つ い て 解 析 した. 【結 果 】 定 量 的PCR法 に よ り脾 臓 を1.0と し た と き の 各 種 組 織 に お け るTLR9

mRNA発 現 量 を 数 値 化 し,評 価 し た.そ の 結 果,成 熟 ブ タ に お い て バ イ エ ル 板 と 腸 間 膜 リン パ 節 に お い て 脾 臓 の 約3倍 の 高 い 発 現 を 発 見 し た.一 方,初 生 仔 ブ タ で は 腸 間 膜 リン パ 節 に お い て 脾 臓 の 約1.4倍 の 発 現 が 認 め ら れ た(Fig.2).ま た,抗 ブ タTLR9ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 成 後,ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 に よ り,ブ タ 脾 臓 お よ び 腸 管 組 織(十 二 指 腸 空 腸 回 腸 バ イ エ ル 板,腸 間 膜 リ ンパ 節)の 中 で も, バ イ エ ル 板 お よ び 腸 間 膜 リ ン パ 節 に お い て の みTLR9が 検 出 さ れ た(Fig.3).さ ら に 免 疫 組 織 化 学 的 手 法 に よ りバ イ エ ル 板 お よ び 腸 間 膜 リ ンパ 節 に お け るTLR9の 局 在 性 に つ い て 解 析 し た.そ の 結 果,バ イ エ ル 板 で は,M細 胞 が 散 在 す る ドー ム 上 皮 や 円 柱 上 皮 細 胞 直 下 の 基 底 膜 周 辺 領 域 や ドー ム 上 皮 側 の リ ン パ 濾 胞 間 域 に 同 発 現 細 胞 が 数 多 く認 め ら れ た(F;g.4).腸 間 膜 リ ン パ 節 で は,一 次 リ ン パ 濾 胞 内 や 二 次 リ ン パ 濾 胞 内 の 胚 中 心 周 辺 領 域 に樹 状 細 胞 様 の 形 態 を し たTLR9を 発 現 し た 細 胞 が 数 多 く認 め ら れ,リ ン パ 濾 胞 間 域 に も 数 多 く認 め られ た(Fig.4). さ ら に 詳 細 な 細 胞 レベ ル に お け るTLR9の 発 現 解 析 を 行 う た め,バ イ エ ル 板 お よ び 腸 間 膜 リ ン パ 節 よ り 細 胞 を 調 製 し,抗 ブ タTLR9ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体,CD45 (白 血 球 マ ー カ ー),CD21(B細 胞 マ ー カ ー),サ イ トケ ラ チ ン18(M細 胞 マ ー カ ー)で 染 色 し た 後,フ ロ ー サ イ トメ ト リー 法 に よ り 解 析 した.そ の 結 果,バ イ エ ル 板 で は3つ の 細 胞 集 団(R1,R2,R3),腸 間 膜 リ ン パ 節 で は バ イ エ ル 板 に お い て 見 ら れ たR3ゲ ー トを 除 く2つ の 細 胞 集 団(R1,R2)が 存 在 し た(Fig.5).そ れ ぞ れ の ゲ ー トに 含 ま れ る 細 胞 に つ い て ブ タTLR9の 発 現 解 析 を 行 っ た と こ ろ,R1 に 含 ま れ る 細 胞 集 団 で はCD45陽 性 の 細 胞 集 団 が 多 く観 察 さ れ,ブ タTLR9の 発 現 が 認 め ら れ た(Flg.5).ま た,R2に 含 ま れ る 細 胞 集 団 で は,CD21陽 性 の 細 胞 集 団 が 多 く観 察 さ れ,ブ タTLR9の 発 現 が 認 め ら れ た(Flg、5).さ ら に,R3に 含 ま れ る 細 胞 集 団 は 上 皮 系 の 細 胞 集 団 で あ り,サ イ トケ ラ チ ン18陽 性 のM細 胞 に お け るTLR9の 発 現 が 認 め ら れ た(Flg.5).

【

考察 】 ヒ トのモデル系 と して期待 されるブタ腸管綿 織 における,TLR9発

現解析

によ り,生 体防御 の最前線で あ る腸管免疫 系のバイエル板 および腸間膜膜 リンパ節

において,強 いTLR9の

発現 を初 めて発見 した.ま た,バ イエル板上皮細胞 中に散

在 す るM細

胞 に お け るTLR9の

発 現 を見 出 した ことは大 変 興味 深 い.近 年,医 学 ・

免疫学 の分 野にお いて腸 管免疫 系の重 要性 が注 目されて いるが,基 本的な免疫機構

につ いての知見が少 な く,そ の機構解 明が大 いに期待 されて いる.そ の中で,本 研

究 によ り得 られ た新知見 は,プ

ロバ イオティ ック乳酸 菌由来の免疫刺激性 を有 する

ゲ ノムDNAに

よる腸管 おける免疫調節作用がTLR9を

発現 するM細

胞を介 し,パ

イエル板および腸間膜 リンパ節において発揮 され ることを蜂 く示唆 した.

第 四章 ブタTbll様 受 容体9強

制発現細胞株 を用 いた免疫刺激 性DNA

評価系の構築

【

目的】本章では,プ ロパイオテ ィック乳酸菌 由来 の免疫刺激性DNAがTLR9を

介 して免疫応答 を誘導す るか否か を検討す る目的 か ら,TLR9強

制 発現細胞 株 を構

築 し,TLR9を

介するDNAの

取 り込み,細 胞内 シグ ナ リングを介 してサイ トカイ

ン産 生に至る一連の伝達 経路を解析 した.本 評価系 は,多 様 なDNAモ

チー フに対

する免疫 活性評価系 と して,今 後,病 原性細菌 の負の評価 や乳業 用乳酸 菌の正の評

価 が同時に可能 とな るこ とか ら,機 能性食 品開発 にお け る重 要な ツール として位置

づけられる.

【結 果 】 リ ポ フ ェ ク シ ョ ン 法 に よ り ブ タTLR9発 現 ベ ク タ ー をHEK293細 胞 お よ びCHOK-1細 胞 に 導 入 し,TLR9発 現 陽 性 細 胞(TLR9ト ラ ン ス フ ェ ク タ ン ト)を セ レ ク シ ョ ン し た(Flg.6).DNA試 料 に は,当 研 究 室 で 見 出 し て い る 免 疫 賦 活 化

乳 酸 菌DNAモ チ ー フ,A丁5ACL(ム.g∂ssθr/JCM1131Tゲ ノ ムDNA由 来)に 加

え,CpGモ チ ー フ お よ び そ の シ トシ ン メ チ ル 化 モ チ ー フ を 用 い た('τ 含ble3).そ の 結 果,.TLR4の リ ガ ン ド と して 知 ら れ,本 実 験 で はTLR9に 対 す る ネ ガ テ ィ ブ コ ン トロ ー ル と して 用 い た リボ 多 糖(LPS)を 除 く全 て のDNAモ チ ー フ がTLR9を 介 し て 取 り込 ま れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た.塩 基 配 列 の 違 い に よ るDNA取 り 込 み 量 に は 大 き な 差 が 無 く,興 味 深 い こ と に シ ト シ ン メ チ ル 化CpG配 列 やCpG配 列 を 全 く含 ま な い 痴 「5ACLもTLR9を 介 し て 取 り込 ま れ て い た. 次 にTLR9ト ラ ン ス フ ェ ク タ ン ト にNF-kapPaBreporterベ ク タ ー を コ ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し た 細 胞 株 を 構 築 し,各 種DNAモ チ ー フ で 刺 激 し た 際 のNF-kappaB活 性 を ル シ フ ェ ラ ー ゼ ア ッセ イ 法 に よ り測 定 し た.そ の 結 果,ヒ ト型 最 適 配 列 で あ るCpG2006で ブ タ 型 最 適 配 列 のD25を 上 回 る 強 い 活 性 が 認 め ら れ た. マ ウ ス 型 最 適 配 列 のCpG1826お よ び 非CpG配 列 のiMTL504に も 活 性 が 見 ら れ た.さ ら に プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 ゲ ノ ム 由 来 のA丁5ACLも 強 いNF-kapPaB 活 性 を 有 し て お り,TLR9を 介 し て 免 疫 応 答 を 誘 導 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た (Fig.7).ま た,サ イ トカ イ ン の 産 生 に つ い て 定 量 的PCR法 お よ びELISA法 に よ

り解 析 した.そ の 結 果,.AT5ACLは 強 いTh-1系 免 疫 誘 導 能 を 有 す る こ と が 明 ら か と な っ た(Flg,8).こ れ ら の こ と か ら,プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 の 染 色 体 ゲ ノ ム DNA中 に は,免 疫 刺 激 性 を 示 す 新 規 な 配 列 が 含 ま れ て い る こ と が 考 え ら れ,本 研 究 は 機 能 性 食 品 の 開 発 の み な ら ず,医 薬 分 野 に お け るDNAワ ク チ ン の 開 発 に 向 け た 基 盤 研 究 と して も 大 変 有 意 義 で あ る. 【考 察 】TLR9ト ラ ン ス フ ェ ク タ ン トを 用 い たDNA取 り 込 み 解 析 お よ

びNF-kappaB活 性 測 定 に よ り,プ ロ バ イ オ テ ィ ック 乳 酸 菌 ゲ ノ ムDNA由 来 のAT5ACL

モ チ ー フ はTLR9を 介 して,CpG2006やD25な ど と同 程 度 の 取 り込 み が 認 め ら れ た.ま た,NF-kappaB活 性 やTh-1系 サ イ トカ イ ン の 誘 導 に お い て もA丁5ACL は 強 い 活 性 を 示 し た.し か し な が ら,TLR9を 介 す るDNAモ チ ー フ の 取 り込 み 強 度 と 以 降 の シ グ ナ リ ン グ 活 性 の 誘 導 に は 相 関 関 係 は 低 く,腸 管 の 常 在 性 乳 酸 菌 由 来DNAに 対 す る 免 疫 応 答 の 巧 妙 な 調 節 機 構 の 存 在 も 示 唆 さ れ た.ネ ガ テ ィ ブ コ ン トロ ー ル と して 用 い た シ トシ ン メ チ ル 化CpGモ チ ー フ やLPSに お い て 活 性 が 見 ら れ な か っ た こ と も あ わ せ る と,NF-kappaB活 性 やTh-1系 サ イ トカ イ ン を 測 定 す る 本 ア ッセ イ 系 は,様 々 なDNA配 列 の 免 疫 活 性 を 評 価 す る 優 れ た 手 法 で あ る と 考 え られ た. Th-1系 の サ イ トカ イ ン は 抗 ア レル ギ ー 性 サ イ トカ イ ン と も 呼 ば れ,Th-2系 に 偏 っ た ア レル ギ ー 状 態 を 改 善 で き る 因 子 と し て 考 え ら れ て い る.近 年,乳 酸 菌 の 新 た な 生 理 効 果 と して 抗 ア レ ル ギ ー 作 用 が 注 目 さ れ,食 品 業 界 を 中 心 に 抗 ア レ ル ギ ー 効 果 を 謳 っ た 商 品 開 発 が 盛 ん に 行 わ れ て い る.そ の よ う な 社 会 背 景 か ら も, Th-1系 サ イ トカ イ ン を 産 生 誘 導 す る よ うな 免 疫 刺 激 性DNAに つ い て,そ の メ カ ニ ズ ム をTLR9を _{介 す る 免 疫 反 応 系 と して 容 易 に 理 解 す る こ と が で き る .さ ら に} TLR9ト ラ ン ス フ ェ ク タ ン トは,今 後,抗 ア レル ギ ー 食 品 開 発 に お け る 重 要 な ツ ー ル と して 利 用 さ れ る と 期 待 で き る ,

第五章 新規免疫刺激性Arオ

リゴヌク レオチ ドの活性発現構造特性 と

Tbll様 受容体9を 介 する認識 メカニズムの解 明

【目 的 】 本 章 で は,前 章 に お い て 明 ら か と な っ たTh月 系 免 疫 応 答 を 誘 導 す るL.

ら に はTLR9に よ る 認 識 メ 力 ニ ズ ム を 解 明 す る こ と を 目 的 と し た.そ こ でL.g∂ssθr1

の な か で も 明 治 乳 業 株 式 会 社 か ら 発 売 さ れ て い る 「プ ロ ビ オ ヨ ー グ ル トLG21」 に

使 用 さ れ て い る プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌Lg∂sser/OLL2716株 の ゲ ノ ム 配 列 情

報 と,A丁5ACLに 含 ま れ るA丁 コ ア 配 列(5'一ATTTTτAC-3')と の 相 同 性 解 析 か ら 発

見 さ れ た280種 の 各 種AT一 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド(ODN)の 中 か ら,強 いTh-1系 免 疫 応 答 を 誘 導 す る 新 規AT-ODNを 選 抜 す る こ と を 目 的 と し た 。 ま た,免 疫 刺 激 性ODN の2次 構 造 解 析 に よ り,活 性 と構 造 の 関 係 に つ い て 解 析 す る こ と に し た.さ ら に, TLR9に お け るDNA結 合 領 域 を 探 索 し,TLR9に よ るA丁一〇DNの 認 識 性 に つ い て 解 析 した. 【結 果 】ブ タ 腸 間 膜 リン パ 節 細 胞 を 用 い た 幼 若 化 活 性 試 験 に よ り,280種 のAτ 一〇DN 中 か ら と く に 活 性 の 強 か っ た 上 位13種 を 選 抜 し た.さ ら に,こ れ ら の13種 の A下一〇DNに つ い て,ブ タ パ イ エ ル 板 細 胞,ブ タ 脾 臓 細 胞 お よ び ヒ ト末 梢 血 単 核 球 細 胞 に対 す る 幼 若 化 活 性 試 験 とTLR9ト ラ ン ス フ エ ク タ ン トを 用 い たNF-kapPaB活 性 測 定 に よ る2次 ス ク り一 ニ ン グ を 実 施 し,最 後 に,Th-1系 サ イ トカ イ ン 産 生 量 に つ い て 定 量 的PCR法,EuSA法 を 用 い て 測 定 し た.そ の 結 果,最 も 強 くTh-1 系 免 疫 応 答 を 誘 導 す るAτ 一 〇DN(LGAT-243;5'一1-rAACAATT'rT工ACCCAAGA-3')を 発 見 し た(Fi9.9).A下 一〇DNの2次 構 造 解 析 の 結 果 か ら,ル ー プ 内 塩 基 数6 個 のODNが と くに 強 い 活 性 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た.さ ら に,CpG2006と

LGATL243の 塩 基 置 換 型ODNの 活 性 を ヒ ト末 梢 血 単 核 球 か ら のIFN一 γ とIL・12P70

産 生 能 を 指 標 と し て 検 討 し た 結 果,ス テ ム の 部 分 に5'一C_G-3'構 造 が あ る 場 合 に よ り強 い活 性 を 示 す こ と が 明 ら か とな っ た(Fig.10). 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 測 定 装 置 「BIACORE」 を 用 い てTLR9細 胞 外 ドメ イ ン(ECD) の 中 か ら 免 疫 刺 激 性DNAの 結 合 領 域 を探 索 し た.そ の 結 果,ECDのC末 端 側 に 位 置 す る ロ イ シ ン リ ッ チ リ ピー トが4個 連 な っ た 領 域 に お い て 強 い 結 合 性 が 見 出 さ れ た(Fi9,肩). 【考 察 】 本 章 で は,Lg∂ssθrプOLL2716株 ゲ ノ ムDNA由 来 の 強 い 免 疫 刺 激 性 AT-ODN(LGAτ 一243)を 見 出 し た.ま た,280種 のATLODNの 幼 若 化 活 性 試 験 の 結 果 と2次 構 造 解 析 に よ り,活 性 増 強 に は6塩 基 ル ー プ と ス テ ム 内 に5・ 一C_G-3'構 造 が 必 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た.こ れ ま でCpGを コ ア と す る 側 鎖 の 塩 基 配 列 を 基 準 と す る1次 構 造 よ り考 え ら れ て き た 免 疫 刺 激 性 の 構 造 相 関 に 関 す る 知 見 と

は 別 に,2次 構 造 か ら の ア プ ロ ー チ に よ り,CpGお よ び 非CpG-DNAの 免 疫 刺 激 性 に お け る 構 造 特 性 に っ い て,新 た な 理 論 の 展 開 に 繋 が る 基 礎 情 報 が 得 ら れ た.ま た,TLR9細 胞 外 ドメ イ ン の 中 か ら免 疫 刺 激 性DNAと 結 合 す るLRRド メ イ ン を 同 定 し た.TLRフ ァ ミ リ ー に よ る リ ガ ン ド認 識 メ カ ニ ズ ム は 未 だ 解 明 さ れ て お ら ず, こ のTLR9に お い て 発 見 した 領 域 は 他 のTLRフ ァ ミ リー に も 高 度 に 保 存 さ れ て い る 領 域 で あ りTLRフ ァ ミ リ ー の そ れ ぞ れ が 特 徴 的 に リ ガ ン ドを 認 識 す る 分 子 メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る 上 で 重 要 な 知 見 と考 え ら れ る.

第六章

総括

近年,プ ロバイ オテ ィクスの免疫機 能 に関す る研究 が進展 し,医 学 と食品科 学の

境界領域研究 と して注 目されて いる.国 内で はア レルギ ー予防効果 を狙 った新 商品

く が 誕 生 す る な ど,プ ロバ イ オ テ ィ ク ス の 免 疫 機 能 性 は 確 実 に 消 費 者 の 間 に 浸 透 し て き て い る.2003年 に は,Clancyに よ り プ ロ ベ イ オ テ ィ ク ス の 中 で も,と く に 腸 管 免 疫 調 節 を 介 し て 生 体 の 健 康 維 持 ・増 進 に 寄 与 す る も の を 「イ ム ノ バ イ:オテ ィ ク ス 」 と 呼 ぶ 新 し い 概 念 が 提 唱 さ れ,そ の 有 用 性 が 大 い に 期 待 さ れ て い る.一 方 で, プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 由 来 の 生 理 活 性 因 子 の 化 学 構 造 や そ の 活 性 発 現 メ 力 ニ ズ ム に 関 す る 分 子 レベ ル で の 詳 細 な 解 明 が,新 た な 機 能 性 食 品 の 創 製 を 考 え る 上 で 解 決 す べ き 課 題 とな っ て い る.本 研 究 で は,プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 由 来DNAとTLR9と い う 新 し い切 り 口 か ら 研 究 を 展 開 し,新 規 プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 由 来 の 免 疫 刺 激 性DNA の 発 見 か ら,DNA免 疫 活 性 評 価 法 の 構 築 さ ら に はTLR9の 認 識 す るODN構 造 に興 味 深 い新 知 見 を 得 る こ と が で き た. 一 般 に ,哺 乳 類 に お け る生 体 防 御 機 構 は,ま ず 侵 入 し た 病 原 体 の 認 識 に 始 ま る が, そ の 侵 入 を 察 知 す る の がTLRで あ り,現 在 ま で に 遺 伝 子 レベ ル で は14種 類,タ ン パ ク 質 レベ ル で は11種 類 が 確 認 さ れ て い る.こ れ ら 一 連 のTLRフ ァ ミ リ ー は,そ れ ぞ れ 細 菌 に 特 異 的 な 分 子 パ タ ー ン(PAMPs)を 有 す る 細 菌 性 モ デ ュ リ ン を 認 識 し,サ イ ト カ イ ン を 介 して 免 疫 応 答 を 制 御 す る も の と 考 え ら れ て い る.2000年 に 阪 大 微 研 の 審 良 ら の グ ル ー プ がCpGDNAの 受 容 体 分 子 と し てTLR9を 同 定 し て 以 来,微 生 物 由 来 の 免 疫 刺 激 性CpGDNAの 作 用 機 序 と 医 薬 分 野 に お け る 応 用 研 究 が 加 速 した.当 研 究 室 で は,こ れ ま で プ ロバ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 由 来 ゲ ノ ムDNAに 注 目 して 免 疫 刺 激 性 配 列 の 検 索 を 行 っ て き て お り,こ れ ま で に 新 規 な 免 疫 刺 激 性ODN 配 列 を 公 表 して き た.中 で もL.9∂sserブJCM1131T株 か ら ア デ ニ ン(A)と チ ミ ン(T)

か ら な る 酊 コ ア 配 列 を 含 み,CpG配 列 を 全 く 含 ま な い 興 味 深 い 配 列 を 発 見 し, 「A丁一〇DN」 と命 名 し た_{.本 研 究 で は,Aτ 一〇DNの 免 疫 機 能 性 に つ い て 詳 細 に 解 析} す る 目 的 か ら,TLR9に 注 目 しAトODN刺 激 に よ る サ イ トカ イ ン 産 生 に つ い て,TLR9 トラ ン ス フ ェ ク タ ン トを 構 築 し解 析 し た 結 果,Th-1系 免 疫 誘 導 能 を 有 す る こ と が 明 ら か と な っ た.こ の こ と か ら,AT-ODNが 新 規 な 免 疫 刺 激 性ODNで あ る と 同 時 に, 非CpG-DNAもTLR9の リ ガ ン ド と な る こ と が 明 ら か と な っ た.さ ら に,現 在 ま で に 報 告 さ れ て い る 非CρG-ODNの 活 性 発 現 に は,核 酸 分 解 酵 素 に 耐 性 の チ オ ー ル 化 が バ ッ ク ボ ー ン に 必 須 で あ る の に 対 し,AT-ODNの 活 性 発 現 に は そ れ が 必 ず し も 必 要 で な い こ と か ら,AT-ODNの 免 疫 活 性 発 現 と構 造 相 関 に 興 味 が 持 た れ た. 免 疫 刺 激 性ODNに は 種 特 異 性 が あ り,マ ウ ス 型DNAモ チ ー フ は,ヒ ト由 来 免 疫 細 胞 に 対 し て 活 性 の 低 い こ と も 明 ら か と な っ て い る.種 特 異 性 の 発 現 に は 上 記 の 構 造 特 性 に 関 連 が あ る か も しれ な い が,こ の こ と は,将 来 の ヒ トへ の 応 用 を 考 慮 し た 免 疫 研 究 に は,場 合 に よ っ て は 詔 歯 類 に 代 わ る モ デ ル 系 が 必 要 で あ る こ と を 示 唆 し て い る.本 研 究 で は,プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 由 来 のDNAが 腸 管 免 疫 調 節 作 用 を 有 す る こ と を 明 ら か に し,ま た,腸 管 関 連 リ ン パ 組 織 やM細 胞 に お け るTLR9の 強 い 発 現 を 見 出 し た.こ れ ら の 知 見 を 基 に,免 疫 刺 激 性DNAに 対 す る 評 価 系 と し て, ブ タTLR9ト ラ ン ス フ ェ ク タ ン トを 用 い る 分 子 免 疫 評 価 シ ス テ ム を 提 案 し た.ヒ ト モ デ ル と し て の ブ タ 腸 管 は 組 織 培 養 か ら 加Mlvo試 験 ま で を 総 合 的 に 行 え る た め,強 い 免 疫 刺 激 性 因 子 や そ れ を 有 す る プ ロ パ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 を ス ク リー ニ ン グ 後, ヒ トへ の 効 果 が 直 接 期 待 で き る こ と か ら,本 シ ス テ ム は,詔 歯 類 と霊 長 類 の 免 疫 反 応 性 の 大 き な ギ ャ ッ プ を 埋 め る,よ り ヒ トに 近 い 評 価 法 と 考 え ら れ,将 来 の 特 定 保 健 用 食 品 な ど の 評 価 法 と し て 使 用 可 能 と考 え て い る. 現 在,免 疫 刺 激 性DNAを 用 い た ワ ク チ ン の 開 発 は,感 染 症,が ん,ア レル ギ ー, 炎 症 性 疾 患 の 予 防 お よ び 治 療 な ど の 分 野 で,幅 広 い 応 用 が 期 待 さ れ て い る.最 近 で は,プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 由 来 のDNAが 潰 瘍 性 大 腸 炎 を 改 善 した と す る 興 味 深 い 知 見 が 得 ら れ,プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 由 来 の 免 疫 刺 激 性DNAがTLR9を 介 し て 様 々 な 疾 病 の 予 防 や 改 善 に 寄 与 す る 可 能 性 が あ り,新 た な 利 用 性 が 開 拓 さ れ る か も し れ な い.今 後,乳 酸 菌DNAの よ う に 新 た な 免 疫 刺 激 性 因 子 の 特 定 と そ の 受 容 体 を 介 す る 活 性 発 現 メ カ ニ ズ ム の 解 明 を 通 し て,自 然 免 疫 か ら 獲 得 免 疫 の 基 本 的 な 免 疫 シ ス テ ム を 食 品 免 疫 学 の 観 点 か ら 応 用 し,感 染 症,ア レ ル ギ ー や 炎 症 性 疾 患 な ど の 予 防 や 改 善 に 寄 与 す る 新 た な 「プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク 食 品 」 の 創 製 が 実 現 す る も の と 信 じ て い る.

Table1.HomologyofswineTLRStovariousspeciesinthenucleotideand aminoacitlsequences nuclAotitlesequenceaminoacitlsequence.Sp已 εieshomologyhomology human64.8%81.8% mouse781%ア4ggも rat卜77.3『 も ア2、59b cat86.7%B6.7% bOVm種87.49も84,9摯 』 sheep87.5%85.0% Table?.HomologyofswineTLRgtovariousspeciesinproteindomain SpeciesSPLRRsTM TIR humaロ71.4%ア9.3%72.2% mouseア6、2%ア0.8%66.7% rat71.4qも67.7弓 も61.1『 も ca電69.2弓 も85、09も7:∼.⊇9も bovineア2.oqも83,8『 も72,:∼9b Sheepア6,0qも83、5qも72.2『 』 91.8% 89,89も 5L2% 95.9% 93.?% 94.6% SW旧e human mouse rat cat bovine sheep D100_OOaa 一 一

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論 文 審 査 結 果 要 旨

近 年,プ ロバ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 の ア レ ル ギ ー 低 減 作 用 が 注 目 さ れ,乳 酸 菌 の も つ 新 た な 生 理 機 能

性 に 関す る興 味 関 心 が 高 ま っ て い る 。本 研 究 で は,プ ロ バ イ オ テ ィ ッ ク乳 酸 菌 の 免 疫 調 節 機 能 に つ い て,

活 性 因 子 とそ の 免 疫 調 節 機 構 を 分 子 レベ ル で 解 明 す る こ と を 目的 と した 。

初 め に,Loc∫oう αc∫11μ∫8α∬6r∫(L.8α ∬6r∫)JCM1131T株 の ゲ ノ ムDNA由 来 のAr一 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ

ド(Ar-ODN)の 免 疫 機 能 特 性 の 詳 細 と そ の 作 用 機 序 に つ い て 追 求 し た 。 と く に,2000年 に 微 生 物

DNAの 受 容 体 と して 同 定 さ れ たTol1様 受 容 体(TLR)9に い ち 早 く着 目 しAr-ODNと の 関 係 を 検 討

した 。 具 体 的 に は,ヒ トモ デ ル 動 物 と して 期 待 さ れ る ブ タ を 対 象 にTLR9遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ し, TLR9が,バ イ エ ル 板 と腸 管 膜 リ ン パ 節 に お い て 高 発 現 し て い る こ と を 発 見 し た 。TLR9をAr-oDN の 免 疫 機 能 を 解 明 す る 上 で の 重 要 分 子 で あ る こ と を 提 唱 し,TLR9強 制 発 現 細 胞 株 を 構 築 し,Ar-ODNで 刺 激 した と こ ろTLR9を 介 す る細 胞 内 ジ グ ナ ル 伝 達 系 が 活 性 化 さ れ,抗 ア レル ギ ー 性 サ イ ト カ イ ン が 産 生 さ れ る こ と を 明 ら か に し た 。 さ ら に,本 細 胞 株 に よ り,様 々 なDNA配 列 か らTLR9を 介 す る免 疫 活 性 の 強 い 配 列 を 選 抜 で き る 免 疫 活 性 評 価 系 を 構 築 す る こ と が で き た 。 次 に,本 シ ス テ ム を 用 い て,L.8α ∬θr'OLL2716株 の ゲ ノ ム 情 報 よ り,Arコ ア 配 列 を 含 む 免 疫 刺 激 性Ar-ODNを 網 羅 的

に 検 索 し た と こ ろ,強 い 免 疫 刺 激 性Ar-ODN(LGAT-243)を 発 見 し た 。2次 構 造 解 析 か ら,活 性 発 現 に は ル ー プ 構 造 が 必 要 で あ り,ル ー プ か ら ス テ ム 内 に5・一TTrT-3・ 構 造 を も ち,ス テ ム の 蔀 分 に5' 一C_{_G-3'構 造 が あ る場 合,よ り強 い 活 性 を 示 す こ と が 初 め て わ か っ た 。 ま た,TLR9細 胞 外 ドメ イ ン} 中 にODN結 合 領 域 を 探 索 し,ス テ ム 内5'一mr-3'構 造 と強 く結 合 す る ロイ シ ン リ ッ チ リ ピー ト部 位 を 発 見 し た 。 本 研 究 成 果 は,こ れ ま で1次 構 造 よ り考 え られ て き た 免 疫 刺 激 性 の 構 造 相 関 に 関 す る 知 見 とは 別 に,2次 構 造 か ら の ア プ ロー チ に よ り,免 疫 刺 激 性DNAに お け る 構 造 特 性 に つ い て,新 た な 理 論 の 展 開 に つ な が る も の と 考 え られ た 。 以 上 本 論 文 は,プ ロバ イ オ テ ィ ッ ク 乳 酸 菌 由 来 のAr-ODN配 列 が,TLR9を 介 し て 抗 ア レル ギ ー 性 サ イ トカ イ ン を 強 く誘 導 す る メ カ ニ ズ ム とAr-ODNの 活 性 構 造 特 性 を 解 明 し,多 様 なDNA配 列 に 対 す る分 子 免 疫 活 性 評 価 シ ス テ ム を 構 築 す る こ と に 成 功 し た も の で あ り,本 研 究 成 果 は,様 々 な 疾 病 の 予 防 や 改 善 に 寄 与 す る 免 疫 機 能 性 食 品 の 開 発 に 向 け た 基 礎 研 究 と し て 高 く評 価 さ れ る 。 した が っ て 審 査 員 一 同 は,こ れ を博 士(農 学)の 学 位 を授 与 す る に 値 す る も の と判 定 し た 。