博 士 （ 理 学 ） 大 槻 茂 男
学位論文題名
rvIolecular and Physiological Studies on Sugar Regulation in Rice
（イネにおける糖応答制御の分子生理学的研究）
学位論文内容の要旨
高等植物において、・糖はェネルギーや炭素骨格となるばかりではなく、シ グ ナ ル 分 子 と し て も 機 能 す る。 長期 高C02環境 下で 生育 した 植物 はパ イオ マ ス の増 大、 糖の 蓄積、光合成活性や窒素含量の低下などが観察される。この光 合 成活 性の 低下 はRubiscoをは じめ とし た光 合成関連遺伝子群の発現抑制や、
夕 ンパ ク量 の減 少を伴う。この遺伝子発現抑制機構にヘキソキナーゼが関わる こ とが 示唆 され ているが、分子レベルでの解明が待たれている。また、夕ンパ ク 量 の 減 少 を 導 く 窒 素 含 量 の低 下の 原因 とし て、 高C02条件 では 、通 常大 気 と 異な る窒 素同 化制御機構の存在が示唆される。これら糖による遺伝子発現制 御 機構 や窒 素同 化機構への影響を明らかとすることを目的とし、本研究を遂行 した。
糖 によ る遺 伝子発現制御機構を明らかとするために、イネ品種能登ひかり よ り得 た単 離胚 カル スを 糖処 理し 、糖 で誘 導される遺伝子群OsSURl‑2（Oryza sativa sugar‑up‑regulated)と糖で抑制される遺伝子群OsエS'DR1ー5(Oryza sativa sugar‑down‑regulated)をマイク口アレイにより同定した。OsSUR1は新規な遺伝 子 であ るが 、EF‑handモチ ーフ を持 つタ ンパ ク質をコードしていた。大腸菌に 発 現さ せた 組換 えOsSURl夕ン パク 質は カル シウ ム結合 能を 示す こと を明 らか に し た 。 ま たOsSUR1の 発 現 器 官 が、 吸 水 後6時 間 か ら24時 間 の種 子 胚 と 出 穂 開 花 後 の 桿 で あ る こ と を ノ ー ザ ン 解 析 に よ り 明 ら か に し た 。GFP融 合 OsSURl夕ン バク 質を イネ シュ ート に一 過的 に発 現させ 、細 胞内 局在 性を 検討 し たが 、特 に特 異的な局在は観察されなかった。単離胚カルスにおいて、様々 な 糖を 用い た〇sSUR1の発 現誘 導を ヘキ ソキ ナーゼの基質となる糖において観 察 した 。そ の挙 動は、ヘキソキナーゼ依存的に発現抑制を受けるイネぱ‐アミ ラ ー ゼ 遺 伝 子RAmy3Dの 発 現 と 全 く 逆 で あ っ た こ と か ら、OsSUR1はヘ キソ キ ナ ー ゼ 依 存 的 に 発 現 誘 導 さ れ る と 考 え ら れ た 。 糖 に よるOsSUR1の発 現誘 導 は 、カ ルシ ウム シグナリングの阻害剤やタンバク質合成阻害剤であるシク口ヘ キ シミ ド処 理に よっ て阻 害さ れな いこ とを 示し た。こ れら の結 果か らOsSUR1 は カル シウ ム結 合夕ンパク質をコードするが、その発現にはカルシウムシグナ リ ング は関 与せ ず、糖存在下において、ヘキソキナーゼの活性に依存した何ら か の細 胞内 に存 在す る転 写制 御因 子が 働き 、発 現が誘 導さ れる 可能 性を 示し た。
通 常大 気条 件下 にお ける窒素固定において、窒素の取り込みのフイードバ ッ クに は、 窒素 源そ のも のか、もしくは同化後の窒素代謝産物の蓄積が関与す る との モデ ルが 提唱 され ている。また、イネでは、窒素飢餓処理後にアンモニ ア 処 理 を 行 うと 、ア ンモ ニアの 吸収 活性 が一 時増 加す るこ とが 報告 され てい る 。 し か し 、 こ れ ら の 機 構 と ア ン モ ニ ア固 定に 必要 な炭素 骨格 の供 給量(C) と の 議 論 は な さ れ て い な か っ た 。 イ ネ 品種 日本 晴れ を高C02処 理し 光合 成活 性 を上 昇さ せ、 炭素 骨格 供給 量を 増加さ せた 結果 、8時間後にはアンモニア吸 収 量 が5倍 に 増 加 する が24時 間 後 に は 通 常大 気条 件下 にお ける 吸収 量と 変わ ら なく なる こと が観 察さ れた。このことから、通常大気条件におけるアンモニ ア の取 り込 みの フイ ード パックは、アンモニアそのもの、もしくは同化後の窒 素 代謝 産物 の蓄 積が 関与 する とい うより むし ろCの欠 乏に起因していると考え ら れ た 。 ま た 、 高C02処 理 に よ っ て 、 ア ンモ ニア を固 定す るの に十 分量 の炭 素 骨 格 が 供 給 さ れ る と 、 植 物 体 が 受 容 で き る 窒素 量(N)が 飽 和 し 、Cが 存在 し てい ても アン モニ アの 取り込みのフイードバックが働くことが推察された。
よって前者をC‑deficient−regulation、後者をNーsaturatedーregulationと名付け、
これらを新しいモデルとしてその検証を試みた。
植 物を 窒素 飢餓 処理 した 場合 、その 間にCが 蓄積 すると考えられるが、そ のCの 蓄 積 量 は 光 合成 活 性 に 依 存 す る と 考え られ る。 通常 大気 で生 育さ せた イ ネ(36 Pa)と 高C02条 件 下 で 生 育 さ せ た イ ネ （110 Pa)を 窒 素 飢 餓 処 理 し た 後、2時間 窒素 源で 処理 し、アンモニアの吸収活性変化をPositron Emitting Tracer Imaging System(PETIS)を 用 い て測 定し た。PETISは短 寿命 の放 射活 性 物質 を植 物に 与え 、そ の移行、吸収活性をりアルタイムで計測できる。窒素 源に硝酸アンモニウムを用いた結果、36 Paではアンモニア吸収活性が低下し、
110 Paで は 上昇 した 。こ のこと から 、36 Paでは 蓄積 したCが窒 素源 と同 化し たことにより欠乏した状態、即ちCーdeficient―regulationが起きたのに対し、光 合 成 活 性 の 高 い110 Paで はCが 完 全 に 消 費さ れて いな いだ けで なく 、硝 酸ア ン モニ ウム 処理 に起 因す る何らかのシグナルがアンモニア取り込みを促進させ た と考 えら れた 。ま た、 窒素源にグルタミンを用いたところ、先の結果とは逆 に36 Paでは アン モニ アの 吸収 活性 が上 昇し 、110 Paでは低下した。このこと は 、110 Paでは グル タミ ン処理 によ ってNが 飽和 し、Cが存 在し てい ても フイ ードバックがかかるNーsaturated―regulationが起きたのに対し、36 Paはもともと 光 合 成 活 性 が 低 く 、 恒 常 的 にNが 欠 乏 し てい たた めグ ルタ ミン 処理 を行 って もN―saturated−regulationが起きなかったと考えられた。また36 Paにおけるア ン モこ アの 吸収 活性 はグ ルタミン処理で促進されたことから、窒素飢餓処理後 に 窒 素 源 処 理を おこ なっ た場合 に観 察さ れる アン モニ ア取 り込 み活 性の 上昇 は 、 窒 素 飢 餓後 の内 在の グルタ ミン 濃度 の上 昇が 関与 する 可能 性が 示唆 され た 。よ って イネ にお ける 窒素飢餓処理後のアンモニア吸収活性は、アンモニア を 付与 され たこ とに よっ て生合成されたグルタミンをシグナルとして一時上昇 し、その後、通常大気条件ではCーdeficient‑regulationによって、高C02環境下 ではN―saturatedregulationによってフイードパックがかかり低下すると考えら れ た 。 ま た 、 高C02環 境 下 で 生 育 し た イ ネが 、通 常大 気条 件下 で生 育し たイ ネ と比 較し て糖 の蓄 積や 窒素含量の減少する原因は、炭素骨格が存在するにも 関わらずァンモニアの吸収を抑制するN―saturated‑regulationが働くことで、余 剰 と な っ た 炭素 骨格 が蓄 積して いく こと に起 因す るの では ない かと 推察 され
た。
最後に、ヘキソキナーゼ依存型の遺伝子発現制御の解明に向けた新規なマ
―カー遺伝子OsSUR1 を単離し、その植物体における発現と性質を明らかに
し、また、高C02 処理を併用することでアンモニアの同化機構に関して新し
いモデルを提唱し、イネにおける糖応答制御そして将来直面するであろう高
C02 環 境下 における植物の生理機能変化に関して大きな知見を提供した。
学 位 論 文 審 査 の 要 旨
主査 教 授 山口淳 二 副査 教 授 加藤敦 之
副査 教 授 大崎 満 （北海道大 学大学院 農学研究科）
学位論文題名
IN/Iolecular and Physiological Studies on Sugar Regulation in Rice
（イネに おける糖 応答制御の 分子生理 学的研究）
高等植物において、糖はエネルギーや炭素骨格となるばかりではたく、シグナル 分子としても機能する。長期高C02環境下で生育した植物はノくイオマスの増大、糖の 蓄積、光合成活性や窒素含量の低下などが観察される。この光合成活性の低下はRubisco をはじめと；した光合成関連遺伝子群の発現抑制や、タンパク量の減少を伴う。この遺 伝子発現抑制機構にへキソキナーゼが関わることが示唆されているが、分子レベルで の解明が待たれている。また、タンパク量の減少を導く窒素含量の低下の原因として、
高C02条件では、通常大気と異なる窒素同化制御機構の存在が示唆されるが、そのこ とはまだ示されていない。これら糖による遺伝子発現制御機構や窒素同化機構への影 響を明らかとすることを目的とし、本研究を遂行した。
糖による遺伝子発現制御機構を明らかとするために、イネ品種能登光より得た単 離胚 カルスを 糖処理し 、糖で誘 導される遺伝子OsSURl (Oryza sativa sugar‑up‑
regulated)をマイクロアレイにより同定した。OsSUR1は新規な遺伝子であるがEFーhand モチーフを持っタンパク質をコードしており、大腸菌に発現させた組換えOsSURlタン パク質はカルシウム結合能を示すことを明らかにした。またOsSUR1の発現器官が、吸 水後6時間から24時間の胚と出穂開花後の桿であることを明らかにした。単離胚カル スにおいて、様々な糖を用いたOsSUR1の発現誘導をヘキソキナーゼの基質となる糖に おいて観察し、その挙動は、ヘキソキナーゼ依存的に発現抑制を受けるイネQーアミラ ーゼ遺伝子RAmy3Dの発現と全く逆であったことから、OsSUR1はへキソキナーゼ依存 的に発現誘導されることを明らかにした。糖添加によるOsSUR1の発現誘導はカルシウ ムシグナリングの阻害剤やタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド処理によっ て阻害されないことを示した。これらの結果からOsSUR1はカルシウム結合タンパク質
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をコードするが、その発現にはカルシウムシグナリングは関与せず、糖存在下におい て、細胞内に存在しているへキソキナーゼの活性の制御を受けた転写制御因子によっ て発現が誘導される可能性を示した。
糖による窒素同化機構への影響に関して、通常大気で生育しているイネと高C02 処理したイネを用いて、アンモニアの吸収活性制御を明らかにした。通常大気で生育 しているイネに高C02処理をおこない8時間経過すると根から投与したアンモニア由 来の窒素化合物の植物体地上部ーの移行量が5倍となるが24時間経過すると移行量は 同等となることを観察した。この結果は通常大気条件ではアンモニア同化に必要な炭 素骨格（C）が十分量供給されていないことを示唆し、これをC−deficient−regulation と名づけ、高C02処理によってCが十分供給されアンモニアを十分吸収したため処理 後24時間では窒素が植物体内で飽和状態に達し、アンモニア吸収が抑制されたと考え られ、これをN―saturated―regulationと名づけた。窒素飢餓処理後にアンモニアを与 えるとその吸収活性が増大し、十分量供給後フイードバックがかかり吸収活性が低下 することが報告されている。この低下にはアンモニアそのものかもしくはグルタミン 以降の窒素同化産物によるとぃう議論がなされていたが、炭素骨格供給量との関係は 議論されていなかった。通常大気と高C02処理条件で生育させたイネを窒素飢餓処理 し、その後硝酸アンモニウムで2時間処理すると地上部におけるアンモニアの吸収活 性は通常大気のイネでは低下するのに対し、高C02処理イネでは上昇した。同様の実 験をグルタミンで2時間処理して行うと、通常大気のイネではアンモニアの吸収活性 は上昇するのに対し、高C02処理イネでは低下した。これらの結果は通常大気条件で はCが窒素源処理によって消費されて欠乏した状態、即ちC−deficientーregulationが アンモニア吸収活性低下の要因であると推察され、高C02条件では、ある程度のグル タミンの蓄積によって、Cが存在してもアンモニアの吸収活性を抑制する前述のN− saturatedーregulationが実際起きることを明らかにした。これらのモデルはアンモニ ア吸収に関して新規性があるばかりではなく、通常大気条件と比較して高C02環境下 で生育したイネで糖の蓄積や、窒素含量の低下が観察される―因を示したものである。
以上を要するに、ヘキソキナーゼ依存型の遺伝子発現制御の解明に向けた新規な マーカー遺伝子OsS UR1を単離し、その植物体における発現と性質を明らかにし、また、
高C02処理を併用することでアンモニアの同化機構に関して新しいモデルを提唱する など、イネにおける糖応答制御そして将来直面するであろう高C02環境下における植 物の生理機能変化に関して大きな知見を提供した。
よって著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格があるものと認める。
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