子 ウ シ線 維 芽 細 胞 を 用 い た 核 移 植 に よ る ク ロ ー ン ウ シ の 受 胎
保 坂 卓2、 谷 口 俊 仁3、 佐 伯 和 弘1・2、 金 子 武 人2、
松 本 和 也L2、 細 井 美 彦1'2、 西 本 尚 武3、 入 谷 明1'2
要 約
哺 乳 動 物 にお け る体細 胞 ク ロ ー ン技 術 は、 優 良 な遺 伝 形 質 を有 す る動 物 の 増 産 の み な らず 、 効 率 的 な トラ ン ス ジ ェニ ック動 物 作 出技 術 へ の 応 用 が進 め られ て い る。 今 回 、 子 ウ シ よ り採 取 した線 維 芽 細 胞 に よ る ク ロー ン胚 の 作 製 お よ び胚 移 植 によ る胎 子 へ の発 生 を試 み た。 体 外 成 熟 に よ り得 られ た ウ シ成 熟 卵 子 か ら核 質 を 除去 し レシ ピエ ン ト卵子 と した。 これ らの卵 子 に数 代 継 代 した ウ シ線 維 芽 細 胞 を 挿 入 して 作 製 した513個 の核 移植 胚 を電 気 融 合 した と ころ、63%が 融 合 した。 これ ら323個 の 再 構 築 胚 を 活 性 化 処 理 し、7日 間 培 養 して胚 発 生 を観 察 した と ころ、232個(72%)の ク ロ ー ン胚 が 卵 割 し、 そ の うち44個 (19%)が 移 植 可 能 な桑 実 期 胚 お よ び胚 盤 胞 期 胚 に発生 した。 これ ら発 生 胚 の うち10個 を5頭 の 受 卵 雌 に
2胚 ず っ 移 植 した と ころ、1頭(20%)で 受 胎 が 確 認 され た。 以 上 よ り、 ウ シ体 細 胞 の 核 移 植 に よ り作 製 した ク ロ ー ン胚 が胎 子 へ 発 生 す る ことが 確 認 され た。
緒 論
Wilmutら(1997)は 、 血 清 飢 餓 培 養 に よ り、 細 胞 周 期 を 静 止 期(G。 期)に 誘 導 し た ヒ ッ ジ の 乳 腺 上 皮 細 胞 を 除 核 し た 未 受 精 卵 に 移 植 す る こ と で 、 初 め て 生 存 す る ク ロ ー ン ヒ ッ ジ の 産 子 を 得 た 。 以 来 、 マ ウ ス(Wakayamaetal,1998)お よ び ウ シ(Katoetal.,1998,Wellsetal.,1998,1999,Shigaet
aL,1999)に お い て も成 功 例 が 報 告 さ れ て い る。 こ れ ら の 報 告 に よ る と 、 細 胞 周 期 がG。 あ る い はG1期 の 成 熟 し た 個 体 あ る い は 胎 子 よ り 得 た 体 細 胞 を 用 い 、 除 核 し た 成 熟 卵 子 細 胞 質 に 移 植 し、 そ の 後 、 再 構 築 胚 の 活 性 化 処 理 を 行 う こ と で 、 個 体 へ の 発 生 率 が 大 き く向 上 す る こ と が 知 られ て い る 。 こ の ク ロ ー ン 技 術 に よ り哺 乳 動 物 の 培 養 細 胞 が 個 体 に ま で 発 生 す る こ と か ら、 あ ら か じ め 外 来 遺 伝 子 を 培 養 細 胞 に 導
入 す る こ と で 、 効 率 的 に トラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク 動 物 を 生 産 で き る こ と が 示 さ れ て い る(SchniekeetaL, 1997,Cibellietal.,1998)o
本 実 験 で は 、 ウ シ個 体 よ り採 取 し た 体 細 胞 を 用 い た 核 移 植 に よ り ク ロ ー ン 産 子 の 受 胎 例 を 得 た の で 報 告 す る 。
材 料 お よ び 方 法
ウ シ卵 子 の 採 取 お よ び 成 熟 培 養
ウ シ 卵 巣 は 、 近 隣 の と 場 に て 採 取 し、20〜25℃ の 生 理 食 塩 水(0.9%NaC1)に 浸 漬 して 輸 送 し た 。 採 取 後2〜3時 間 以 内 に 、 卵 巣 表 面 の 直 径2〜8mmの 卵 胞 か ら吸 引 法 に よ り 卵 丘 卵 子 複 合 体(COCs)を 回 収 した 。 卵 丘 細 胞 が 緊 密 か っ3〜4重 層 に付 着 したCOCsの み を 選 抜 し、 ミネ ラ ル オ イ ル 下 の50μ1の
1㎎/m1ポ リ ビ ニ ル ア ル コ ー ル(M.W.40,000,SigmaChemical,StLouis,MO,USA)、0.02AU/
mlFSH(Antrin,DenkaSeiyaku,Tokyo,Japan)、1μg/m1エ ス ト ラ ジ オ ー ル ー17β(Sigma)、
0.5mMピ ル ビ ン酸 ナ ト リ ウ ム(Nacalaitesque,Kyoto,Japan)and1%(v/v)抗 菌 抗 カ ビ溶 液 (Cat.No.12340,GibcoLaboratories,GrandIsland,NY,USA)を 添 加 し た25mMHEPES緩 衝
1.近 畿大学生物理工学研究所 2.近 畿大学生物理工学部 3.和 歌山県畜産試験場
TCM‑199(Earle塩 、Gibco)内 に10個 ず っ 導 入 し 、39℃ 、5%CO2、95%空 気 、 高 湿 度 の 条 件 下 で20 時 間 成 熟 培 養 し た(Saekieta1.,1991)。
ドナ ー 細 胞 核 の 作 製
ドナ ー 核 と な る 体 細 胞 は 以 下 の よ う に 作 製 した 。 黒 毛 和 種 オ ス 子 牛 の 耳 の 一 部 を パ ン チ ン グ に よ り 採 取 し た 。 こ の 組 織 を 細 切 し、10%ウ シ胎 子 血 清(FBS,Sigma)を 添 加 し たDulbecco修 正 イ ー グ ル 培 養 液(D‑MEM,Gibco)で 培 養 す る こ と で 、 ウ シ線 維 芽 細 胞 を 得 た。10%FBs添 加D‑MEMで 数 代 継 代 培 養 した 後 、0.5%FBS添 加D‑MEMで 約1週 間 飢 餓 培 養 し、 細 胞 核 ドナ ー と した(図1)。
Fig 1 Bovine Black
fibroblasts taken from a Japanese male calf for nuclear donor.
核 移 植
体 外 成 熟 後 、 卵 丘 細 胞 が 膨 潤 したCOCsを 選 別 し、 こ れ ら を0.1%ヒ ァ ル ロ ニ ダ ー ゼ(Sigma)を 添 加 した5%新 生 子 ウ シ血 清(NBCS;Sigma)添 加TCM‑199に2分 間 曝 露 し、 そ の 後5分 間VORTEXミ キ サ ー に よ り 撹 搾 す る こ と で 卵 丘 細 胞 を 剥 離 し、 卵 子 の み を 回 収 し た 。
こ れ ら裸 化 し た 卵 子 か ら第1極 体 を 放 出 した もの の み を 選 抜 し、 第1極 体 付 近 の 透 明 帯 を ガ ラ ス 針 で ス リ ッ トを 開 け 、 そ の 後 同 一 の ガ ラ ス 針 で 卵 子 の 中 央 付 近 を 上 部 か ら押 しっ け る こ と で 第1極 体 と そ の 付 近 の 細 胞 質 を 作 製 し た ス リ ッ トか ら透 明 帯 外 に 押 し 出 し た 。 押 し だ さ れ た 細 胞 質 は ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ り 除 去 す る こ と で 、 卵 子 細 胞 質 の み を 透 明 帯 内 に 残 存 させ た 。 こ れ ら卵 子 細 胞 質 を レ シ ピ エ ン ト卵 子
と した(図2)。
Fig 2 Enucleation of bovine oocytes matured in vitro. a ; Matured oocvtes was held with a holding pipet. 1 st PB ; First polar body. b ; Zona was torn open by glass needle. c ; A small portion of cytoplasm beneath the 1 st PB was squeezed out by glass needle. d ; Putative enucleated oocytes.
一 方、 ドナ ー細 胞 は 、 培 養 細 胞 を ト リ プ シ ン ・EDTA溶 液 で 単 離 して 用 い た 。 こ れ ら細 胞 を 、 レ シ ピ エ ン ト卵 子 の 囲 卵 腔 内 に1個 ず っ 注 入 して 核 移 植 胚 を 作 製 し た(図3)。 作 製 し た 胚 は 、Zimmerman細 胞 融 合 液(Robletal.,1987)中 に 導 入 し、 微 小 電 極 で 核 移 植 胚 を 挟 み 込 み 、ECM200(BTX,San
Diego,CA,USA)を 用 い てAC5V1秒 間 、 つ い でDC25V/150μm、25μ 秒 、2回 の 電 気 パ ル ス 刺 激 に よ り 融 合 し、 再 構 築 胚 を 作 製 した(図4)。
再 構 築 胚 は、5μMカ ル シ ウ ム イ オ ノ フ ォ アA23187に5分 間 曝 露 した 後 、10μg/mlシ ク ロ ヘ キ シ ミ ドに6時 間 曝 露 す る こ と に よ り活 性 化 した 。
活 性 化 処 理 後 、 再 構 築 胚 は5%NBCSを 添 加 し たCRlaa培 養 液(Rosenkransetal.,1993)で 、 39℃ 、5%CO2、5%02,90%N2、 高 湿 度 下 で7日 間 培 養 した 。 培 養 後 、 ク ロ ー ン 胚 を 実 体 顕 微 鏡 下(x60)で 検 査 し、 卵 割 率 、 桑 実 期 お よ び 胚 盤 胞 期 胚 へ の 発 育 率 を 調 べ た 。
Fig 3 Bovine nuclear transplanted couplets reconstructed with an enucleated oocyte and a fibroblast cell. a ; A fibroblast cell was inserted into perivitellin space of a recipient oocyte by
injection pipet. b ; A couplet reconstructed with oocyte cytoplasm and a fibroblast cell.
Fig 4 Electrofusion of micro-electrodes.
c ; an enucleated
an enucleated oocyte and a a ; a micro-electrode, b ; a oocyte.
fibroblast cell using bovine fibroblast cell,
胚 移 植
得 られ た桑 実 期 、 胚 盤 胞 期 胚 の一 部 は、 性 周 期 を同 期 化 させ た受 卵 雌 に 、 よ り移 植 した。
1頭 に2胚 ず つ 直 腸 膣 法 に
結 果 お よ び 考 察
表1に 示 す よ う に 、 合 計513個 の 除 核 卵 細 胞 質 に 体 細 胞 を 融 合 さ せ た と こ ろ 、323個(63%)が 融 合 し た 。 こ れ ら再 構 築 胚 を 、 活 性 化 し た 後7日 間 体 外 培 養 した と こ ろ、232個(72%)が 卵 割 胚 に 発 生 し、 そ の う ち44個(19%)が 、 移 植 可 能 な 桑 実 期 あ る い は 胚 盤 胞 期 胚 に発 生 した(図5)。
Table 1 Development of bovine from a Japanese Black
cloned male
embryos calf
with fibroblast cells taken
'Embryos were 2. 3M; morulae
,
cultured for 7 days.
Bl ; blastocysts.
Fig 5 Blastocysts derived in vitro culture for
from bovine 7 days.
cloned embryos following
ou
発 育 した44個 の桑 実 期 、 胚 盤 胞 期 胚 の うち、10個 を性 周 期 を 同期 化 させ た受 卵 雌 に2胚 ず つ5頭 に 移 植 した。 その 結 果 、 移 植 後47日 目 の超 音 波 断 層 診 断 装 置 に よ る妊 娠 判 定 に よ り、1頭 の受 胎 を 、 胎 子 お よ びそ の 心 拍 に よ り確 認 した(1999年6月13日 移 植 、7月25日 妊 娠 判 定 、 表2)。 現 在(1999年11月30日) も妊 娠継 続 中 で あ る。
Table 2 Pregnancy after transfer of cloned embryos into recipient cattle
追 試 例 で は あ る が、 本 研 究 に お い て も、 ウ シの体 細 胞 由 来 の ク ロー ン胚 に よ る妊 娠 例 が 得 られ た。 核 移 植 技 術 は優 秀 な遺 伝 情 報 を持 った個 体 の複 製 のみ な らず、 有 用 な 遺 伝 子 を組 み 込 ん だ 個 体 の 作 出 に も 用 い る こ とが 可 能 で あ る と考 え られ る。 現 在 、 今 回 用 い た体 細 胞 に マ ー カ ー遺 伝 子 で あ るEGFP遺 伝 子 を 導 入 し、 導 入 細 胞 の ク ロー ン化 を 行 い、 これ を細 胞 核 ドナ ー と した核 移 植 の検 討 を行 って い る。
矢 参 「テ 融
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6
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XXWe
Production and pregnancy of bovine cloned embryos derived from fibroblasts taken from a Japanese Black male calf
T Hosaka 2 , S Taniguchi', K Saeki'' 2, T Kaneko', K Matsumoto `. 2, Y Hosoi" 2, Y Nishimoto 3 and A Iritani `' 2
Production of cloned livestock from an established cultured cell line would confer various advantages in animal biotechnology, such as multiplification of valuable or endangered animals and effective production of transgenic animals. Here, we report production and in vitro development of cloned embryos with bovine fibroblasts taken from Japanese Black male calf and establishment of pregnancy with the cloned embryos following transfer into recipient animals.
In vitro matured bovine oocytes were enucleated and used for recipient cytoplasm. Bovine cultured fibroblasts derived from ear skin of a Japanese Black male calf were used for nuclear donor. Couplets were produced by insertion of each somatic cell into perivitellin space of recipient oocytes. Total of 63% out of 513 couplets was fused by electrostimulation.
After activation treatment, the cloned embryos were cultured for 7 days. Frequencies of cleavage and development to the morula and blastocyst stages were 72% and 19%, respectively.
Ten morulae/blastocysts were transferred into recipient cattle nonsurgically respectively.
Ten morulae/blastocysts were transferred into recipient cattle nonsurgically ( 2 embryos/
recipient). Ultrasoudsonographic diagnosis at 47 days after the transfer revealed that one (20%) pregnancy was established.
1. Resaerch Institute of Biology-Oriented Science and Technology 2. Department of Genetic Engineering, Kinki University 3. Wakayama Prefecture Livestock Experimental Station
