酸化低比重リポ蛋白による培養ウシ関節軟骨細胞の 老化誘導

酸化低比重リポ蛋白による培養ウシ関節軟骨細胞の 老化誘導

頭 司 敏 史 赤 木 将 男

近畿大学医学部整形外科学教室

抄 録

血管内皮の酸化低比重リポ蛋白(酸化

LD

L)受容体として同定されたレクチン様酸化低比重リポ蛋白受容体

1  ( L O X ‑

l)の軟骨細胞での発現が示され，酸化

LDL

と軟骨変性の関連が示唆されている.本研究の目的は，酸化

LDL

と

L O X ‑ 1

の結合によりウシ培養軟骨細胞の老化が誘導されるかを検討することである.

まず老化関連βーガラクトシダーゼ染色，および，

B r d U

取込みによる細胞分裂能を測定した.次に酸化

LDL

添 加によるテロメラーゼ活性の変化，

P I 3  k i n a s e /  A k t

経路のテロメラーゼ、活性に及ぽす影響を調べた.さらに酸化

LDL

による

P

I3

k i n a s e /  A k t

経路への影響を検討した.酸化

LDL

添加は培養軟骨細胞の老化関連βガラクトシダ ーゼ活性を克進させ，細胞分裂能を低下させた.また酸化

LDL

は経時的，経量的にテロメラーゼ活性を抑制し，

抗

LOX‑l

抗体

( T S ‑ 2 0 )

前処理によりテロメラーゼ活性は回復した.

P I 3  k i n a s e

の抑制によりテロメラーゼ活性 は抑制され，インスリン様成長因子一

1OGF‑

l)はこの抑制を回復した.酸化

LDL

により

A k t

のリン酸化は抑制 され

T S ‑ 2 0

により回復した.すなわち酸化

LDL

は

L O X ‑ 1

との結合を介して

P I 3k i n a s e /  A k t

経路依存性に軟骨 細胞のテロメラーゼ活性を抑制する事が示された.また，これらの結果は全て継代を必要とせず24時間以内に生じ た.酸化

LDL

は軟骨細胞の未成熟老化を誘導するとともに，テロメラーゼ活性の抑制を介して細胞老化に関与す る可能性が示された.酸化

LDL

は細胞老化促進因子として軟骨変性に関与することが示唆された.

K e y  w o r d s :  O x i d i z e d  LDL

， 

LOX  ‑ 1

， 

C h o n d r o c y t e

， 

P r e m a t u r e  S e n e s c e n c e

， 

T e l o m e r a s e  a c t i v i t y

， 

P I 3  k i n a s e /   A k t  p a t h w a y  

緒 ^宅喜子百

近年，生活習慣病の一つである動脈硬化症の主要 原 因 物 質 と し て 酸 化

LDL

が 認 知 さ れ る よ う に な り1‑2 また血管内皮細胞における酸化

LDL

の受容 体としてレクチン様酸化

LDL

受容体

(LOX‑

l)が同 定された3

LOX‑1

は血管平滑筋細胞においても発 現が認められており，炎症性サイトカイン，機械的 ストレスやリガンドである酸化

LDL

などにより発 現が充進し，動脈硬化症の進行に大きな役割を果た すことが示されている4

へ

一方，変形性膝関節症

( O A )

においても過酸化脂 質と軟骨変性との関連が示唆されてきた叩

.OA

の 疫学調査でも高血圧症と高脂血症が独立した関節症 の増悪因子として示されている8

Nakagawa

らは ラット実験的関節炎モデルにおいて変性関節軟骨に

おける

LOX‑1

の発現，軟骨組織における酸化

LDL

の存在を示し，また，抗ラット

LOX‑1

マウスモノク ローナル抗体投与が滑膜炎症，軟骨変性を抑制する ことを示したまた，ラット培養軟骨細胞において 酸 化

LDL

と

LOX‑1

の結合は

P

I3

k i n a s e   ( P I 3 k )  /  Akt

経路を抑制し細胞活性を低下させ，非アポトー

シス性細胞死を誘導することを示した10 当教室に おいては，ウシ関節軟骨細胞培養系において低レベ ルながらも恒常的な

LOX‑1

発現が認められ，酸化

LDL

と

LOX‑1

の 結 合 に よ り 活 性 酸 素 種 が 産 生 さ れること11を 示 し た . さ ら に ヒ ト 膝 変 形 性 関 節 症

( O A )

軟骨における酸化

LDL

の存在と軟骨細胞に おける

LOX‑1

の発現，軟骨細胞における酸化

LDL

の存在および

LOX‑1

発現の程度と軟骨変性の程度 に相聞が認められることを示した.そして，これら の分子はヒト

OA

における軟骨変性の進行を

m o d ‑

大阪府大阪狭山市大野東

3 7 7 ‑ 2

(〒

5 8 9 ‑ 8 5 1 1 )

受 付 平 成

2 0

年

1 0

月

2 7

日 ， 受 理 平 成

2 0

年

1 2

月5日

46  頭 司 敏 史 他

u l a t e

する分子であることを示唆した山

動脈硬化症と変形性関節症は両者ともに加齢とと もに発生頻度が著しく増加することが疫学的に示さ

れている14‑17 さらに，動脈硬化を生じた血管内皮細

胞 は 細 胞 老 化 を 生 じ て お り 山 変 形 性 関 節 症 軟 骨 細胞も細胞老化を生じていることが既に示されてお り肌ヘ両疾患における細胞老化と組織レベルでの 老化との関連が指摘されている.

細胞老化のメカニズムを説明する仮説として最も 一般的であるものがテロメア仮説であろう22‑25 テ

ロメアは染色体の両端に存在する

TTAGGG

リピ ートであり様々なテロメア結合タンパクとともに染 色体の安定性に寄与する.

DNA

ポリメレースの不 完全な

DNA

複製のためテロメアは細胞分裂に伴い 短縮していくと考えられている22 テロメアが臨界 長まで短縮すると細胞は分裂を停止し細胞老化の状 態となる

( r e p l i c a t i v es e n e s c e n c e )  

23，25. テロメラー ゼ、は逆転写酵素および鋳型

RNA

から構成されるリ ポ核蛋白であり，染色体の塩基配列末端に存在する テロメアを伸長する機能を持つ2ω ヒト培養血管 平滑筋細胞のテロメラーゼ、遺伝子を活性化すること によって分裂に伴うテロメアの短縮は抑制され，細 胞寿命の延長が可能であったことからへ血管平滑 筋の細胞老化におけるテロメラーゼの重要性が示唆 されている.テロメアの短縮は培養血管細胞のみな らずヒト血管組織においても観察されており，動脈 硬化との関連性が示されている29，30 一方，

OA

の軟 骨細胞においてもテロメアの短縮が認められるこ

と2Ml，細胞老化を示す

OA

関節軟骨細胞にテロメ ラーゼ遺伝子を導入することにより細胞寿命が延長 することが示されており，軟骨細胞老化とテロメラ ーゼ活性の関連が示されてきた31‑33

さらに，細胞老化には，細胞分裂の繰り返しによ るテロメア長の臨界短縮の結果生じる細胞分裂停止 状態

( r e p l i c a t i v es e n e s c e n c e )

とは異なり，細胞が 十分に分裂を繰り返すことなく(テロメア長の臨界 短縮を伴わない)細胞分裂停止状態が知られている.

後者はストレス誘導未成熟細胞老化

( s t r e s s ‑ i n d u c e d premature s e n e s c e n c e )

と呼ばれており，ストレス 因子として

DNA

損傷，酸化ストレス，最適化されて いない環境での細胞培養，

P I 3  k i n a s e  i n h i b i t o r

，酸 化

LDL

などが知られている19 いずれの細胞老化に おいても細胞分裂は抑制され，生理的な細胞機能の 低下，遺伝子発現の特徴的な変化が認められ，慢性 疾患の病態にはテロメア短縮による細胞老化とスト

レス誘導未成熟細胞老化の両者が関与している可能 性が指摘されている19

本研究では，酸化

LDL

によるウシ培養軟骨細胞

の未成熟細胞老化の誘導について検討を行った.す なわち，酸化

LDL

が細胞老化関連マーカーである 老 化 関 連

β

ガラクトシダーゼ、

( S e n e s c e n c e a s ‑ s o c i a t e d β G a l a c t o s i d a s e

， 

SAβGAL)

活性，およ び，細胞分裂能に与える影響について検討した.ま た，酸化

LDL

が軟骨細胞テロメラーゼ、活性に与え る影響，およびび、テロメラ一ゼ

胞内シググ?ナルについて検討した.さらに，これらの 変化が酸化

LDL

と

LOX‑l

の結合を介するかにつ いて検討を行った.

材料と方法 1 .使用薬剤

酸化

LDL

，

n a t i v e  LDL

，抗ウシ

LOX‑l

マウスモ ノクローナル抗体

( T S ‑ 2 0 )

は国立循環器病センター 研究部，脈管生理部部長，沢村達也先生のご好意に より提供された.酸化

LDL

はヒト血祭を超遠心分 離し，単離した

LDL

を酸化させることで作製した.

LDL

の酸化は

LDL

濃度を

3mg  p r o t e i n / m l

の状態 で

3TC

，

2 0

時間，

7 . 5

j.1

M

の

CuS0

4に曝露すること で 行 っ た 非 特 異 的 マ ウ ス

IgG

は

E q u i t e c h ‑ B i o

( K e r r v i l l e

， 

TX)

より，

LY294002

及びヒト遺伝子 組み換えインスリン様成長因子(I

GF‑l)

は

Sigma

( S t .   L o u i s

， 

MO)

，抗

Akt

抗体，抗リン酸化

Akt ( p A k t )

抗体，抗ラビット

IgGh o r s e  r a d d i s h  p e r o x ‑ i d a s e  

(H

RP)

標識抗体は

C e l lS i g n a l i n g  T e c h n o l ‑ ogy ( B o s t o n

， 

MA)

より購入した.

2.

軟骨細胞の分離と培養

ウシ(生後

1 0

ヶ月)の関節軟骨を前足部

MP

関節 より無菌的に採取し，コラゲナーゼ処理にて軟骨細 胞を分離し，

10% f e t a l  b o v i n e  serum  (FBS)

を含 む

D u l b e c c o ' sm o d i f i e d  E a g l e ' s  medium (DMEM ，  Gibco

， 

Grand I s l a n d

， 

NY)

にて培養し，

70%

およ び

100%

コンブルエントになった時点で細胞を回収 した.なお軟骨細胞の培養の際にはインキュベータ ー内の酸素濃度を

5%

とし，低酸素状態での培養と した.これは生理的な軟骨魁織酸素濃度が

5%

であ り，

21%

酸素濃度では酸化ストレスにより細胞寿命 が短縮することが知られているためである34

3.  Real‑Time PCR

法による

2

型コラーゲンおよ びアグリカン

mRNA

発現の検討

本研究に用いる

70%

コンフルエントの軟骨細胞が 軟骨細胞としての形質を保持しているか，また，培 養条件と分裂活性および軟骨基質産生の関連を検討 するため，

Real‑Time PCR

法を用いて

2

型コラー ゲンおよびアグリカンの

mRNA

の発現を検討し た.比較には

100%

コンフルエントの培養軟骨細胞を 用いた.

1 )   RNA

の抽出

軟 骨 細 胞 か ら の

RNA

の 抽 出 は

QIAGEN RNeasy

^⑧

PLUS MINI@ (QIAGEN ]apan

，東京)

を用いて行った.

1

サンプルあたり

5X1 0

⁵個の軟骨 細胞を

B u f f e rRL  T P l u s  3 5 0  

1‑1

1

にて融解し，

gDNA  E l i m i n a t o r  Mini S p i n  Column

に入れ

3 0

秒遠心分離

し，

70%

エタノールを

3 5 0 ぃ l

加えピペッティングし た後に

RNe a s y  Mini S p i n  Column

に移し

1 5

秒遠心 分離した.その後

B u f f e rRWI 7 0 0 ぃ l

を加え

1 5

秒遠 心分離し洗浄した.そして

2

回

B u f f e rRPE 5 0 0 ぃ l

にて計2回遠心分離し洗浄した.そして水分を除去 し，

RNase‑FreeWater 5 0 ぃ l

を上記カラムに加え

1

分間遠心分離し

RNA

を抽出した.

2 

)逆転写反応

抽 出 し た

RNA

は

High Capacity  cDN  A  R e v e r s e  T r a n s c r i p t i o n  k i t @  ( A p p l i e d  B i o s y s t e m s ，  F o s t e r  c i t y

， U.

S . A )

を用いて逆転写し，

cDNA

を 合成した.

1 0  x  RT  B u f f e r  1 

1‑1

1

， 

2 5  x  dNTP  MIX 0 . 4  

凶，

1 0  x  RT Random P r i m e r  1 

1‑1

1

， 

M u l t i  S c r i b e   R e v e r s e  T r a n s c r i p t a s e   0 . 5  

1‑1

1

， 

RN  a s e   I n h i b i t o r   0 . 5

1‑1

1

， 

RNase‑Free Water 

l.

6 

1‑1

1

， 

RNA

抽出液

5

M

を混合し計

1 0 ぃ l

とし，サーモサイクラーにて

2 5 O C 1 0

分間，

3 7

⁰Cl

2 0

分間，

8 5

⁰

C  5

秒で逆転写反応を 行い，最後に

1x  T r i s ‑EDT  A (TE)

にて

5

倍希釈し 逆転写反応液とした.

3)  R e a l

^司

t i m ePCR

法

R e a l ‑ t i m e  PCR

法には

SYBRPremix Ex TaqTM  ( P e r f e c t  R e a l  Time) @ 

(タカラバイオ，大津)を用 いた.ウシ 2型 コ ラ ー ゲ ン お よ び ア グ リ カ ン の

cDNA

に対するプライマーの塩基配列を表

1

に示 す.これらが目的遺伝子に対して特異的である事を 確認し，

SYBR Premix Ex Taq ( 2  x) 1 0

叫

PCR Forward Primer 0 . 8 ぃ 1 ， PCR R e v e r s e  P r i m e r  0  ̲  8 

1‑1

1 ，  ROX R e f e r e n c e  Dye ( 5 0  x)  0 . 4

叫 滅 菌 蒸 留 水

7

1‑1

1

，逆転写反応液

1

1‑1

1

で計

2 0 ぃ 1M i x t u r e

を作 製し，

R e a l ‑ t i m e  PCR

法 を 行 っ た . 初 期 変 性 は

9 5

⁰

C

lO秒，その後

9 5

⁰

C5

秒，

6 0

⁰

C30

秒の

2s t e p  PCR 

を

4 0

サイク/レ行った.

ABI  PRISM  T M  7 7 0 0   Sequence  D e t e c t o r

に て 各

mRNA

の 発 現 量 は

c y c l e  t h r e s h o l d

値

( C t

値)を算出し，さらに

β

ーア クチン及びコントロールの

C t

値で補正し，デルタ デルタ

C t

値を算出し，各遺伝子共に発現量は

70%

コンブルエント細胞に対するパーセンテージで算出 表1 本研究に用いたプライマ一塩基配列

cDNA  F o r w a r d  p r i m e r  

した.

4 .

老化関連

β

ーガラクトシダーゼ

(SAβGAL)

染 色による細胞老化の評価

酸化

LDL

による軟骨細胞における細胞老化の評 価 を

SAβ‑GAL

染 色

( S e n e s c e n t C e l l s   H i s t o ‑ c h e m i c a l  S t a i n i g  K i t

円

Sigma)

を用いて行ニった.

3 5  m m   d i s h

に軟骨細胞を

1X  1 0

⁶個播種し

70%

コン フルエントになった時点で

n a t i v e LDL 

(1

0 0

^仲

g / m

I)，または，酸化

LDL(  0

， 

5 0

， 

1 0 0 ぃ g/m

I)を加

え，

2 4

時 間 反 応 さ せ ， 培 地 を 除 去 し

P h o s p h a t e ‑ B u f f e r e d   S a l i n e   (PBS)

で 一 度 洗 浄 し

F i x a t i o n B u f f e r

を加え室温で

7

分間インキュベートした.そ の後

3

回

PBS

にて洗浄し，

S t a i n i n g  Mixture

を加 え

1 2

時間

3 7

⁰

C

でインキュベートした.最後に倒立顕 微鏡

(PHASECONTRAST‑2 ELWDO.3 ，  Nikon ， 

東京)にて軟骨細胞を観察した.同様に前処理とし て抗ウシ

LOX‑1

マウスモノクローナル抗体

(TS‑

2 0 )

，非特異的マウス

IgG

をそれぞれ

4 0

い

g/ml

を

3 0

分間反応させた後に酸化

LDL

を

1 0 0 ぃ g/ml

を

2 4

時 間加え，同様に染色を行い観察した.

5 .   5 '

プロモー

2 '

ーデオキシウリジン(B

rdU)

の取り 込みによる細胞分裂能の評価

軟骨細胞の細胞分裂能の評価を

BrdU

に対する 蛍光染色

(BrdU

ラベリング&ディテクションキッ

ト

I

円

RocheD i a g n o t i c s

， 

Mannheim

， 

Germany

，  カタログ

No .   1 2 9 6   7 3 6 )

を用いて評価した.軟骨 組織より分離し，培養する前の軟骨細胞及び

35mm d i s h

に

1X  1 0

⁶個播種し ，

70%

および

100%

コンブル エントになった時点での軟骨細胞に対し，培養メデ イウムで

1 0 0 0

倍希釈した

BrdU

標識メディウムを l

w e l l

あたり

5ml

加え

3TC

にて

6 0

分間反応させた.

その後洗浄液にて洗浄しマイナス

2 0

⁰

C

にて1時間エ タノール固定液

( 7 0ml

の無水エタノールに

50mM

のグリシン溶液を

10ml

力日えたもの)

1  w e l l

あたり

1 ml

にて固定し

3

回 洗 浄 液 に て 洗 浄 し た 後 に 抗

BrdU

をインキュベーション緩衝液にて

1 0

倍希釈し た抗

BrdU

反応液を

1w e l l

あたり

3ml

加え

3TC

，

3 0

分間インキュベートした.そして

3

回洗浄液にて 洗浄し

PBS

にて

1 0

倍希釈したフルオレセイン標識 抗マウス

I g

反応液を

1w e l l

あたり

3ml

加え

3TC

，

3 0

分間インキュベートした.そして共焦点レーザー 顕微鏡

(LCM5P  ASCAL L a s e r  S c a n n i n g  M i c r o ‑ s c o p e

， 

C a r l  Z e i s s

，東京)を用い

200mw

アルゴン

R e v e r s e  p r i m e r   B o v i n e  t y p e  I I   c o l l a g e n  

B o v i n e  a g g r e c a n  

TGGTATCGCCGGACCCAAG  CACCTGTAAAAAGGGCACAGTG 

CTCGTCCACCGTCCTTCCC 

GCATTGATCTCGTATCGGTCC 

4 8  

頭 司 敏 史 他 レーザー，波長

488nm

で励起し，

5 2 5nm

の

FITC

フ

ィルターにて細胞を観察した.

さらに

ELISA

法

( C e l l P r o l i f e r a t i o n   E l i s a

， 

BrdU

 ，li!

Roche  D i a g n o t i c s

カ タ ロ グ

No.1 6 4 7   2 2 9 )

を用いて，培養前の軟骨細胞，および

70%

コン

ブ ル エ ン ト 細 胞 と

100%

コ ン フ ル エ ン ト 細 胞 の

BrdU

取込みを定量した.また，

70%

コンブルエント 細胞に対しては

n a t i v eLDL (0

， 

1 0

， 

5 0

， 

1 0 0

阿/

m

I)および酸化

LDL( 0

， 

1 0

， 

5 0

， 

1 0 0

い

g/m

I)を 加え，

2 4

時間インキュベートした後に，

BrdU

取込み を定量した.同時に酸化

LDL

添加前に

TS‑204 0 ぃ

g/ml

，および非特異的マウス

IgG4 0 ぃ g/ml

を前処 理として

3 0

分間反応させ

LOX‑1

の抑制実験を行っ た.

プロトコールに従い，

9 6  w e l l

プレートに

1w e l l  

あたり軟骨細胞を

2X10'

個播種し

3TC

で培養した.

培 養 後 培 養 メ デ ィ ウ ム で

1 0

倍 希 釈 し た

BrdU

標識 溶 液

1w e l l

あたり

1 0 ぃ l

加 え

3TC

で

2

時 間 培 養 し た.培養後培養メディウムを除去し，

1  w e l l

あたり

2 0 0

1‑11の

FixDenat

を 加 え 室 温 で

3 0

分 間 反 応 さ せ た.反応後

FixDenat

を除去し，ブロッキング剤(ブ ロックエースベ雪印乳業，札幌)を

2 0 0

ぃl/

w e l l

加え

1 5

分間作用させた.そしてブロッキング剤を除去後，

抗体希釈液にて

1 0

倍希釈した抗

BrdU‑POD

ストッ ク液を

1w e l l

あたり

1 0 0 ぃ l

加 え 室 温 で

9 0

分 間 作 用 させた.最後に

3

回

1w e l l

あたり

2 0 0 ぃ l

の洗浄液に て洗浄し

1w e l l

あたり

1 0 0 ぃ l

の 基 質 液 を 加 え

5

分 間 室 温 で 反 応 さ せ ， マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー

(Model  6 8 0   MICROPLA  TE READER ，  ^BIO  RAD

， 

H e r c u l e s

， 

CA)

にて波長

3 7 0nm 

(対照波長

4 9 2  nm)

における吸光度を測定した.

6.

軟骨細胞のテロメラーゼ¥活性の測定

軟骨細胞のテロメラーゼ活性の測定には

s t r e t c h PCR

法

( T e l o C h a s e r

円

TOYOBOc o  L  TD

，大阪) を用いた.

1

アッセイあたりの細胞数は

2X10'

個と し，陽性対照にはキット付属の

HeLa

細胞抽出液を 用いた.

1 )細胞抽出液の作製

回収した軟骨細胞にキット添付の

L y s i sS o l u t i o n  

を加え，氷上にて

3 0

分 間 静 置 し た 後 に

1 5

，

0 0 0

回転/

分，

2 0

分間遠心分離し，その上清を細胞抽出液とし Tこ

2 )テロメラーゼ反応

作製した細胞抽出液

2 0 ぃ l

に滅菌蒸留水

8

叫，キッ ト添付の

e x t e n s i o nb u f f e r

及 び

Primermix 

(1)をそ れぞれ

4 ぃ l

加 え 計

4 0

1‑11とし，サーマルサイクラー にて

3TC

，

3 0

分間インキュベートしテロメラーゼ反 応を行った.

3 

)精製

テロメラーゼ、反応液

4 0 ぃ l

に

c l e a nup s o l u t i o n  A 

を

2 0 ぃ

l加え撹枠し，そしてイソプロパノールを加え た

c l e a nup s o l u t i o n  B

を

1 3 0

凶加え，氷上にて

1 0

分 間静置後懸濁し，

1 2

，

0 0 0

回転/分，

1 0

分間遠心分離し た.上澄を除去し，ぺレツトに対し

200μl

の

80%

エタ ノールを力日え，デキャンテーションにてエタノール を除去，この操作を2回施行し，最後に遠心分離機 でフラッシュしエタノールを完全に除去した.残っ たペレツトは室温で乾燥させた.

4 )   PCR

法

乾 燥 し た ペ レ ッ ト に 滅 菌 蒸 留 水

1 7 . 4 6

1‑1

1

，

PCR  B u f f e r  6

凶，

Primer mix ( 2 )

， 

Primer mix ( 3 )

をそれ ぞれ

3

1‑1

1 ，  Platinum Taq polymerase

⑮

( I n v i t r o g e n ，  Auckland

， 

N  ew  Z e a l a n d )

を

0 . 5 4 ぃ l

加 え 計

3 0 ぃ l

と

しサーマルサイクラーを用い

PCR

を行った.温度 条件は初めに

9 5

0C

2

分

3 0

秒加温し，その後

9 5

⁰

C30

秒，

6 8

⁰

C30

秒，

7 2

⁰

C45

秒で

3 3

サイクル施行した.得られ た

PCR

反応液に対し

LoadingDye

を加えた上で

1 0

%ポリアクリルアミドゲルを用い

100V

，

1

時間で電 気泳動した.泳動後ゲルを

0 . 5 ぃ g/ml

のエチジウム ブ ロ マ イ ド 溶 液 に

1 5

分 浸 漬 し プ リ ン ト グ ラ フ

(A  TTO  AE‑6932)

を用い

UV

照射下に撮影しバン ドを検出した.検出されたバンドの強度は画像解析 ソフトウェア(I

mage‑ J  ve

r. l. 3

7

， 

N  I H )

を用い測 定した.

7 .

ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト に よ る 軟 骨 細 胞 に お け る

Akt

， 

pAkt

の検出

軟 骨 細 胞 に お い て

Akt

及 び

pAkt

を検出するた めにウエスタンプロットを方包

f

子した.

1)細胞溶解液の作製

1

アッセイあたりの細胞数を

2X1 0 '

個とし，

sam‑

p l e  b u f f e r  s o l u t i o n  

(和光純薬，大阪)を加え

5

分間 煮沸し，その後

1 2

，

0 0 0

回転/分，

1 0

分間遠心分離し上 清のみ回収し細胞溶解液とした.

2 

)電気泳動およびメンブレンへの転写

細胞溶解液は

sodiumd o d e c y l  s u l f a t e   (SDS)

含 有10%ポリアクリルアミドゲルにて

150V

，

1

時間で 電気泳動しさらに

PVDF

メンプレン

(Highp e r f o r ‑ mance c h e m i l u m i n e s c e n c e  f i l m

， 

Amersham B i o s ‑ c i e n c e

， 

Buckinghamshire

， 

E n g l a n d )  

vこ

150V

，

1

時 間で転写を施行した.その後ブロックング剤と 4⁰C，

o v e r  n i g h t

で反応させた.

3 

)抗体との反応と検出

ブロックエースとの反応後

0.2%TWEEN  ‑PBS 

とブロックエースを9 : 1の割合で混合し抗体希釈 液を作製し.

1 0 0 0

倍希釈した

1

次抗体にメンブレン を漫し室温で

1

時間，

7 5 0 0

倍希釈した

2

次抗体にて

D).また，酸 化LDL100同Iml;を添加する際に，

抗ウシLOX‑1マウスモノクローナル抗体 (TS‑20) 前 処 理(40陪 Iml，30分間)を行うと SAβ GAL活 性の上昇が抑制されるが(図

2 E)

，非特異的マウス IgG前処理 (40ルg/ml，30分間)では抑制されなか った(図2F). 

3. BrdU取込みによる細胞分裂能の評価

蛍 光 顕 微 鏡 を 用 い た 軟 骨 細 胞 のBrdU取 り 込 み の観察において，70%コンフルエント細胞と100%コ ンブルエント細胞を比較すると，70%コンフルエン ト細胞の蛍光強度が強く，また，軟骨組織から分離 直 後，培養前の軟骨細胞では蛍光はほとんど認めら れなかった(図3A). ELISA法による軟骨細胞の BrdU取込みの定量的測定でも同様の結果が得られ

m u n u n u n u n u  

r

︑

︒

o

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a崎 司

ζ

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求︒

と

04F)

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自 由 内 川 内 川

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'

a u   BUν次u似MH 訓 川 刊

U

綱川

nu w

川 内 U W M

7

目 ー は

•

N;4  .p<O.01  ..p<O.05 

Aggrecan  Type II collagen 

70%および100%コンフルエントのウシ培養 軟骨細胞における軟骨基質遺伝子発現.Real‑ time PCR法を用い軟骨細胞によるアグリカ ン(Aggr巴can)および2型コラーゲン (Type II  collagen)  mRNAの発現量を比較した

(N=4， 

* 

p<O.05， 

*  * 

p<O.Ol， Student'  s paired t‑test). 

。

図 1 震還しながら 1時 間，室 温 に て 反 応 さ せ た.0.2% 

Tween‑PBSにて3回洗浄後ECL plus  Western  Blotting Detection System@ (Amersham Bioscien・

ce)を使用し，メンブレンを遮光下に5分間反応さ せフィルムに感光後現像した.検出されたバンドの 強度は (Image‑

J 

ver. l. 37， NIH)を用い測定した.

8.統計学的検討

得 ら れ た 各 デ ー タ は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 (mean

: t

SD)で表し，有意差検定にはpairedStudent's t‑test  及び分散分析法(One‑wayANOV A)を用いた.P< 

0.05を統計的有意とした.

1. Real‑time PCR法 に よ る ア グ リ カ ン お よ び2 型コラーゲンmRNAの発現の検討

70%コンフルエン ト細胞，100%コンフルエント細 胞 共 に2型コラーゲンおよびアグリカンのmRNA の発現を認めた.両遺伝子ともに70%コンブ/レエン

ト 細 胞 に お い て 発 現 が 高 い 傾 向 が 認 め ら れ た ( 図 1).この事から本研究に用いる70%コンブ/レエント 細胞は軟骨細胞としての形質を保持し，積極的に軟 骨 基質を産生していると考えられた.

2.老化関連βーガラクトシダーゼ、 (SAβGAL)染 色

SAβ‑GAL染色で は 酸化LDL0， 50， 100 J.1g/ml  を添加した軟骨細胞は濃度依存性に淡青色の染色性 が充進し，SAβ‑GAL活性の上昇を示した(図2A

C).  Native LDL 100

ぃ

g/mlを添加した軟骨細胞 ではSAβ‑GAL活 性の上昇を認めなかった(図2

果 結

酸化LDL添加による老化関連βガラクトシダーゼ (SAβ GAL)活性の変化.

70%コンフルエントとなったウシ関節軟骨細胞にそれぞれ酸化LDLO

ぃ

g/mlω，50μg/ml(臥 100阿 /ml(C)， native LDL 100

ぃ

g/ml(D)を添加し， 24時間培養した後に SAβGAL染色を行い，

倒立顕微鏡にて観察した.さらに，抗ウシLOX‑1マウスモノクロ一ナノレ抗体(TS‑20)(E)，非特 異的マウスIgG(mouse‑IgG) (町を40同/ml添加し30分間前処理した後に，酸化LDL100仲g/ml を添加し，同様にSAβ‑GAL染色を行った (X400倍l.

図2

た(図3B). 次に，重変化LDL添加が70%コンブル エント細胞の分裂能に与える影響について検討し た.ELISA法 に よ る BrdU取 込 み の 測 定 で は native LDL (0， 10， 50， 100 f>>g/ml)を添加した 擦には吸光度に変化が見られなかったが(図4A)，  酸 化LDL (0， 10， 50， 100 

ぃ

g/ml)を添加した際

には濃度依存性に吸光度の減少を認めた(図

4B). 

また，この吸光度の減少はTS‑20前 処 理 (40いg/

ml，30分間)により回復し(図4C)，非特異的mouse IgG前処理 (40

ぃ

g/ml，30分罷)では濃慶依存性の 吸光度の減少を認めた(図4D).

4.酸 化LDLの培養軟骨細胞テロメラ 与える影響

1 )境養軟骨細抱テロメラーゼ活性の評価

HeLa細胞のテロメラーゼ、活性を100%として比 較すると，

7

叩0%コンブルエント軟管綿胞のテロメラ 一 ゼ

ント軟骨細抱では1.

9

如

O

土1.

1

叩

9%

と著しく低値であつ た. また，軟骨産品織から分離した産後の軟骨縮胞で はテロメラーゼ活性はほとんど検出されなかった (函5).画像解析ソフト(Image‑

J 

ver. 1.37)によ る定量化の結巣を表2に示す.以下のテロメラーゼ、

活性の測定実験では， 70%コンブルエント軟骨細胞 を用いた.

2 )酸化LDL添加によるテロメラーゼ活性の経時 的変化

酸化LDL50いg/mlを添加し 0，3， 

6

， 12，  24時 間 経 過 後 の テ ロ メ ラ ー ゼ 活 性 をstretchPCR  法で検崩し，画像解析ソフト(Image‑

J 

ver. 1.37) 

史 他 弓 敏

頭

A 

50 

Phase‑ contrast  Images 

ゼ活性に Chondrocyte 

(pre‑incubated) 

N=4 

*p<0.01  100% confluent cell 

… ー*  70% confluent cell 

0.5 

日3

0.4 

0.2  0.1 

B 

FITC  Images 

(

﹁ 江 hNmMせ︿戸

EE

口h m︿ ) ωυ p w勺

門戸

向︒

の﹄

︿

chondrocyte  (pre‑incubate)  100% 

confluent  cell  70% 

confluent  cell 

G 

BrdU取込みによる細胞分裂能の評価. A 蛍光顕微鏡を用いた軟骨細胞のBrdU取り 込みの観察.70%，および100%コンブルエン

トの軟骨細胞，培養前の軟骨細胞のBrdUの 取り込みを拡大率400倍にて観察した.B  ELISA法にて各軟骨細胞のBrdUの取り込 みを定量した.結果は平均値土標準偏差で示 す.(N二 4，ANOVA， 

* 

p<O.Ol)  間3

* 

* 

8 

0.4 

0  1 ..

0.2 

A 

さ0.5

'

"

 ^マ_< 04 

5二

'2 C 3 

~

τ02 〈 らJ f 

"2 0 1 

)  f  ぷご

く 口

酸化LDLによる軟骨細胞の細胞分裂能 の変化.

70%コ ン ブ ル ヱ ン ト の 軟 骨 細 闘 に native LDL (0， 10， 50， 100 f1g/mI)  (A)，酸化LDL(ox‑LDL)  (0， 10， 50，  100いg/mI)(B)を添加し， 24時間インキュ ベートした後にBrdU取込みをELISA 法にて定量した.酸化LDL(0， 10， 50，  100 f1g/m])の添加前にすS‑20 (40μg/ 

m!， 30分間)(C)，および，非特異的マウ スIgG (40問/m!，30分間) (防にて前処 理を行い， LOX‑1の抑制実験を行った.

結果は平均値土標準偏差で示す

( N

ニ

4

， ANOVA， 

* 

p<u.ul). 

間4 100 

Nぼ4

'p<0.01 

*  10  50  Ox‑LDL(μg/ml) 

* 

D 

D  0.1 

日

100 

0.5 

0.4 

口3 C 2 

10  50  Nalive LDL (μg/ml) 

。

E 

C 

に

て 05

凶 寸

〈 E口々

O C  口3

〈

02 

こ 勺

~ G 1 

~ fl 

〈

100 

o 

10 

Ox‑しむし(μg/ml)

十mouseI宮G(4臼μ号Iml)

50  01 

0 

100  o  10 

Ox‑LDL (μg/ml) 

十TS‑20(40μg/ml)  50 

に よ り 定 量 し た . テ ロ メ ラ ー ゼ 活 性 は 経 時 的 に 低 下 し ， 添 加 後24持 聞 でtime‑Oの23.4土4.44%となっ た . コ ン ト ロ ー ル お よ びnativeLDL 50 j.1g/ml添 加 で は 経 詩 的 に 有 意 な 変 北 は 認 め ら れ な か っ た ( 悶

6 ) .  

3 ) 酸 化LDLによる軟骨細胞のテロメラーゼ、活性 の 経 量 的 変 化

理変化LDL (0， 10， 50， 100，l.トg/m])を12時 間 反

100  10  50 

Ox幽しDL(μg/ml) O 

A 

8 

150 

50 

門unU I 

(一白い一窓口U﹄Oザ小)

﹀τ﹀ぷU巾φ

目︒

いmW

CL

一ω M O

や﹀

一以

門司

一

m wv

協

100 

。

( 石

LHCOU﹄

O J小)

﹀ な

﹀ 一 判 定 忠

ω告

50 3H ω

﹀ぷ町一む日比

2 3 4 5 6 7 8 9   ウシ培養軟骨細胞におけるテロメラ の評価.

軟 骨 細 紹 に お け る テ ロ メ ラ ー ゼ 活 性 を stretch PCR法を用い検出した.テロメラー ゼ活性はactivityband ladderとして鏡察さ れる.Positive controlとしてHeLa紹胞を 使用した.各サンプルの熱処理は85'C，10分 間とした. 1: HeLa ce l!， 2: 70% conflu‑ ent  ce !，l 3: 100%  confluent  ce ，!l 4  Pr巴ーincubated chondrocyte 5 : HeLa cel! 

(熱処理)， 6 : 70% confluent cel!  (熱処理)，

7 : 100% confh淀川cel!(熱処理)， 8 : Pre‑ incubated chondrocyte (熱処理)， 9 : Nega‑

tive  control.  (キット添付のLysissolution  のみ)

図5 ゼ活性

15口

日口

ゼ活性

τelomerase activity  (% of HeLa cel!s)  (

恥1eanゴ二 SD， N  4)  各培養軟骨細胞のテロメラ

表2

o  10  50  100  Oxし闘DL(μg/ml) +

τ s

^開20(40μg/ml)  7.75土1.44 

1. 90土1.19 O. 25:t0. 56  70% confluent cel! 

100% confluent cel!  Pre‑incubated cεl! 

C 

** 

N=4 

*p<0.05 

**p<0.01 

150 

50 

ハUハυ1i 

(EHCOU﹄

O J C

﹀r

﹀町

村u m

m wd

山内

川﹂

む戸

一いU Mω O

﹀一判︒一むほ

時ゆ棋倒仁Or1tro!

~Ul; '1 cLOL

o  10  ~ 100 

0

ルLDL(μg/ml)+mouse IgG (40μg/ml)  酸化LDLによる軟骨細胞テロメラ

の用議反応.

A.軟骨細胞に酸化LDL( 0， 10， 50， 100い g/ml)を添加し， 12時間インキュベートした 後にテロメラーゼ、活性を滅定した.B.前処 理としてTS‑20を40j.1g/ml， 30分間反応さ せ， I司様にテロメラーゼ活性を澱定した.

C. 

mouse IgGを40いg/mlを加え30分間反応さ せ，司様にテロメラーゼ活性を澱定した.各 系列において酸化LDL添加濃度。ぃg/mlで のテロメラーゼ活性の平均値に対する相対値 を算出した.エラーパーは標準偏差を示す (N二 4，ANOVA， 

*  : 

p<0.05， 

*  *  : 

p< 

0.01) .  悶7 ゼ活性

N=4 

官p<O.01

Time course (h) 

Native LDL，酸化LDLを50いg/ml添加した 際のテロメラーゼ活性の経時的変化.

各系列の数値はTime‑Oでのテロメラーゼ、活 性に対する相対値の平均値で示した.エラー ノてーは標準偏差を示す.Controlには培養メ ディウムのみで培養した軟骨組抱のテロメラ ー ゼ 活 性 を 示 す (N^二 4，ANOVA， 

* 

p< 

0.01) . 

120 

100 

自由

24  12 

。

る 60 

<

10 

10 

。

(O φE Co JC  

KAH

一 ﹀ 一 ぢ 何

ω的

m w ﹂

ωε

一 忠 o

ω﹀ 一 潟

一 ω M L

国6

重量:

O x ‑ L D L   O x

^同LIコL + IGF‑1 

( 1 0 0 n g / m l )   0 . 0 5  

L Y294002 (nM) 

* *  

* 

* *  

0 . 5   O 

史他

む

1/) 

f耳

」

む

E ム100 .Q b 

(j)  4幽J

(j) 

〉

ゆd

m 

む こ と

B 

1 5 0  

5 0  

円u

n U 

41 ム

‑ u

↑ ︒

出W A w

・5￡m 22 mw

﹀ 一 志 一

e N L

1 5 0  

5 0  

。

A 

敏 河

5 2  

頭

100  Ox‑

しむし

(μg/ml)

P I 3   k i n a s e

特異的阻害剤

L Y 2 9 4 0 0 2

と酸化

LDL

添加持のテロメラーゼ活性の変化.

A 

軟骨総胞に

P

I3

k i n a s e

特異的阻害剤で ある

LY 2 9 4 0 0 2  (  0

， 

0 . 0 5

， 

0 . 5

， l. 

0  nM)

を 添加し，

2 4

時間後のテロメラーゼ活性を測定

した.

B.

軟骨細胞に酸化

LDL(0

， 

1 0

， 

5 0

， 

1 0 0  

J.1

g/m

I)を添加し，

1 2

時間後のテロメラー ゼ活性を測定した.河時に

P I 3k i n a s e  

活性化 冨子である

IGF‑1100ng/ml

を添加した場 合のテロメラーゼ活性も示す.数値はコント

ロールに対する相対値で示した.エラーパー は標準偏差を示す

(N

二

4

，

ANOVA

， 

*  :  ^p< 

0 . 0 5

， 

*  *  :  ^p<O.O

^l). 

10  50 

G 

O 

盟8

A  O x ‑ L D L  ( 5 0 μ

g/ml)  + IGF‑1 (100ng/ml) 

O x ‑ L D L  ( 5 0 μ

g/ml) 

L  Y 2 9 4 0 0 2  ( 0 . 5 n M )  

W e s t e r n   B l o t

によるリン酸化

Akt ( p A k t )

の検出.

A.

軟骨細胞に

L Y 2 9 4 0 0 2

を

0 . 5 nM

，酸化

LDL

を

5 0

ほ

/ m l

，酸化

LDL

と河時に

IGF‑1

を

1 0 0n g /   ml

添加し，

0

， 

5

， 

1 0

分経過した 時点、での

pAkt

を

W e s t e r n

Bl

o t  

にて検出した. B. 検出されたバ ンドの強度を画像解析ソフト (I

mage‑

J 

v e

r.  1.37)を用い測定 し，

t i m e ‑ O

の強度に対する相対儀 を 平 均 値 土 標 準 偏 差 で 示 し た

(N=4

， 

ANOVA

，中:

p<0.05

， 

*  *  :  p < O . O l ) .  

国9

1 0  ( m i n )  

会 *

応 さ せ ， 軟 骨 細 胞 の テ ロ メ ラ ー ゼ 活 性 を

s t r e t c h PCR

法で検出し，画像解析ソフト

(Image‑ J  ve

r.  1. 3

7 )

により定量した.酸化

LDL

添加により軟骨細 胞テロメラーゼ活性は濃度依存牲に低下した(図7

A).  TS‑20

前処理

( 4 0

い

g/ml

，

3 0

分間)によりテロ メラーゼ活性は自復したが，非特異的マウス

IgG

前 処 理

( 4 0

ほ

/ml

，

3 0

分間)では，酸化

LDL

添加によ り濃度訳存性にテロメラーゼ活性は低下した(図7 B

， 

C). 

5.  PI3k/ Akt

経銘のテロメラーゼ、活性におよぼす 影 響

軟 骨 細 胞 に

PI3 kinase

の 特 異 的 障 害 前

L  Y294002 (0

， 

0 . 0 5

， 

0 . 5

， 1. 0 

nM)

を添加し

1 2

時 間反応させ，テロメラーゼ活性を澱定した.テロメ ラ…ゼ活性は

LY294002

添加によりの濃度依存性に 低下した.また，駿化

LDL(0

， 

1 0

， 

5 0

， 

1 0 0

↓.L

g/m

l) 

を 添 加 す る 際 に

P I 3k i n a s e

の 活 性 化 悶 子

IGF‑1 1 0 0  ng/ml

を

i

弓時に添加し

1 2

時賠反応させると，酸 化

LDL

によるテロメラーゼ、活性の低下は回復した

(図

8A). 

6.

ウエスタンプロットによる

P

I3

k/Akt

経路の 検 討

1 )   L  Y294002

， 

IGF‑1

による

Akt

リン

E

変化反応へ の影響

軟骨細胞に

LY294002

を

0.5nM

添 加 す る と 経 持 的な

pAkt

最の減少を認め，添加後

1 0

分で

pAkt

は著しく減少した.また，酸化

LDL50

い

g/ml

添加 に お い て も 添 加 後

1 0

分 で

pAkt

量 は 著 し く 減 少 し た.酸化

LDL

添加の際に

IGF‑1

を

1 0 0ng/ml

同時 に添加すると酸化

LDL

による経時的な

pAkt

量の 減少は回復した(匿

9A).

これらの結果は，繰り返

童

書

O x ‑ L D L  

O x

^司

L D L

+ IGF‑1  (1むOng/ml) N=4 

* p < O . 0 5  

* * p < O . 0 1  

5 

~

1 0  

O  5 

1 0 0   1 5 0  

らむ

G 

* *   1 0  

5  G 

ち0 ハu n ν r J n u  

‑

( ‑

96 53

﹄o

Jψ )2

一3

時﹀ 広 一 mw wO_﹂ 仏

HV

叫︽ 止の

﹀一 阿部 一@ 広

p A k t  

話

1 0  ( m i n )  

o 

5 

Ox‑LD

し

( 5 0 μ

g/ml) 

o 

5 

1 0   。

L  Y294002 ( 0 . 5 n M )  

G 

Ox‑しDL (50μg/ml)  Ox‑LDL 

(50μg/ml) 

A 

pAkt  Akt 

10 (min) 

5  O 

。

10 

Ox^開LDL(50μg/ml)  +TS♂0(40μg/ml)  Native LDL 

(50μg/ml) 

8 

pAkt  pAkt 

10 (min) 

O  5  5 

10 

。

Ox岨しひし(50μg/ml) +mouse‑lgG (40μg/ml)  pAkt 

10 (min) 

。 5 

酸化LDL添 加 に よ る リ ン 酸 化 Akt (pAktl量の変化.

A.軟骨総砲に酸化LDLを50い g/ml添加しWestern Blotにて AktおよびpAktを検出した.B Native LDL 50いg/mlを添加し たサンプル，前処理としてTS‑20 40

ぃ

g/mlおよびmouse IgG 40い g/mlを30分間反応させた後に酸 化LDL50

ぃ

g/mlを添加したサン プルにてpAktを検出した.C. 

Western BlotによるpAktのノf

ン ド 強 度 を 画 像 解 析 ソ フ ト (Image‑J ver. 1.37)にて定量し，

time‑OでのpAktのシグナル強 度に対する棺対値を平均値土標準 偏差で示した(N二 4，ANOVA， 

* 

p<O.Ol). 

間10

Nロ4 台戸<0.01 t20 

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5  10 (min)  Ox輸しひし(50μg/ml)

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5  10  Native LDL (50μg/ml) 

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5  10 (min)  Ox‑LDL (50μg/ml)  + mouse‑lgG (40μg/ml) 

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5  10  Ox‑LDL (50μg/ml)  +TS暢20(40μg/ml) 

察

早期変形性関節症における変性軟骨組織の腎識的 な病理所見として，軟骨表層の線維北に伴う軟骨細 胞の増殖がある.軟骨細賠は基費中に埋め込まれた 成長因子の刺激を受け活性化され，細臨分裂能と基 質産生は充進していることが知られておれまた，

軟骨細胞は集鎮しクローニング(クラスタリング) と呼ばれる特徴的な組織像を呈する3日 こ の 窮 理 所見は軟骨組織の修復反応と考えられ，変形性関部 症における軟骨変性は，軟骨細胞老化に伴う細臨分 裂能および細胞機能の低下により生じる不十分な修 復反応が関与すると考えられている.すなわち，

期には成長因子刺激により軟骨J細招の分裂能と基質 (閲10C).

考 いて確認された し4回行った実験結果を麗像解析ソフト (Image‑

J 

ver. 1.37)により定量化したものにおいて確認され た(図9B). 

2 )酸化LDLによるAktリン喜変化反応への影響 軟 骨 細 胞 に 酸 化LDL50

ぃ

g/mlを添加しでも，

Akt最に変化を認めなかったが， pAkt量 に は 経 時 的な減少を認め，添加後日分で著明に減少した(図 10A). 一方， native LDL 50 j..Lg/ml添加では pAkt 量の経時的な減少を認めなかった(毘10B). また，

酸化LDL添加による pAkt量の減少はTS‑20前 処 理 (40

ぃ

g/ml，30分題)により回復するが，非特異 的マウス IgG前処理(40

ぃ

g/ml，30分間)ではpA話 量の回復は認められなかった(医10B).これらの結 果は，繰り返し4回行った実験結果を罷像解析ソフ ト(Image‑

J 

ver. 1.37)により定量化したものにお

54  頭 可 敏 史 他

産生能は充進するが，経過とともに軟骨細胞は老化 し分裂能および基質産生が低下する35 実際，

OA

軟 骨の軟骨細胞はテロメアの短縮，

SAβGAL

の発 現，細胞分裂能や基質産生能の低下など，老化細胞 に特徴的な表現形を示していることが報告されてお り ， 細 胞 老 化 と 軟 骨 変 性 の 関 連 が 示 さ れ て い る20，21，33

本研究では，まず，実験に用いる軟骨細胞の基質 産生能について

R e a l ‑ t i m ePCR

法にて検索をおこ なった.培地に添加する

FBS

の刺激を受け増殖過 程にある

70%

コンブルエント軟骨細胞は接触阻止 (c

o n t a c t  i n h i b i t i o n )

を生じた

100%

コンフルエント 軟骨細胞に比較してアグリカン

2

型コラーゲンと もに発現が充進していた.また，

BrdU

取込み能によ る細胞分裂能の評価においても

70%

コンブルエント 軟骨細胞は

100%

コンフルエントおよび組織より分 離した直後の軟骨細胞に比べて分裂能が高かった.

すなわち，実験に用いられた

70%

コンフルエント培 養軟骨細胞は成長因子により活性化された

OA

軟 骨細胞に近い表現形をもつものと思われた.

次いで，我々が注目する酸化

LDL

が培養軟骨細 胞に対して細胞老化促進因子として作用するかを検 討した.まず，細胞老化の生物学的マーカーである

SAβGAL

染色を行なった

.SAβGAL

は変性軟骨 におけるクローニング細胞に活性が高いことが示さ れており，軟骨組織においても細胞老化の生物的マ ーカーと考えられている21，33，37 酸化

LDL

添加によ り培養軟骨細胞の

SAβGAL

染色性は充進し，抗ウ シ

LOX‑1

抗 体 前 処 理 に て 染 色 の 抑 制 が 観 察 さ れ た.また，酸化

LDL

による軟骨細胞分裂能の変化を

BrdU

の取込み能にて評価した.

70%

コンフルエン トの軟骨細胞培地に酸化

LDL

を添加すると，

BrdU 

取込み能は用量依存性に低下し，抗ウシ

LOX‑1

抗 体前処理にて

BrdU

の取込み能が回復した.同様の 結果は血管内皮細胞においても示されておりへ酸 化

LDL

が軟骨細胞においても老化促進因子として 作用することが示された.酸化

LDL

のこの老化促 進作用は継代培養が不要であり，酸化

LDL

添加後

2 4

日寺問で明らかな変化が認められたことより未成熟 細胞老化であると考えられる19

細胞老化のメカニズムを説明する仮説として最も 一般的なものにテロメア仮説がある.テロメア長を 維持するテロメラーゼ活性は細胞老化に関わる重要 な酵素活性である39 テロメラーゼは生殖細胞や癌 細胞，株化細胞のような不死化細胞では高い活性が 認められるが，体細胞では活性が低いとされてき た26，²⁷，⁴⁰ーペ本研究では，まず，増殖活性が低いとさ れる軟骨細胞がテロメラーゼ活性を示すのか，また，

成長因子を含む仔ウシ血清を添加して行う細胞培養 により，テロメラーゼ活性が変化するかを検索した.

細胞を単離した直後の軟骨細胞ではテロメラーゼ活 性は認められず，

70%

コンフルエンスにおいては

Hela

細胞の約

8

%， 

100%

コンブルエンスにおいて は約

2%

であった.すなわち，成長因子刺激を受け て活性化した軟骨細胞では，

HeLa

細胞に比較して 低いながらも明らかなテロメラーゼ活性が認められ た.これは，通常の体細胞においてもテロメラーゼ、

活性が認められ，細胞増殖に関与するとの報告山 および，培養下に増殖する軟骨細胞においてテロメ ラ一ゼ、活性が認められるとの報告を支持する結果で あつた仰

してテロメラ一ゼゼ、活性の生理的制御を受けることカがま

報告されておりペ変性軟骨組織において増殖活性 を示す軟骨細胞のテロメラ一ゼ、活性は上昇しい，軟骨 細胞の老化遅延およびび、機能維持に役割を担うものと 考えられる.すなわち，テロメラーゼ、活性はテロメ ア構造の維持を介して組織修復に関与していること が推察される.

次に酸化

LDL

によるテロメラーゼ活性の変化を 経時的，経量的に観察した.酸化

LDL

添加により経 時的にテロメラーゼ活性は抑制され，

2 4

時間後には 添加前の約

20%

となった.また，酸化

LDL

は用量依 存性にテロメラーゼ、活性を抑制し，抗ウシ

LOX‑1

抗体による前処理は酸化

LDL

によるテロメラーゼ、

活 性 の 抑 制 を 回 復 し た . 以 上 よ り ， 酸 化

LDL

は

LOX‑1

との結合を介してテロメラーゼ活性を抑制 することが示された.前述の如く，

OA

軟骨細胞は増 殖活性を示し，増抱細胞においては生理的な制御と してテロメラーゼ活性の充進が生じるものと考えら れる.増殖軟骨細胞におけるテロメラーゼ活性の抑 制はテロメアの短縮やテロメア構造の不安定化をも たらし細胞老化を導くため，酸化

LDL

は組織の修 復を阻害する可能性がある.実際，

OA

軟骨細胞にお いてはテロメアの短縮が示されており，テロメア長 の短縮と

SA‑βGAL

発現克進，分裂能の低下の聞に

は強い相聞が認められている32

さらに本研究においては，テロメラーゼ、活性の制 御に関わる細胞内経路について検討を行った.テロ メラーゼはテロメラーゼ逆転写酵素部分のリン酸化 により活性の制御を受けており，そのリン酸化酵素 として，

PKC

および

Akt(PKB)

の関与が示されて きた19 一般に，

PI3k/ Akt

経路は細胞周期の進行，

核内転写因子の制御，細胞生存に重要な役割を果た すと言われ49‑51軟骨細胞において，この経路は軟骨 細胞の分化やアポトーシスの制御を行い52，アグリ

カンの発現調整を行うと報告されている53 また，ラ

ット軟骨細胞において，酸化LDLはPI3k/Akt経 路を不活化し，細胞活性を抑制することが知られて いる10 さらに， Breitschopfらは血管内皮細胞にお いて酸化LDLはPI3k/Akt経路を不活化し，テロ メラーゼ、活性を抑制することを報告している54 そ

こで，ウシ軟骨細胞においても，酸化LDLがPI3k/

Akt経路の不活化を介してテロメラーゼ、活性の抑 制を行うかを検討した.PI3 kinaseの特異的阻害薬 である LY294002は用量依存性にテロメラーゼ活性 を抑制し，PI3kinaseの活性化増殖因子IGF‑lは酸 化LDLによるテロメラーゼ、活性を回復した.また，

酸化LDLはリン酸化Akt量を経時的に減少させ，

抗LOX‑l抗体は酸化LDLによるリン酸化Akt量 の減少を回復した.これらの事から，酸化LDLよる テロメラーゼ、活性の抑制はLOX‑lとの結合を介し たPI3k/Akt経路の不活化によることが示された.

今回の研究においてはテロメア長の変化に関して は検討していない.一般に，ストレス因子である酸 化LDLやTNF‑a，H20Zは明らかなテロメア短縮 を伴わずにテロメラーゼ、活性を抑制し，未成熟細胞 老化を誘導すると考えられている¹⁹，53 また，テロメ ア長非依存性の細胞老化が分裂能を制限し，老化軟 骨細胞の蓄積に関与すること55 テロメラーゼ活性 はテロメア伸長のみならずテロメア長非依存性に体 細胞の分裂能を制御することが示されている18 ま た，本研究においても酸化LDLによる SAβGAL 活性の充進，細胞分裂能の低下は酸化LDL添加後 24時間以内に生じており，テロメア長の臨界短縮と は関連なく生じる現象であると思われる.しかし，

実際にO A軟骨細胞においてテロメア長の短縮が 示されており，酸化LDLは分裂し増殖する軟骨細 胞において認められるテロメラーゼ、活性を抑制する ことよりテロメア長の短縮をもたらす可能性があ る.今回のデータはそれらを示唆するものであるが，

酸化LDL添加によるテロメア長の変化に関しては 今後の検討課題としたい.また，未成熟老化が誘導 された細胞においては癌抑制遺伝子である p53の 安定化やRbの低リン酸化が，あるいはp53‑p21‑

pRb経 路 の 活 性 化 が 生 じ る と 言 わ れ て い る同37品 ペ 特 に SAβGAL活性の充進lこはP53に よるライソソームの透過性克進が関与するとされて いるためへ酸化LDLによるこれら老化関連遺伝子 の発現状況は興味深い点である.これらの点に関し でも今後の検討課題である.

我々は本研究において酸化LDLが そ の 受 容 体 LOX‑lとの結合を介して軟骨細胞の未成熟老化を 誘導するとともに，テロメラーゼ活性の抑制を介し て細胞老化に関与する可能性を示した.軟骨細胞老

化は細胞機能の低下により組織修復能の低下をもた らし，軟骨変性の進行に重要な役割を果たすと考え られる.酸化LDLは変形性関節症の病態形成に大 きな意義を持つと思われる.

謝 辞

稿を終えるにあたり，御指導・御校閲を頂いた浜西千秋教授 に深く謝意を表します.また，本研究にあたり御助カ頂いた整 形外科学教室大学院生の岸本英樹先生，三木良久先生，高度先 端総合医療センタ一再生部門の寺村岳士先生，実験助手の皆 様に心から感謝申し上げます.

文 献

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