揮発性化学物質の神経系細胞への効果
山田 康枝 , 大谷 航平，白石 浩平
Effects of volatile chemicals on neural cells
Yasue YAMADA, Kohei OHTANI ， and Kohei SHIRAISHI
The toxicity of volatile chemicals in the neural cells has not been investigated in detail. The toxicity of 2-ethyl-1-hexanol，n-octanal，and nonanal were examined in human neuroblastoma cell lines SK-N-SH and rat primary cultured neurons. These chemicals were used to strengthen the natural rubbers by polylactic acid (PLA). One of fragrances in the forest (green leaf volatiles), cis-3-hexen-1-ol was examined about the toxic effect on these neural cells. All volatile chemicals except for cis-3-hexen-1-ol showed the high toxic effects on SK-N-SH cells and the rat primary cultured neurons. Additional study is needed to elucidate the mechanism of the toxicity.
Keywords : neural cells / human neuroblastoma / volatile chemicals/ toxicity
1. 緒言
これまで開発された化学物質には，その毒性が問題 なったPCBや内分泌攪乱物質のように，広汎に使用 後にその毒性がわかり，大きな被害をもたらしてい るものがある．今後開発されていく化学物質や多用 される化学物質は，使用前に十分その安全性が検討 されるべきであり，安全性の高い代替物質を使用し ていく必要性がある．そのためにも，事前の安全性 試験をさらに十分検討する必要がある．化学物質に 対しては，化学物質審査規制法や農薬取り締まり法，
薬事法などで急性毒性試験などのような一般的な毒 性試験は行われているが，神経系細胞への直接の毒 性試験はほとんど行われていない．これまでに，ヒ ト神経芽細胞腫由来 SK-N-SH 細胞やラット初代培 近畿大学工学部生物化学工学科
養神経細胞に対して，生分解性プラスチックである ポリ乳酸の原材料であるラクチドの神経毒性につい て検討し，神経毒性が認められない安全な物質であ ることを報告してきた（1）．今回，当大学が開発した 天然ゴム/PLA (polylactic acid;ポリ乳酸)ハイブリ ッ ド 樹 脂 ・ ゴ ム 中 に 微 量 に 含 ま れ る 化 学 物 質 toluene, 2-ethyl-1-hexanol，n-octanal, nonanalの 神経系細胞への毒性効果を検討した（2)（3）（4）．
これまでに toluene のヒト前骨髄性白血病細胞 K562，ヒトリンパ腫由来細胞株 U937 細胞，ヒト 骨髄球性白血病細胞 HL-60 細胞への毒性と比べる と神経系細胞である SK-N-SH 細胞に対してさらに 高い感受性を示したことを報告している（1）．今回検 討した2-ethyl-1-hexanol, n-octanal, nonanalは Graduate School of Systems Engineering，Kinki
近畿大学工学部研究報告 No.46，2012年，pp.1-5 Research Reports of the Faculty of Engineering, Kinki University No.46 2012, pp.1-5
これまでヒトやラット肝臓の初代培養肝細胞やマウ スの精巣ガン細胞で毒性を検討されているが（5)（6）（7）， 神経系細胞への効果は検討されていない．
現在，様々な香気成分がアロマテラピーなどで用 いられているが，その神経系細胞への効果は詳細に 研究されていない．今回はその中でも，緑の香りと して，森林浴などの効果を示しているといわれてい る緑の香り cis-3-hexen-1-ol のヒト神経芽細胞腫由
来株 SK-N-SH 細胞とラット初代培養神経細胞への
効 果 を 検 討 し ， 揮 発 性 化 学 物 質 （toluene， 2-ethyl-1-hexanol，n-octanal，nonanal）の効果と 比較した（8）．
2． 実験材料と方法 2-1 試薬
2-1-1 揮発性化学物質の調製
Toluene，2-ethyl-1-hexanol, n-octanal, nonanal cis-3-hexen-1-olは揮発性物質であるため，使用直前 にSIGMA社のDimethyl Sulfoxide (DMSO) に無菌 的に溶解し，200 mMに調整し，使用の際に，最終 濃度0.5 mM, 2.5 mMになるように調整し，細胞に 添加した．
2-2 実験に用いた細胞 2-2-1 SK-N-SH細胞
ヒト神経芽細胞腫由来株 SK-N-SH 細胞は, 交感
神経系の神経細胞や副腎髄質細胞が分化する前にが ん化したものであり，神経細胞への分化能を持つこ とが知られている．本研究では, ヒト神経系細胞への 化学物質の効果について検討するために用いた．
SK-N-SH 細胞は独立行政法人 理化学研究所バイオ
リ ソ ー ス セ ン タ ー か ら 購 入 し た ．GIBCO 社 の Minimum Essential Alpha Medium (MEM)に FCS を最終濃度 10%になるように調整後，播種し，
37℃，5%CO2インキュベーター内で培養した．
2-2-2 ラット初代培養神経細胞培養法
今回用いたラット初代培養神経細胞は，正常ラッ ト胎仔の脳の大脳皮質から取り出した神経細胞を培 養したものである．正常な神経系受容体やタンパク 質を発現しているため，細胞応答性が高く，薬物活 性や細胞毒性評価に用いられている．本研究では，
化学物質が正常な神経細胞に与える影響，細胞毒性 について検討するため大脳皮質から取り出したラッ ト初代培養神経細胞を使用した．初代培養細胞は既 に報告している方法に従って作成した(1）．
グリア細胞の増殖を抑制するため，DNA合成阻害 剤である cytosine -D-arabino-furanoside (Ara-C:
SIGMA社) を最終濃度1～1.5 Mになるよう添加 した．HG-D-MEMと10% 牛胎児血清（FBS；fetal bovine serum）とAra-Cを加え，37℃で5% CO2イ ンキュベーターで培養した．神経細胞が神経突起を 伸ばし，他の細胞と接合し神経ネットワークを形成 するのを確認し，実験に用いた．本研究では，培地 とAra-Cの交換を3日に1回行い，培養20日のラ ット初代培養大脳皮質神経細胞を用いた．
本研究は, 近畿大学工学部動物実験小委員会の承 認をへて近畿大学動物実験委員会の承認を受け，近 畿大学動物実験規程に従って実施した．ラットは，
株式会社 広島実験動物研究所から購入した. Fig．1 揮発性化学物質の構造
2-3 MTTアッセイによる細胞毒性試験 2-3-1 MTTアッセイによる細胞毒性の測定
SK-N-SH細胞を2.0 × 105 cells/mlに調製し，コ ラーゲンコートされている 96 穴プレート(住友ベー クライト社)に200 lずつ播種した．試薬を1つのウ ェ ル に 添 加 す る 際 ，toluene，2-ethyl-1-hexanol, n-octanal，nonanal, nonanalは最終濃度が 0.5 mMに cis-3-hexen-1-olは最終濃度が2.5 mM， になるよう調整した． 5% CO2 インキュベーター内 で24時間培養した後， PBS（Phosphate Buffered Saline;リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した5% MTT (3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra- zoliumbromide) 液を20 l添加し，4時間，インキ ュベーションした．4時間後，培地の除去とPBSに よる洗浄を2回繰り返した．溶解液100 l (0.04 M イソプロパノール液と10%SDS溶液を等量混合) 加 え測定用96穴プレートに移して30分間，37℃でイ ンキュベーションした．その後，プレートリーダー (Bio-Rad社)で570 nmの吸光度を測定し，揮発性化 学物質の細胞毒性効果を検討した．
2-4 Live-Dead染色
生細胞と死細胞を見分け，細胞毒性を検討するた
め， Bio Vision 社の Live-Dead 染色を用いた．
SolutionA (Live-Dye) と SolutionB (propidium iodide)を用いたが，SolutionA (Live-Dye)は，細胞膜 透過性の緑色蛍光色素で生細胞を緑色に染色し，
SolutionB (propidium iodide) は，核酸にインター カレートする色素で死細胞を赤色に染色する試薬で ある．使用直前にSolution A 0.5 lとSolution B 0.4 lをPBS 800 lに溶解し混合溶液とする．20 日間培養したラット初代培養大脳皮質神経細胞を用 いてtoluene，2-ethyl-1-hexanol，n-octanal, nonanal, cis-3-hexen-1-olを添加し24時間反応させた．その 後，培地を抜き混合溶液を加えて15分間インキュベ ーションし，蛍光顕微鏡で生細胞と死細胞を観察し，
蛍光輝度を測定し，生細胞の割合を求めた.
3．結果と考察
3-1 SK-N-SH細胞に対する揮発性化学物質の効果
3-1-1 SK-N-SH細胞に対するcis-3-hexen-1-olの効 果
2.5 mMのcis-3-hexen-1-olを添加後24時間で，
53.8％の生存率を示した．同様に添加した toluene
0.5 mM では 57.3％の生存率を示したことから，
cis-3-hexen-1-olの毒性はtolueneと比べてかなり低 いことが示された．この物質は動物実験で抗不安効 果をもつことが報告されている（8）．そのため，毒性 が低いと考えられる．
3-1-2 SK-N-SH細胞に対するtoluene，2-ethyl-1- hexanol，n-octanal，nonanalの効果
SK-N-SH細胞に対するtoluene，2-ethyl-1- hexanol，n-octanal，nonanalの効果を検討したと ころ，Fig.2に示すように，特に2-ethyl-1-hexanol の細胞生存率が著しく減少した． Touleneの
SK-N-SH細胞への毒性のIC50は0.89 mM であるが，
2-ethyl-1-hexanol，n-octanal，nonanalは，それよ りさらに毒性が強いことが明かになった．これまで，
Fig．2 揮発性化学物質の細胞毒性
細胞濃度2.0×105 cells/mlに調節しcis-3-hexen-1-olは 2.5 mM，toluene，2-ethyl-1-hexanol, n-octanal, nonanal は0.5 mMを添加し24時間後にMTTアッセイによりそ の毒性を測定した．
2-ethyl-1-hexanolは香気成分としても使われていた ため様々な毒性試験は行われてきたが（９），神経系細 胞への効果は調べられてこなかった．今回の実験結
果でtolueneと比べても神経細胞への毒性が高いこ
とが明らかとなった．
3-2 ラット初代培養神経細胞に対する揮発性化学 物質の効果
SK-N-SH細胞への効果をもとに，cis-3-hexen- 1-ol ，2-ethyl-1-hexanol，n-octanal，nonanalの 培 養20日後のラット初代培養神経細胞への効果を検 討した．
3-2-1 Live-Dead染色によるト揮発性化学物質の細
胞毒性の観察
本研究では，ラット初代培養大脳皮質神経細胞に cis-3-hexen-1-ol，2-ethyl-1-hexanol，n-octanal， nonanal を 添加 し，24 時間 培養 した ．そ の後，
Live-Dead 染色し，それぞれの物質の毒性について
検討した．
培養 20 日目のラット初代培養大脳皮質神経細胞 にcis-3-hexen-1-olは2.5 mM, 2-ethyl-1-hexanol， n-octanal，nonanalは0.5 mMを添加後，24時間培
養した．その後，Live-Dead染色し，生細胞(緑色) と 死 細 胞(赤 色)を 染 め 分 け ， そ の 結 果 を cis-3-hexen-1-ol，n-octanal，nonanalについて Fig.
3に示した．ラット初代培養神経細胞にn-octanalは
赤く，nonanal は黄色く染色された．この画像は赤
の蛍光色の画像と緑の蛍光色の画像を合成したもの であるので，n-octanalでは緑色の生細胞が全く存在 しないことを示し，nonanal の場合は多くが死にか けている細胞であることを示している．この結果か らn-octanalの毒性の方がnonanalより強いことが 示された． cis-3-hexen-1-olを2.5 mM添加した細 胞では死細胞の数は少なかった．Fig. 4 には，生細 胞の輝度を測定した結果を示しているが，n-octanal，
nonanalは明らかに SK-N-SH細胞よりラット初代
培養神経細胞へ高い毒性を示した．揮発性化学物質 の効果は，ラットではあるが，成熟した神経細胞に 対して感受性が高いことが示された．森の香りとし て知られる cis-3-hexen-1-ol はヒトの神経系細胞ま たはラット神経細胞のどちらにも低い毒性しか示さ ない物質であることが示唆された．このように，ヒ ト神経芽細胞腫腫細胞由来細胞とラットの初代培養 細胞を用いることで，ヒトへの神経毒性をこれまで より厳密に予測が可能となった．今後は，この他の Fig．3 揮発性化学物質のラット初代培養大脳皮質
細胞への毒性
20 日 間 培 養 し た ラ ッ ト 初 代 培 養 細 胞 （A） に cis-3-hexen-1-ol は 2.5 mM （B）， n-octanal（C）, nonanal（D）, を0.5 mM，添加し24時間後にLive –Dead 染色した．
Fig．4 揮発性化学物質のラット初代培養大脳皮 質細胞への毒性
20 日間培養したラット初代培養細胞にcis-3-hexen-1-ol は2.5 mM，2-ethyl-1-hexanol, n-octanal，nonanalを 0.5 mM，添加し24時間後にLive –Dead染色後，その 生細胞の輝度を測定した．
揮発性有機化学物質や，香気成分についてその神経 毒性の作用機序を検討する必要がある．
4．結言
ヒト神経芽細胞腫SK-N-SHとラット初代培養神 経細胞に揮発性有機化学物質である2-ethyl-1- hexanol，n-octanal，nonanal添加し，神経細胞毒 性を検討したところ0.5 mMで高い毒性を示した．
特に初代培養神経細胞へ高い毒性を示した．森の香 りとして知られているcis-3-hexen-1-olについて検 討したところ，神経毒性はかなり弱いことが示され た．今後はこれらの物質のIC50 や神経活動への影響 を測定し，その神経毒性の作用機序を検討する必要 がある．
5．参考文献
(1)大谷航平, 山田康枝, 神経系細胞における化学 物質の毒性評価. 近畿大学工学部研究報告, 45,1-5 (2011)
(2)白石浩平，相良宗作，杉山一男，矢野徹，阪口 敬子，橋本邦彦，天然ゴムをミクロ分散したポリ乳 酸複合材料の開発．プラスチックエージ，54(12), 97-102 (2008).
(3)白石浩平，相良宗作，原田 大，杉山一男，矢 野 徹，阪口敬子，天然ゴム複合化による高強度ポ リ乳酸樹脂の開発．日本接着学会誌， 47(4), 131-137 (2011).
(4)白石浩平，ポリ L-乳酸／天然ゴム複合バイオプ ラスチックの物性に及ぼす加水分解抑制剤ポリカル ボジイミドの分子量の影響．近畿大学次世代基盤技 術研究所報告， 2, 53-59 (2011).
(5) Erkekoglu, P., Rachidi, W., Yuzugullu, O.G., Giray, B., Favier, A., Ozturk M, Hincal, F., Evaluation of cytotoxicity and oxidative DNA damaging effects ofdi(2-ethylhexyl)-phthalate
(DEHP) and mono(2-ethylhexyl)-phthalate (MEHP) on MA-10 Leydig cells and protection by selenium. Toxicol Appl Pharmacol, 248, 52-62 (2010)
(6) Martelli, A., Canonero, R., Cavanna, M., Ceradelli, M., Marinari, U.M. Cytotoxic and genotoxic effects of five n-alkanals in primary cultures of rat and human hepatocytes. Mutat Res.
323, 121-126 (1994)
(7) Belsito, D., Bickers, D., Bruze, M., Calow, P., Greim, H., Hanifin, J. M., Rogers, A.E., Saurat, J.H., Sipes, I.G., Tagami, H. A safety assessment of branched chain saturated alcohols when used as fragrance ingredients. Food Chem Toxicol. 48, S1-S46 (2010)
(8)Tokumo, K., Tamura, N., Hirai, T., Nishio, H.， Effects of (Z)-3-hexenol, a major component of green odor, on anxiety-related behavior of the mouse in an elevated plus-maze test and biogenic amines and their metabolites in the brain. Behav Brain Res. 166(2):247-52 (2006).
(9) Nishimura, H., Saito, S., Kishida, F., Matsuo, M., Analysis of acute toxicity(LD50- value) of organic chemicals to mammals by solubility parameter (delta). (1) Acute oral toxicity to rats．Sangyo Igaku. 36(5):314-23（1994）
6．謝辞
論文の作成にあたり，ご協力いただいた別所恵子 さんに感謝します．
