増殖 影 響 イ 細胞増殖 よ 株 抽出液 腔内細菌特

金 沢大学 十全医学 会 雑 誌 第94巻 第6号 1 1 5 5 ⁻11 6 8 く1 98 51

口腔 内細 菌 特^{に エ戊Cわぁ}戊C才肋s c 戊ざピグ0 1 2 3 株抽 出液 ^の 細 胞 増 殖および ウイ ^{ル ス}増 殖 ^{へ の}影響

金沢 大学が ん研 究 所ウ イル ス部く主任^こ波田 野基^一一教 掛

天 野 恵 大

冊用I G くI年^{1 2} 月^{2 5 日}受 付ユ

1 1 5 5

癌 細 胞障 害 活 性によ^って 選 ら ば れ た^口腔 内細 菌， 凡郁庖血涙 わ和 才 紺地舶用 7 H O 3 1⁻3 B_， エ戊油ム^ー

戊ぐ肋s c 昂ぶe川 1 2 3，エ戊Cわゐ戊C 肋s ぶ戊gオロ戊7イ祝ぶL S 3 薗株の菌 体抽 出液^の細 胞^およ び ウイル ス増殖^にお よ ぼ す

影 響^について検 討し た− これ ら 3 菌株を Ta m ai⁻Fukuda 培 地 CT F 培 榔 で増 殖さ せ た後， 超 音 液処理 を して から遠心分 離し， その上清を粗 抽 出 液と し た． ヒト胎 児小腸 由 来細 胞 く1nt朝 7 細 胞I を^{こ の}粗抽 出液 く蛋 白 濃度2 0 0JLgl ^mll ^で2 4時 間 処理 し た場 ％， 処理細胞 当りのEcho vir u s t y pe 6くEcho⁻6 ウイル ス1 産 生畳 は明らか に減少し た が，細 胞 増 殖は僅かな抑 制を受 け た^にすぎなかった． こ の Ecll O牒 ウ イ^{ル ス}増殖 抑 制は， 特^にエ毘加ぬ d 肋ぶ C 那 e川12 3 件^の粗 抽 出 液 瀾 抽 出液^{L C}ン 処理に お い て著明に認め ら れ た． 粗 抽 出 液L C につ いて は， さ ら^に硫 酸アン モ ^ニ ウム塩 析と，Sephade x G⁻2 0 0 によ る カラ ム クロ マ ト グ ラ フ ィ ^ー で部分精製を行^っ た− fnく分 子 量 2 00 K 以 上l， fbく分子 量 1 0 0 Kl， fcく分 子 量 2 0^へペO Kl と名 付け た Sephade x G⁻2 00 の主要 両 分は S D S⁻P A G E 分析によ る と， そ れ ぞ れ異な る分子量の いくつかの蛋 白の

混合 物で あ^った^． これ ら^の各 画 分につ い て細 胞又 は^ウイ^{ル ス}増 殖 抑 制活 性を測 定し た． Echo⁻6 あ るいは Co x B⁻5 ウ イ^{ル ス}感 削nt⁻4 0 7細 胞 系に お いて， 10w⁵⁰F^Lgl^ml のfb あ る^いは fc 画分で2 ^旬2 4時間 処理 し た細 胞では， 細 胞 当り^のウ イル ス塵生畳 が 1 0 ^旬4 0％ 減 少し た． しかし， イ^ンタ ^{ー フ ェロ} ンく工F N l 産生 誘 発 は 見 ら れ ず， こ のウ イ^{ル ス}増 殖抑 制には I F N の機構は関 与し て^いな^いと思わ れ た．次^にbabo o ne ndoge⁻ n e o u s vir u sくBaE VI 持続 感 染A 2 0 4くBaE V 糊 過と， hepatitis B vir u s 持続 感 染^{P L C}ノP R F15 細 胞^{に つ い} て， 細 胞^{およ びウ}イ^{ル ス}増殖 抑 制 効 果を検 討し た． fc 両 分処理 A 20 4 くB^aE VI 細 胞^では， 細胞 増 殖と細 胞 当り^の BaE V の放 出が 明 ら^{か に}抑 制さ れ た． 同様^にfb，fe画分 処理 P L CIP R F15 細胞^{に お い}て も細胞 増 殖 と， hepatitis B vir u s s u rfa c e a nti_ge nく^{H BsA}gl，a ⁻fetopr oteint A F Pl 両者^の塵 生に抑 制効果 が認め ら れ た． 特にfc 画分 で は， 低濃 度でも細胞^への持 続 的処理 あ る^いは少 数細 胞^{コ ロ ニ ー} 形 成でみる と， 強^い抑 制 効果 が^みら れ た． 以 上の結果^から， これ らの 口腔細 菌 構 成 分は， 腫瘍 細 胞 増 殖と， ウ イ^{ル ス}増 殖あ る^いは 放 出^への抑 制 効果を 示 すこと が 分っ た．

K ey ^{w o r}ds Lactoba cillu s， b_{a ct}e rial e xtr a cts_， Cul_tu r ed c ells， Viru s m ul_ti_pli⁻

C atio n_， Vir us p^{e r s}iste nt infe ctio n

ウ イ^ル ス の細 胞 内 増 殖を左右す る因子 と し て多くの 異的抑 制 物 質， 例え ば 血清 中^の非 特 異 的 抑 制 複 合蛋 ものが 知 ら れ て^いる． その中^で細 胞に作用 して細 胞 自 白^3，な ど がミ ク ソウ イ^{ル ス}， ピコルナ ウ イ^{ル ス}な ど^い 身には副作用 な く， ウ イル ス増殖^に抑 制 的^に働く もの く^つか のウ イル ス で知ら れ ている． その他に_， 或る種

と して inte rfe r o n 口F N J^{1 1 2I}が あ る^{． 一} 方， ウ イ^{ル ス}自 ^の蛋 白又 は核 酸 合成 阻 害 肘 ^は特 定 条件 下で細 胞 毒 性

身に作用 す る ものと しては， 特異 的 抗 体の他に_， 非 特 な く，ウイル ス の増殖^に抑 制効 果_{を 示 す}こと も あ る が，

A b br e viations 二A F P

， a ⁻fetop^rotein ニB aE V ， babo o n e ndog^{ene o u s v}iru sニB S A， bo vin e S e r u m al bu min三C I R_， C ell inj^uring ^{r e a c}tio nニC o x B ^A₅ ウ イ ル ス， Coxs a ck ie B vir u s t y p^e 5 F a ulkn e r 勘 ^{C P M} ， C u rie p^{e r m}in utei D B S， Dulbe c c o^，s b uffe r ed s alin e三Echo⁻6 ウ イ ^ルス，

Echo⁻Vir u s t y p^e 6 D^，A m o ri 勘 ^{E C −2 0r −5}，E agle^，s miⁿim u m e s s e ntial m ediu m s up ple m e nted

11 5 6 天

化 学 療 法 剤^．抗 生物 質と し て ^一般 化さ れ るには 至 って いな^い．

一 方， 微 生 物 代 謝産 物又 は抽 出物の示 す生物 活 性に は医 薬生 物 学 的^に有用 な も の が多く， 抗 生物 質は^いう ま で も な く， 諸種 酵 素及び その阻 害 物 質， 免 疫 捉 進 強 化 剤 くim m u n op^ote ntiato r 又 は im m u n o adju v a ntl な どが実用化さ れ ている^． これ ら の中で， ウ イル ス の細 胞 内増殖に抑 制 的に働く も の と し て， 菌 内 毒 素又 は抽 出物の I F N 誘発 能^り勾引風が知ら れ て^いる． この誘 発 機

作は， 通 常^のin du c e rく合 成^二重鎖^ヌクレオ タ イ ド や ウ

イ^{ル ス}な どコによ る もの と は異な り， 細 胞 内既 存^の I F N pr e c u r s o rが遊 離さ れ る も の で，そ の誘 発I F N も ウ イ^{ル ス}誘発の も の と や や異な る性 状を 示 す と さ れ て いる． これ ら 工F N 誘発のから ん だ ウ イ^{ル ス}増 殖 抑制^の 外に，I F N 産 生の関与し な^い干 渉効 果^によ る抑 制機 構 も異 種ウ イ^{ル ス}間^の組 合せで報 告さ れ， 内在 性 干 渉 く^intrinsicinte rfe r e r K eJ^り21と呼ば れ て^tlる が， そ の機構 は分^{っ て い}な^い． この事は生細 胞^に働^いて I F N 産 生が な く て も， 或る種の ウ イル ス に感 染し た細 胞を， 異な る ウ イル ス の増殖 抑 制に導く場 合も あ る^こと を 示 し^て いる．

著 者は， これ ま で口腔内分離嫌 気 性 菌^の産 生す る癌 細 胞 傷 害活 性 物 質をc e11 inj^{u r}ing r e a ctio nくC I Rl 法^7糊で 検 索し た き た． そ の中で， 癌 細 胞^に対して選択 的傷 害 活 性を有す る 3 菌 株^のひ とつである エd Cわぁ戊Cオgg鋸5 捕 eZ O 1 2 3株の抽 出液は， 2 ^． 3 のウ イル ス に対し て 増殖 抑 制を示 す^こと を見^い出し た． 乳 酸 梓 薗^のあ る株

には， マ ウス接 種 癌 細 胞^の増 殖を抑 制す る im m u n o⁻ adj^{u v a nt}活 性が既に知ら れ て^いる^9l． そこで癌 細 胞へ のど乃 び言わり 直接 作用^によ る増 殖 抑 制能，I F N 誘 発 能か らのウ イ^{ル ス}増 殖 抑 制な どの生 物 活性^の検 討を菌 体 粗 抽 出液 及び そ の部 分 精 製標 品を 用^いて行なっ た の で，

そ の結果に つ いて述^べる．

材 料およ び方法 工． 使用菌 株

口腔 内分 離 嫌 気 性 菌株 合 計1 48 株 中C I R a s s ay で 陽性を 示 し た薗 株か ら， が ん細 胞 選 択 的 傷 害 清性^の比 較 的高く み ら れ た 3菌 株エd Cわゐ戊CggJ描 以 ばg才 0¹2 3 株，

エ戊ごねゐ戊CfgJ祝5 5 戊J古び戊rグ祝ざ L S 株， 爪抑止鋸 転流州 別血路 加耶 K O 3 1⁻3 B 株を用^いた．

II． 培養 方法

被 検 菌 株 は Rogo s a 培 地を 改 良 し た T ^{a m a}i^，

野

Fukuda 培 地くT F 培地l ^川を 用^いて^{S e m}isyn chr o n o u s C ultu r e⁷刷を行^った． 既ち 2 0 mlく中試I にて 3 7⁰Cで24

時 間 培 養し た菌 液0．5ml を 2 0 ml のT F 培 地^に植 薗 し 3 7⁰C，1 2時 間培 養し た^．同 様の操作を 3 回行^った後，

最 終 培 養の定 常 期^の初 期 く培 養2 0 時 間1 に菌 体を集 菌 し D B S で3 回遠心洗 源を行^い菌体を得た^． な お定 常 期 初 期^にお け る菌の発 育量 は， 光電比色 計 くボシュロ

ム スペ ク ト^{ロ ニ} ッ ク ス， 島 津， 東 京ンで O D 5 6 0 m声値 が約1．2 であった．

H L 菌体 抽 出嘩^{の調整と その部分精 製}

1 ^， 粗 抽 出 液の調 整

5，0 0 0xg，1 5 分， 遠 心し て集 菌し た菌 体を， O D が 1 0^．0 にな る よ うにD B S^7糊で再 浮 遊し た． 菌 体 浮 遊 液

5 ml を Br a n s o n

，

s s o nifie rくU．S．Alを 用^い 4^手C，40 w，

5 分の超 音 波 処理 を行った． 破 砕 菌液^{を 6}，0 0 0xg，2 0 分 遠心 後，そ の 上清を さ ら^にミ リ ポ アフ ィ ルタ^ーく0 ^．4 5 j^L， M i11i_po r e Co．1 で濾 過し た も の を粗 抽 出液と し

Lo w ry らの方 法^川で蛋白 濃 度を測 定し た^． L． c a s ei

O12 3，L^．s aliv a riu s L S，F n u cle atu m K O 3 1⁻3 B の粗 抽 出液を各々粗 抽 出液L C，L S，K O 31⁻3 B と し た．

2 ^． 粗 抽 出液^の部 分 精製 くfa，fb，fc画 分^の調 整ン 粗 抽 出 液の中， L C は さ らに硫 酸アン モ ^ニ ウム く硫 安う を 5 0％ 飽 和にな る様に加え， 4⁰C，

一 晩 放 置後 6，0 0 0^xg^， 2 0分 速心 し て沈 遼を葉め た． こ の沈 埴を硫 安 塩 析 時と同 量^のD B S に再 浮 遊し， D B S に対し て 4^qC， 9 6 時 間透 析し た^{． こ}の蛋 白 液く4^．7^へ2 0 m gノmり の 2 ^へ 5 ml を Sephade x G ⁻2 0 0 け アル マシア社， ス

ウェ ^ー デンう^でカ ラムクロ マ ト グ ラフ ィ ^ー を行^った．

Sephade x は 1 7 ^X8 6 0m m のカ ラムで，

一 画 分は10 0

dr opsく約2^．O mll と し 4 mlノ5分で約⁷0画分を集め た^． 同 ^一カ ラムを 用^い， 同^一条 件下 で 正常^ヒト血 清 分 画 を行^い， 各 画分^の分子 量 を推 定し た^．

3 ^． S D S⁻ポ リ ア ク リ^ル アミ ド ゲ^ル電 気泳動 法 くS D S⁻P A G El

各 画 分の分子量を知る た めに， bo vin e s e r u m al b⁻

u min くB S Al， O V O albu mu n くOvン を^{マ ー} カ ^ー と して S D S⁻ポ リ ア ク リ^ルア^ミド ゲ^ル 電 気 泳 動 法くS D S⁻ P A G Elを常 法^{1 2Iに}従^い行^った． 蛋白 染 色は ク^マ シプ リ

リ ア^ント ブ^{ル ー} R⁻2 5 0くC B Bl を 用^いた．

王V ^． 使用 培養 細 胞と ウ イ^{ル ス}及 び関連活性 物 質^の測 定

1． 使用継 代株 化細 胞と培 養 法

Int⁻4 0 7^{1引1 41}く^ヒト胎 児 小 腸 由来 細 胞l， eL 細 胞^川く^ヒ

With 2％^{o r 5}％^{c alf s e r u m} 三H B V

， hep^atitis B vi_{r u s三}H BsA_g， hep^atitis B vir u s s u rfa c e a nti_ge n3I F N _，inte rfe r o ni K O 31⁻3 B ， n iS Oba cte riu m n u cle atu m K O 31⁻3 B _ニL C， La cioba cillu s C a S ei _J L S， La ctoba cilhL S S aliv ariu sJ O D ， Op tic al de n si_{t y ニ}O v， O V Oal bu min三P F U， plaq^{u e}

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