博士論文審査報告書

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博士論文審査報告書

論 文 題 目

F u n c t i o n a l A n a l y s i s o f

C o l l a p s i n R e s p o n s e M e d i a t o r P r o t e i n s i n D e n d r i t i c D e v e l o p m e n t

o f H i p p o c a m p a l N e u r o n s

海馬神経細胞の樹状突起発達における CRMP の機能解析

申 請 者

Emi Niisato 新里 絵美

生命医科学専攻 分子神経科学研究

２ ０ １ ２ 年 ２ 月

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脳 が 正 常 に 機 能 す る に は 脳 内 の 神 経 回 路 が 正 し く 形 成 さ れ る 必 要 が あ り 、 様 々 な 遺 伝 子 の 働 き が 必 要 と な る 。 こ れ ら の 遺 伝 子 の コ ー ド す る タ ン パ ク 質 が 神 経 回 路 形 成 の 様 々 な 過 程 で ど の よ う な 特 異 的 な 機 能 を 担 っ て い る か を 明 ら か に す る こ と は 、 神 経 回 路 形 成 の 分 子 メ カ ニ ズ ム を 理 解 す る 上 で 重 要 で あ る 。 神 経 細 胞 は そ の 細 胞 体 よ り 伸 び る 軸 索 と 樹 状 突 起 と 呼 ば れ る 構 造 が 特 徴 的 で あ り 、 神 経 細 胞 が 電 気 的 に 興 奮 し 、 そ の 興 奮 が 軸 索 を 伝 搬 し て 終 末 に あ る シ ナ プ ス 前 膜 か ら 神 経 伝 達 物 質 が 放 出 さ れ る 。 放 出 さ れ た 神 経 伝 達 物 質 が 次 の 神 経 細 胞 の 樹 状 突 起 上 に あ る シ ナ プ ス 後 膜 に 存 在 す る 受 容 体 に 結 合 す る こ と で 、 次 の 神 経 細 胞 に 興 奮 が 伝 わ り 、 情 報 の 流 れ が 起 き る 。 従 っ て 、 神 経 細 胞 の 出 力 が 軸 索 を 介 し て 行 わ れ 、 樹 状 突 起 が そ れ を 受 け 取 る 入 力 側 に な っ て い る と い え る 。 こ の よ う な 非 対 称 性 が 神 経 細 胞 の 形 態 的 、 機 能 的 特 徴 で あ る 。 神 経 回 路 形 成 は こ の 軸 索 と 樹 状 突 起 の 形 成 と そ の 間 の シ ナ プ ス 形 成 が 重 要 で あ り 、 軸 索 が ど の よ う な 経 路 を 取 り 、 ど の 神 経 細 胞 と シ ナ プ ス を 形 成 す る か 、 そ の 選 択 が ど の よ う に し て な さ れ る の か 、 発 生 神 経 生 物 学 の 大 き な 解 決 す べ き 課 題 で あ っ た 。 前 者 は 軸 索 ガ イ ダ ン ス と 呼 ば れ 、 そ の 制 御 に 関 わ る 代 表 的 な も の と し て セ マ フ ォ リ ン が 挙 げ ら れ る 。 軸 索 の 先 端 に は ガ イ ダ ン ス 分 子 を 感 知 す る 受 容 体 が 存 在 し 、 例 え ば セ マ フ ォ リ ン に 対 し て は 、 そ れ を 避 け る （r e p u l s i v e と 呼 ば れ る ） 反 応 を 示 す 。 正 し い 軸 索 の 伸 長 や シ ナ プ ス 形 成 が 必 要 で あ る の と 同 時 に 、 情 報 を 受 け 取 る 側 の 樹 状 突 起 の 発 達 も 正 常 に な さ れ る 必 要 が あ る が 、 軸 索 形 成 や シ ナ プ ス 形 成 の 研 究 が 盛 ん に な さ れ 、 そ の 分 子 メ カ ニ ズ ム に 関 す る 知 見 が 蓄 積 さ れ て き て い る の に 対 し て 、 樹 状 突 起 形 成 に 関 し て は ま だ 十 分 か 検 討 が 行 わ れ て お ら ず 、 そ の 形 成 過 程 に 関 与 す る 分 子 の 同 定 や 機 能 解 析 は 未 解 明 な 部 分 が 多 い 。

本 研 究 で は 、C o l l a p s i n r e s p o n s e m e d i a t o r p r o t e i n ( C R M P )と い う タ ン パ ク 質 に 着 目 し て 研 究 を 進 め て い る 。C o l l a p s i n と い う の は ニ ワ ト リ の セ マ フ ォ リ ン 相 同 物 質 で あ り 、C R M P は セ マ フ ォ リ ン の 反 応 を 細 胞 内 に 伝 達 す る も の と し て 同 定 さ れ 、 そ の 後 に ５ つ の 別 の 遺 伝 子 で コ ー ド さ れ る 相 同 性 の 高 い C R M P 1 - 5 の フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 が 存 在 す る こ と が 明 ら か に さ れ た も の で あ る 。こ の う ち C R M P 2 に 関 し て は セ マ フ ォ リ ン ３A（ 以 下 S e m a 3 A）の 反 応 を 伝 え 、 r e p u l s i v e な 反 応 を 引 き 起 こ す の に 必 要 で 、 そ の 過 程 で 起 こ る C d k 5 / p 3 5に よ る S e r 5 2 2 の リ ン 酸 化 が 重 要 で あ る こ と が 先 行 研 究 で 示 さ れ て い る 。本 研 究 で は こ の S e r 5 2 2 を A l a に 置 換 し た C R M P 2 K I マ ウ ス と 、C R M P 2 と 機 能 的 に 類 似 し て い る と 考 え ら れ る C R M P 4 の ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 解 析 し て 、C R M P 2 の リ ン 酸 化 と C R M P 4 の 機 能 が 樹 状 突 起 形 成 に ど の よ う に 関 わ っ て い る か を 解 析 し て い る 。

第 １ 章 で は 本 研 究 の 背 景 に つ い て ま と め て お り 、 研 究 の 目 的 を 明 確 に 示 し て い る 。S e m a 3 A は も と も と 軸 索 に 対 し て r e p u l s i v e に 働 き 、 退 縮 さ せ る 反 応 を 引 き 起 こ す が 、 樹 状 突 起 に 対 し て は 反 対 に 伸 長 さ せ る 働 き は あ る こ と が 判 っ て い る が 、S e m a 3 A や C d k 5 の 活 性 化 サ ブ ユ ニ ッ ト p 3 5 の 欠 損 マ ウ ス で

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樹 状 突 起 の 形 態 学 的 異 常 が 報 告 さ れ た こ と か ら 、海 馬 の C A 1 と 呼 ば れ る 部 位 の 神 経 細 胞 の 樹 状 突 起 に 着 目 し た 点 を 挙 げ 、C R M P 2 K I , C R M P 4 K O マ ウ ス で の 解 析 の 意 義 を 明 確 に 述 べ て い る 。

第 ２ 章 は 、 本 研 究 で 用 い て い る 実 験 手 法 に つ い て 解 説 し 、 新 た に 開 発 さ れ

た C R M P 4 K O マ ウ ス の 作 成 に 関 し て 詳 し く 述 べ て い る 。ま た 、神 経 細 胞 の 形

態 を 詳 し く 観 察 す る た め の ツ ー ル と し て G F P - M マ ウ ス を 利 用 し て い る が 、 こ の 点 は 解 析 を 容 易 に し 、 効 率 よ く 研 究 を 進 展 さ せ る も の で 、 評 価 さ れ る 。 ま た 、 神 経 細 胞 の 培 養 法 や S e m a 3 A の 添 加 実 験 、 さ ら に 神 経 細 胞 の 形 態 観 察 の た め の 免 疫 染 色 と 画 像 解 析 ソ フ ト を 組 み 合 わ せ て 、 研 究 を 進 め て い る こ と が 記 載 さ れ て い る 。

第 ３ 章 が 最 初 の 実 験 結 果 を 記 載 し た 章 で あ り 、 先 ず C R M P 2 , C R M P 4 ま た そ れ ぞ れ の リ ン 酸 化 に つ い て 、 脳 形 成 期 の マ ウ ス 海 馬 組 織 、 及 び 培 養 海 馬 神 経 細 の 胞 免 疫 染 色 の 結 果 を 示 し て い る 。先 行 研 究 で C R M P 各 フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 の 脳 内 で の 発 現 パ タ ー ン の 報 告 や 、C R M P 2 , C R M P 4 の 培 養 神 経 細 胞 で の 局 在 を 検 討 し た 報 告 は あ る も の の 、S e r 5 2 2 の リ ン 酸 化 に つ い て 検 討 し 、 明 確 な 結 果 を 示 し て い る 点 で 新 規 の 知 見 と し て 評 価 で き る 。

第 ４ 章 は 、C R M P 2 K I , C R M P 4 K O マ ウ ス の 表 現 型 解 析 を 樹 状 突 起 形 成 に 着 目 し 、S e m a 3 A K O , p 3 5 K O マ ウ ス に お い て 認 め ら れ た 異 常 に つ い て 検 討 を 行 な っ て い る 。 特 に 両 者 の 機 能 的 代 償 性 を 考 慮 し て 、C R M P 2 K I ; C R M P 4 K O の 作 成 を 行 な い 、C R M P 2 K I で は 認 め ら れ ず 、C R M P 4 K O で 認 め ら れ た 異 常 が C R M P 2 K I ; C R M P 4 K O で さ ら に 増 強 し て い る こ と か ら 、C R M P 2 の S e r 5 2 2 の リ ン 酸 化 と C R M P 4 が 正 常 な 海 馬 C A 1 神 経 細 胞 の 樹 状 突 起 形 成 が 必 要 で あ り 、 そ の 機 能 は 相 互 に 代 償 的 で あ る こ と が 示 さ れ て い る 。 こ う し た 知 見 は こ れ ま で に な い 新 規 な も の で 、 個 体 レ ベ ル で 遺 伝 子 機 能 を 解 析 し て お り 、 評 価 さ れ る も の と 考 え る 。

第 ５ 章 で は 、 こ れ ら の 変 異 マ ウ ス 海 馬 由 来 の 初 代 神 経 細 胞 の 培 養 系 で の 解 析 結 果 に つ い て 述 べ て い る 。 こ れ ら の 変 異 マ ウ ス 由 来 の 神 経 細 胞 で は 野 生 型 に 比 べ て 樹 状 突 起 の 分 岐 が 増 加 し て い る こ と か ら 、C R M P 2 , C R M P 4 が 正 常 で は 樹 状 突 起 の 分 岐 を 抑 制 し て お り 、変 異 マ ウ ス に 見 ら れ た 海 馬 C A 1 の 神 経 細 胞 の 樹 状 突 起 の 形 態 異 常 も こ の 分 岐 抑 制 の 障 害 に よ る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 こ の よ う な 変 異 マ ウ ス 由 来 の 解 析 に 加 え て 、s h R N A を 用 い て 、C R M P 4 の 機 能 を ノ ッ ク ダ ウ ン さ せ た 場 合 の 解 析 も 行 な い 、 同 様 に 樹 状 突 起 の 分 岐 増 加 を 示 し て い る 点 は 、 異 な る 複 数 の 手 法 を 用 い て 検 証 し て い る 点 で 評 価 出 来 る 。 ま た S e m a 3 A は 軸 索 に 対 し て 退 縮 効 果 が あ る の に 対 し て 、樹 状 突 起 に 対 し て は 伸 長 効 果 が あ り 、 分 岐 を 増 加 さ せ る 。 こ の 反 応 を 変 異 マ ウ ス 由 来 の 神 経 細 胞 で 解 析 し て い る 。S e m a 3 A の 下 流 で 機 能 し て い る と す る と こ の 伸 長 反 応 、 分 岐 促 進 反 応 が 見 ら れ な い こ と が 予 想 さ れ る 。 こ う し た 予 想 の 通 り 、S e m a 3 A に よ る 分 岐 の 増 加 が 認 め ら れ ず 、C R M P 2 K I ; C R M P 4 K O で は 反 応 が 逆 転 し 、 む し ろ 分 岐 が 減 少 し て い る こ と が 示 さ れ た 。 こ の よ う に 、 遺 伝 子 改 変 マ ウ ス

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で 認 め ら れ た 表 現 型 を さ ら に こ れ ら の マ ウ ス 由 来 の 神 経 細 胞 に つ い て 、 S e m a 3 A に つ い て の 反 応 性 を 検 討 し 、 そ の 反 応 性 を 検 討 し て い る 点 で 評 価 さ れ る 。 ま た 、 得 ら れ た 結 果 は 、C R M P 2 , C R M P 4 が S e m a 3 A の 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 を 担 っ て い る こ と を 示 唆 す る 結 果 で あ り 、 発 生 神 経 生 物 学 の 分 野 で も 新 た な 知 見 と し て 評 価 さ れ る も の で あ る 。 特 に 遺 伝 子 改 変 マ ウ ス を 用 い て い る こ と か ら 、 阻 害 剤 な ど の 特 異 性 が 問 題 に な る 実 験 系 と は 異 な り 、 遺 伝 子 機 能 と 神 経 発 達 現 象 を 明 確 に 結 び 付 け る も の で あ る 。

第 ６ 章 で は 以 上 の 実 験 結 果 を ま と め 、 先 行 研 究 な ど と の 関 連 を 踏 ま え て 考 察 し て い る 。S e m a 3 A の 欠 損 マ ウ ス で は 皮 質 神 経 細 胞 の 樹 状 突 起 の 分 岐 は む し ろ 減 少 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 こ の こ と は 、S e m a 3 A が 樹 状 突 起 の 伸 長 促 進 作 用 が あ る こ と を 考 え る と 理 解 し や す い が 、S e m a 3 A の シ グ ナ ル を 伝 達 す る と 考 え ら れ る C R M P の 変 異 マ ウ ス 由 来 の 神 経 細 胞 の 樹 状 突 起 の 分 岐 が 増 加 し て い る こ と を 今 回 の 結 果 は 示 し て い る 。 こ の こ と は 、C R M P の 機 能 を 制 御 し て い る 因 子 が 別 に 存 在 し て い る 可 能 性 を 示 唆 し て お り 、N T- 3、 B D N F と い っ た 神 経 栄 養 因 子 で あ る 可 能 性 を 議 論 し て い る 。 ま た 、C R M P の 下 流 で 機 能 す る 細 胞 骨 格 タ ン パ ク 質 に つ い て 、 微 小 管 と の 結 合 実 験 を 踏 ま え て 考 察 し た 。

第 ７ 章 で 今 後 の 研 究 の 進 展 に つ い て 議 論 し て い る 。 今 後 明 ら か に す べ き 点 と し て 、 樹 状 突 起 の 分 岐 が 早 期 に 起 き る こ と の 機 能 的 違 い な ど に つ い て 、 電 気 生 理 学 的 な 検 討 が 必 要 で あ り 、そ の た め に は 海 馬 ス ラ イ ス を 用 い た LT P の 野 生 型 と の 比 較 が 必 要 で あ る な ど 具 体 的 に 示 し て い る 。

以 上 の 博 士 論 文 に ま と め ら れ た 内 容 は 、 遺 伝 子 改 変 マ ウ ス を 用 い て 、 遺 伝 子 機 能 を 明 ら か に し 、 マ ウ ス の 解 析 に と ど ま ら ず 、 マ ウ ス 由 来 の 神 経 細 胞 を も ち い た メ カ ニ ズ ム の 解 明 を 試 み た 実 験 結 果 を 含 む も の で 、 こ れ ま で 明 ら か に な っ て い な か っ た 代 表 的 軸 索 ガ イ ダ ン ス 分 子 で あ る S e m a 3 Aの 樹 状 突 起 伸 長 、 分 岐 促 進 作 用 に つ い て そ の 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 の 仕 組 み の 一 端 を 明 ら か に し た 点 で 、 評 価 で き る オ リ ジ ナ リ テ ィ ー の あ る 研 究 で あ る 。

よ っ て 、 本 論 文 は 、 博 士 （ 理 学 ） に 相 応 し い と 評 価 し た 。

２ ０ １ ２ 年 ２ 月

審 査 員 （ 主 査 ） 早 稲 田 大 学 教 授 医 学 博 士 （ 山 梨 医 科 大 学 ） 大 島 登 志 男 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 医 学 ） 大 阪 大 学 井 上 貴 文

早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 医 学 ） 横 浜 市 立 大 学 南 沢 享