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Title
象牙芽細胞系細胞(odontoblast lineage cells) に対す
るeugenolの作用
Author(s)
佐藤, 正樹
Journal
東京歯科大学教養系研究紀要, 32(): 1-10
URL
http://doi.org/10.15041/tdckiyou.32.1
Right
Description
象牙芽細胞系細胞 (odontoblast lineage cells) に対する
eugenol の作用
佐藤正樹*要旨
Eugenol は歯髄鎮静・鎮痛薬として歯科治療に用いられているが、その生理 作用に関する知見は少ない。本研究は象牙芽細胞のモデルとしてマウス由来 象牙芽細胞系細胞 (odontoblast lineage cells, OLC) を用い、eugenol の作用を細 胞内 Ca2+濃度 ([Ca2+]i) の変化を指標として検索した。Eugenol は濃度依存的
に OLC の[Ca2+]
iを増加させたが、細胞外 Ca2+の除去によりこの応答は消失し
た。Eugenol による[Ca2+]
i増加は、transient receptor potential (TRP) チャネルの
一つである TRPV1 の antagonist、capsazepine によって抑制された。また高濃 度 eugenol の連続投与は、一過的な[Ca2+] iの増加の後、脱感作を誘導した。 Eugenol は象牙芽細胞に発現する TRPV1 を活性化して[Ca2+] iを増加させるが、 長期的な投与は TRPV1 を脱感作する。 キーワード Eugenol、象牙芽細胞、歯内治療薬、TRPV1、カルシウムイオン * 東京歯科大学 生物学研究室
序論
Eugenol はクローブ (Syzygium aromaticum)、ローリエ (Laurus nobilis)、シナ モン (Cinnamomum verum)、バナナ (Musa spp) 等に含有される無色から淡黄 色の油状液体である。その用途は香辛料、精油の他に殺菌剤や麻酔薬などの 医薬品にも用いられる (Pramod et al., 2010; Kamatou et al., 2012)。中でも歯科 治療薬としての歴史は長く、う蝕治療薬の起源は紀元前までさかのぼり、鎮 痛・鎮静剤として現在でも使用されている。Eugenol は分子構造にフェノール 基を持ち、カンフル、グアヤコールと同様にフェノール製剤に位置付けられ ている (Fujisawa et al., 2002)。Eugenol は歯髄鎮痛、鎮静作用と消毒作用を持 ち、酸化亜鉛 eugenol として、仮封・直接履髄剤・間接履髄剤としても用いら れる (Dammaschke, 2008)。窩洞充填後の酸化亜鉛 eugenol 濃度は、12 時間後 にはセメント-象牙質境界部で 10 mM、歯髄近傍象牙質では 0.1 mM に達し、 痛みや炎症に関するメッセンジャーであるプロスタグランジン合成酵素を阻 害することがラットの歯髄炎モデルにおいて報告されている (Thompson and Eling, 1989; SS Kim et al., 2003)。またヒトやマウスの上皮組織の発現する transient receptor potential (TRP) チ ャネ ルの サブフ ァミ リ ーの一 つ である TRPV3 は、eugenol と同じフェノール製剤のチモールやカルバクロールによっ て活性化し、細胞内 Ca2+を増加することが報告されている (Borbíró et al., 2011; Xu et al., 2006)。 象牙芽細胞は象牙質を形成する細胞である。歯髄最外層に位置し、その細 胞突起を象牙細管内へ入れている (Gysi, 1900; Brännström, 1986)。象牙質表面 への様々な刺激 (温度、浸透圧、化学物質、機械刺激など) は、象牙細管内溶 液の移動を生じ、象牙質痛を誘発する。一方でこれらの刺激は第三象牙質 (反 応性象牙質) を形成する (Aguiar and Arana-Chavez, 2010)。近年、熱・冷、機 械、浸透圧刺激などの侵害刺激を受容する TRP チャネルの発現がラット、マ ウスの象牙芽細胞で示されている (Okumura et al., 2005; Son et al., 2009; Tsumura et al., 2012)。そこで我々は継代培養された象牙芽細胞に発現する TRP チャネルへの eugenol の薬理学的、生体物理学的作用を検討した。
方法
培養細胞
実験には継代培養されたマウス由来象牙芽細胞系細胞 (mouse odontoblast lineage cells, OLC) を用いた。OLC は直径 35 mm の plastic dish (CORNING) に 播種し、10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin and 1% fungizone を 含むα-modified eagle medium (Invitrogen) 中で、2 日間培養した (38 °C, 5% CO2)。
OLC は鹿児島大学歯学部の徳田雅行教授よりいただいた。 細胞外液
標準細胞外液には Tyrode 液 (mM: 135 NaCl, 5 KCl, 2.5 CaCl2, 1 MgCl2, 1
NaH2PO4, 5 HEPES and 10 glucose, pH7.4, 310 mOsm/L) を用いた。Ca2+ free 溶
液は標準細胞外液から CaCl2を除去して作成した。
試薬
全ての試薬は dimethyl sulfoxide に溶解後、標準細胞外液にて希釈して投与 した。Eugenol (和光純薬) は 10 M 溶液を作成し、1 nM - 10 mM を投与した。 TRPV1 チャネルの antagonist は capsazepine (Sigma Aldrich) を用いた。Eugenol と TRPV1 チャネルの agonist である capsaicin の構造式を示す (Fig. 1)。
カルシウムイメージング法
OLC の生理活性は、細胞内 Ca2+濃度 ([Ca2+]
i) の変化を指標とした。細胞内
Ca2+はカルシウム蛍光プローブ Fura-2/AM (同仁化学) を用いて可視化した。
Fura-2/AM と F-127 pururonic acid (Invitrogen) は標準細胞外液もしくは Ca2+
free 溶液に溶解して 10 μM に調整し、OLC を浸漬して 60 分間培養した。340 nm と 380 nm の二波長励起による Fura-2/AM の蛍光比を蛍光顕微鏡 (Olympus, XI70) と計測システム (浜松ホトニクス, Aquacosmos) を用いて記録した。
統計解析
結果は平均 ± 標準誤差で示した。One-way ANOVA、paired-t 検定と多重検 定法の dunnett 検定を解析ソフト (OriginLab, Origin 8.6) で行い、危険率 5%以 下を有意差とした。
結果
2.5 mM 細胞外 Ca2+存在下で OLC に eugenol (10 nM - 10 mM) を投与すると、 細胞内遊離 Ca2+は濃度依存性に増加した (Fig. 2A)。この増加は 1 mM 以上の 細胞外 eugenol 濃度で観察された (Fig. 2B)。 この eugenol (1 mM) 誘発性の[Ca2+] i増加は、細胞外液から Ca2+を除去 (0 mM [Ca2+] i) することで消失したことから、eugenol は細胞外からの Ca2+流入を誘 発することが示された (Fig. 3)。Eugenol によって活性化される細胞外 Ca2+流 入経路を検討するため、TRPV1 チャネルの antagonist である 1 μM capsazepine の効果を検討した。象牙芽細胞の細胞膜には TRPV1 チャネルの発現が報告さ れている (Okumura et al., 2005; Son et al., 2009; Tsumura et al., 2012)。細胞外 Ca2+存在下 (2.5 mM) で、OLC に eugenol (1 mM) を投与すると、[Ca2+]
iが増加し
た (Fig. 4A)。この増加は 1 μM capsazepine によって可逆的に有意に抑制され た (Fig. 4)。TRPV1 チャネルは繰り返しの agonist 投与で脱感作することが知 られている。そこで OLC に同一濃度の eugenol の連続 3 回投与を 120 秒間隔 で行った (Fig. 5)。1 mM eugenol の連続投与では、Ca2+流入の有意な脱感作現
象はみられなかった。しかし 5 mM または 10 mM eugenol を連続投与すると、 象牙芽細胞への Ca2+流入は、2 回目の eugenol 投与で感作現象を示し、増加し
た (コントロールより 129.8 ± 6.7% (5 mM), 183 ± 4.2% (10 mM) 増加)。3 回目 の eugenol 投与は、Ca2+流入の強い脱感作を示し、[Ca2+]
iは有意に低下した (コ
考察
OLC には、象牙芽細胞特異的タンパク質である bone matrix protein-1, dentin sialoprotein が発現していることから (Arany et al., 2006)、OLC は象牙芽細胞芽 の特徴を維持している。今回の研究で、我々は eugenol が象牙芽細胞の capsazepine 感受性 Ca2+流入を活性化することを示した。加えて eugenol の連
続投与は、Ca2+流入を高めた後に、脱感作させることが示された。象牙芽細胞
は TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPM8, TRPA1 を発現している (Okumura et al., 2005; Son et al., 2009; Tsumura et al., 2012)。象牙芽細胞への薬理学的 (ligand 刺 激)、生体物理 (細胞膜伸展と変形) 学的刺激は、TRPV1, TRPV2, TRPV4 チャ ネルの開口を誘発する (Shibukawa et al., 2015; Sato et al., 2018)。これらのチャ ネル活性により流入した Ca2+は[Ca2+] iを増加させ、一方で細胞膜上にある Na+ -Ca2+交 換 体 (NCX) に よ っ て 細 胞 外 へ 排 出 さ れ る (Tsumura et al., 2010; Tsumura et al., 2012)。NCX は象牙質形成部位 (象牙質石灰化前線) である象牙 芽細胞遠心部に多く局在している (Tsumura et al., 2012)。象牙芽細胞刺激は TRPV チャネルの活性化を生じ、NCX と機能的にカップリングすることで、 刺激誘発性の象牙質形成 (反応性象牙質形成) に関わると考えられている
(Linde and Lundgren, 1995; Tsumura et al., 2012)。今回 eugenol の繰り返し刺激は TRPV1-capsazepine 感受性 Ca2+流入を活性化したが、その後脱感作を生じた。 これらの結果は、eugenol による反応性象牙質形成の低さを示しているのかも しれない (Murray et al., 2000)。一方で、露出した象牙質表面への様々な刺激 は、象牙細管内溶液の外向き移動を誘発し、象牙質痛を誘導する (Charoenlarp et al., 2007)。Eugenol の窩洞形成や齲蝕に伴う象牙質表面の貼布は、象牙質痛、 歯髄痛の鎮痛効果がある。象牙質に加わる刺激は、象牙細管内に軸索を侵入 させた三叉神経節細胞で受容されることが報告されている (Li et al., 2007; Li et al., 2008)。一方で、近年象牙芽細胞が象牙質刺激に伴う象牙細管内溶液移動 を感知する感覚受容細胞であるとする考え方がある。象牙芽細胞への機械刺 激は伝達物質の放出を活性化し、歯髄に分布する神経の脱分極を誘発するこ とで、感覚情報が伝達される (Shibukawa et al., 私信)。従って eugenol が象牙 芽細胞の TRPV1 を介した一過性 Ca2+流入の感作の後に脱感作を起こすこと で、感覚受容細胞としての機械刺激に対する閾値が上昇し、eugenol の鎮痛作 用が生じるのかもしれない。しかしながら、象牙芽細胞への繰り返し細胞膜 伸展刺激は、感作も脱感作も生じないことが報告されている (Shibukawa et al., 2015; Sato et al., 2018)。このことは、象牙質痛の感覚受容細胞である象牙芽細 胞の TRPV1 チャネルは、順応性を示さないことを示している。Eugenol は化 学的な ligand として本細胞の TRPV1 チャネルに作用し、脱感作機構によって 象牙芽細胞の感覚受容細胞としての刺激感受性を調節しているのかもしれな い。加えて、これらの結果は eugenol の作用が疼痛性鎮痛を示している可能性 がある。
謝辞
本研究は JSPS 科研費 24792035 (若手 B) の助成を受けたものである。参考文献
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