重油生分解能の高い微生物群集の確立と生態機能解析
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(2) (和文題目). 重油生分解能の高い微生物群集の確立と生態機能解析. 近畿大学大学院 農学研究科応用生命化学専攻 尾 崎 信 源 (主査:藤田藤樹夫教授). (英文題目). StudiesontheI s o l a t i o nandE c o l o g i c a lFunctions o fMicrobialConsortiaa b l et oDegrade CrudePetroleuma tHighRates ShingenOzaki. 乱 1 :arch，2007. GraduateSchool，KinkiUniversity D i v i s i o no fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e Major:AppliedB i o s c i e n c e ( A d v i s o r : P r o f .TokioF u j i t a ) Submittedt otheGraduates c h o o l，KinkiUniversity ，t of u l f i l ltherequirement f o rtheDoctorateDegree..
(3) 目次 緒論 第一章. 1. 重油分解能の高い微生物群集 K -3の確立と群集解析. 2 . 実験材料および実験方法. 4 . まとめ. tiQA. 3 . 実験結果および考察. 5656. 1.緒言. 第二章 芳香族炭化水素画分分解能の高い微生物群集 N o . 2 2の確立と炭素源の 変化に伴う優勢種の変動. U. 4 . まとめ. ハU Q 0 1 i. 3 . 実験結果および考察. QU. 2 . 実験材料および実験方法. o h︼ 円 。 円 。 氏. 1.緒言. 第三章 N o . 2 2群単離菌の混合培養による群集の再構築と芳香族炭化水素分解 における非分解菌の群集肉での役割 氏U P O Q U. 2 . 実験材料および実験方法 3 . 実験結果および考察. 門4. 4 . まとめ. 3475. 1.緒言. 総合考察. 76. 参考文献. 81. SUMMARY. 94. 謝辞.
(4) 緒論 遺伝子組換えやメタボリックエンジニアリングなどの手法を用いて、微 生物の酵素生産量や酵素活性を高め、低コスト・高収率で有用物質を生産 する方法が確立されてきた. この手法は閉鎖系で単一種の微生物を純粋培. 養するのに適した方法である。一方、個々の微生物の能力は飛び抜けて高 くなくても、異なった能力をもっ微生物が集まって形成された群集は、単 一種の微生物より大きな能力を安定して発揮することができる. O. とくに開. 放系で使用するとき、この微生物群集が大きな役割を果たす。 たとえば、味噌、酒、黒酢などの伝統的発酵食品の製造や生ゴミのコン ポスト化、活性汚泥法による下水の浄化、メタン発酵などでは、特定の微 生物を単離することなく、その環境に生息する多数の微生物を利用し、分 解や発酵過程は群集中の優勢種が変動しながら機能的に進行すると考え られている. 1，2 )。このように風味を求める発酵食品の製造や多様な物質、. 難分解性物質の分解には、多種類の微生物が共存する微生物群集を利用す るのが有用であると考えられる。 しかし、発酵や分解処理過程に関わる微生物群集の詳細な役割は、ほと んど解明されていない。そこで群集を構成する多様な微生物の相互関係や 群集が高度な機能を有する原因を明らかにできれば、これまでの経験と勘 に頼って群集を維持してきたやり方から、群集を科学的に制御し、より効 率的に機能する構成種を明らかにすることができる。群集の有効活用は、 今後の微生物の利用分野に大きく寄与できると期待している。. 本 研 究 で は 、 流 出 し た 重 油 を 効 率 よ く 安 定 し て 分 解 で き る 2種 類 の 微 生 物群集を自然界から確立するとともに、構成種の同定、群集から微生物の 単離、炭素源が変化したときの優勢種の変動、単離菌が群集内で果たす役 割を解明した。 重油は多種類の炭化水素から構成され、シリカゲルカラムクロマトグラ フィーで分画すると、飽和炭化水素画分(飽和画分)、芳香族炭化水素画分. 1.
(5) (芳香族画分)、レジン画分、そしてアスファルテン画分の 4つに分画する ことができる. 3 )。 重 油 の 約. 8 " ' 9害J Iは 飽 和 画 分 と 芳 香 族 画 分 で 、 特 に 芳 香. 族画分は難分解性物質を多く含んでいる. 4 )。 そ の た め タ ン カ 一 座 礁 事 故 な. どにより海洋へ重油が流出したり、工場や貯油タンクなどから重油が漏出 して土壌や地下水を汚染すると、その被害は大きく、今後の環境修復の課 題として安全で安価な処理技術の開発が求められている。 汚 染 重 油 の 処 理 方 法 の 1っとして、化学薬品で中和する方法があるが、 この方法は散布した化学薬品で二次汚染を引き起こす危険性が指摘され ている。そこで注目されているのが、微生物による環境修復(バイオレメ. i o r e m e d i at i o n )技術で、ある。バイオレメディエーション ディエーション b とは、微生物、植物、動物などがもっ生物機能を活用して、汚染された環 境を修復する技術である。 重油分解菌に関する研究は幅広く行われていて、重油中の多種類の成分 を分解する多様な微生物が自然界に存在していることが明らかにされて きた. 540. しかし、分離された重油分解微生物は、一部の重油成分を分解. できるだけで、分解能力が限定されていることもわかってきた. 9 )。現在で. は、単一種の微生物で重油を分解して浄化することは難しいという認識が 広く受け入れられるようになってきた。 つまり、重油分解に関わる様々な能力をもった複数の微生物で構成され た群集が、異なる能力を効率よく発揮できる環境下で、重油を分解させる ことが求められている. 10)。 た と え ば 、 界 面 活 性 物 質 を 生 産 す る 微 生 物 が. 重油成分を乳化分散させることによって、別の種が重油成分を生分解しや すくするとか、ある種が生分解できない代謝中間体を、別の微生物種が分 解するといった関係が考えられる。さらに、微生物群集は混入してきた他 菌に対して、機能的に抵抗性を示すことが期待できるので、流出重油の実 用的な処理に適していると考えられる。 しかし、重油を効率よく分解する微生物群集を確立したという報告は極 めて少なく、さらに群集内での構成微生物の役割を明らかにした報告はま だない。これは、群集を構成する難培養性微生物の存在が、群集の解析を. 2.
(6) 困 難 に し て き た 原 因 の 1つであると考えられる。実際、従来の方法で単離、 培 養 で き る 微 生 物 は 自 然 界 に 生 息 す る 微 生 物 の 1%に し か 満 た な い と 言 わ れている. 11)。自然界の環境条件を研究室で再現できないことや、微生物間. の相互作用、増殖速度など、解明されていないことが多すぎるからである. O. しかし近年、分子生物学的手法が発展し、群集の構成微生物を解析でき るようになってきた. 12-14)。 し か も 、 そ の 解 析 方 法 は 目 的 に 応 じ て 多 種 多. 様である。微生物群集の多様性を調べる t e r m i n a l r e s t r i c t i o nfragment. length. polymorphism(T-RFLP) と. denaturing. gradient. g e l. electrophoresis(DGGE)、 相 対 的 な 構 成 菌 種 の 割 合 は ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー や 定 量 リ ア ル タ イ ム PCR、 菌 種 の 数 を 把 握 す る た め に は 蛍 光 標 識 し た プロープを用い顕微鏡で細胞を直接観察する f luorescence i ns i t u. hybridizat i o n(FISH)法 が 挙 げ ら れ る 。 著 者 は こ れ ら の 方 法 を 駆 使 し 、 確 立した 2種類の微生物群集を解析した。. 第 一 章 で は 重 油 を 炭 素 源 と し て 集 積 培 養 を 繰 り 返 し 、 7 日間で重油. ( 1 0 g l l )の飽和画分を 56%、芳香族画分を 46%分 解 で き る 微 生 物 群 集 K-3 を新潟県の油田跡地から確立し、その構成菌種を PCR-DGGE法を用いて 明らかにした。また、 K-3群から構成菌を単離し、 Pseudomonas属 が 飽 和および芳香族画分の分解に積極的に関与していることを明らかにした。 しかし、 K-3群 は 、 重 油 中 の 芳 香 族 画 分 を 分 解 す る と き に 飽 和 画 分 を 要 求した。そのため、分解の容易な飽和画分が速やかに生分解されると、難 分解性の芳香族画分の濃度が相対的に上昇することが容易に予想された。 閉鎖的な培養系では、高濃度の芳香族炭化水素は分解菌に毒性を示して分 解を遅らせると考えられる。芳香族画分を唯一の炭素源として添加した培 地に生育し、芳香族画分を分解できる新たな微生物群集が求められた。 第二章では、重油中の芳香族画分を唯一のエネルギー源・炭素源として 利用できる群集を新たにスクリーニングした。新潟県にある油田から石油 汚染土壌をサンプリングし、芳香族画分をエネルギーおよび炭素源とした 培 地 で 7 日間培養後、生育の認められた集積培養液を新しい培地に継代し、. 3.
(7) これを 20代 繰 り 返 し た 。 そ の 中 か ら 、 安 定 し た 生 育 を 示 し 、 培 養 7 日間. O.22を確立した。 NO.22群 で 芳 香 族 画 分 を 30%分 解 で き る 微 生 物 群 集 N か ら は 構 成 菌 を 3株分離できたが、 PCR-DGGE解析では、 14本の DNA バンドが検出され、 N o.22群 は 多 様 な 菌 種 で 構 成 さ れ て い る こ と を 明 ら か にした。また、芳香族画分添加培地で培養した培養液を、飽和画分をエネ. a gtime ルギーおよび炭素源とする培地で培養すると、飽和画分の分解に l が 出 現 し た 。 こ の と き の 群 集 構 成 を PCR・.DGGE解析すると、 DNAバ ン ドパターンが変動し、優勢種の変動が示唆された。そこで、クローンライ ブ ラ リ ー 法 と 定 量 リ ア ル タ イ ム PCR法 を 用 い て 、 芳 香 族 画 分 と 飽 和 画 分 に変化したときの優勢種の変動を検討した。. O.22群 か ら 単 離 し た 3株 が 、 群 集 内 で 果 た す 役 割 を 検 討 第三章では、 N した。芳香族画分を分解できる Y1 と Y4株 を 、 芳 香 族 画 分 を ほ と ん ど 分 解 で き な い Y3株 と 混 合 培 養 す る と 、 単 独 あ る い は 2株 混 合 培 養 し た と き. O.22群とほぼ同じ値になった。そこ よりも芳香族画分の分解率が上昇し N で Y3株が、群集内で芳香族画分の分解に果たす役割を検討し、 Y3株 が バ イ オ フ ィ ル ム を 形 成 す る こ と 、 形 成 さ れ た バ イ オ フ ィ ル ム に Y1 と Y4 株、さらに水に難溶性の芳香族炭化水素化合物が付着し、ミクロフローラ を 形 成 し て い る こ と を 見 出 し た 。 ま た Y3株は、 Y1 と Y4株 の 芳 香 族 画 分. O.22群 が 群 集 と し の分解を促進する物質を生産していた。このように、 N て優れた機能性を発現できる要因の一部を明らかにした。. 4.
(8) 第一章. -3の 確 立 と 群 集 解 析 重油分解能の高い微生物群集 K 1.緒言 近年、重油中の多様な成分を分解する様々な微生物が報告されてきた 5-8)。 そ の 結 果 、 単 離 し た 微 生 物 が 分 解 で き る 炭 化 水 素 の 範 囲 に 限 度 が あ. ることを明らかにされた. 9 )。 こ の こ と が 、 重 油 の 存 在 す る 環 境 に は 炭 化 水. 素を資化する多様な微生物が生息している背景となっていると推測して いる。さらにこのことは、単一種の微生物を用いて汚染重油を浄化するこ とが極めて難しいことを示唆している。 汚染重油を浄化するためには、自然環境下で形成された重油分解微生物 群集が効率よく働く環境をプラントや実験室などの閉鎖環境内に作るこ とが必要である。そして確立した重油分解微生物群集を維持、保存する方 法を確立して、またリアクターなどで実際に汚染重油を処理できれば、単 独の微生物ではなし得ない速度で重油中の多様な成分を分解できると期 待される。 このような群集では、構成微生物間で適切な協力関係が構築されている。 例えば、ベンズピレン分解の際には、まずベンズピレンを可溶化する微生 物が優勢となり、次いでベンズピレンを分解する微生物が優勢になると報 告されている. 1 5 )。 汚 染 重 油 を 微 生 物 で 効 率 よ く 浄 化 を す る た め に は 、 目. 的とする微生物群集の確立と、群集を維持、保存する技術、または制御す る技術を確立することが必要である。 しかし、これまでに重油分解微生物群集を確立した報告は極めて少ない ため、最初に基礎的な条件や知見を得ることが必要であった。そこで本章 では、重油を高効率で分解できる微生物群集の確立と、確立した群集の分 解特性と構成微生物を明らかにした。. 5.
(9) 2 .実 験 材 料 お よ び 実 験 方 法 2 . 1読料および集積培養 重油分解微生物群の分離試料には、秋田県豊川油田 ( 4 2試料)と黒川油田 ( 2 4 試料)、新潟県東山油田 ( 1 2試料)と西山油田 ( 2 4試料)から採取した原油汚. / l添加した無機塩培地(蒸 染 土 壌 102試料を使用した。試料は、重油を 10g 留水 1000ml あたり、 NH4Cl，2 . 5g ; KH2P04，1 .0 g ; K2HP04，0 . 5g ;. MgS04.7H2 0，0 . 5g ;NaCl，2 . 0g ;ZnCb，0 . 0 1g ;FeS04・5H20，0 . 0 1g ; CaCb，0 . 0 1g，pH7 . 0 )に 接 種 し 集 積 培 養 ( 3 7C， 125stroks/min)した。分 0. 解 基 質 の 重 油 は 関 西 電 力 株 式 会 社 か ら 供 与 い た だ い た C 重油(粘度 550. cSt、比重， 0 . 9 6g/cm3、 硫 黄 含 量 ，2 . 1wt%)を使用した。集積培地には、 菌叢の安定化を図るために多孔質性セラミック ( < p3 m m，Shibata-engei. 0 . 0g / l添 加 し た 。 集 積 培 養 7日後、重油が可溶 L t d .，Tokyo，Japan) を 4 化・分散した培養液を、新しい集積培地に継代培養した。継代培養を繰り 返しても、重油が安定して可溶化・分散した培養液を選抜し、残存してい. l a y e r chromatography/Flame る 重 油 中 の 飽 和 画 分 と 芳 香 族 画 分 を Thini o n i z at i o nd e t e c t o r (TLC/FID) 法 で 定 量 し た 。 一 方 、 安 定 し て 高 い 分 解 率を示した集積培養液は重油分解能の高い微生物群集として選出され、確. ( v / v ) 立 し た 微 生 物 群 集 は 、 継 代 培 養 を 繰 り 返 し て 維 持 す る と と も に 10% グリセロール溶液に懸濁してー 80Cで凍結保存した。 0. 2 . 2 .重 油 の 分 画 重油はシリカゲルカラムで分画した. 16)。使用したカラムは、内径. 1 1cm、. 長さ 100cm、充填容積 7600mlで、充填したシリカゲ、ノレ (WakogelC-200，. Wako，Osaka，Japan)に重油 20gを吸着させた。最初に 6.01の n-ヘ キ サ ンで洗浄後、 8 . 01の n-ヘキサンで飽和画分を、 1 2 . 01の ジ ク ロ ロ メ タ ン で芳香族画分を溶出させた。. . 8g、芳香族画分は 3 . 6g得られた。 TLC/FID 重油 10gから、飽和画分は 4 分析で各画分のピークを確認し、. Gas chromatographymass 輔. spectroscopy (GC-MS)分 析 で そ れ ぞ れ の 画 分 に 飽 和 炭 化 水 素 や 芳 香 族 炭. 6.
(10) 化 水 素 が 含 ま れ て い る こ と を 確 認 し た 。 GC-M8 分析には、 JEOL. JM8-GCmate mass spectrometer を使用し、イオン源を 70eVに設定し 測 定 し た o GC カラムは、 DB-1(30 mxO.32 m m，I .D. 0.25 11m，J& W 0. 0. 8 c i e n t i f i c，Folsom，CA)を 使 用 し 、 カ ラ ム オ ー ブ ン 温 度 は 40Cから 40C 0. /minで 120Cまで昇温し、 4C/minで 300Cまで昇温させた。注入口の温 0. 0. 0. 度 は 300C、 検 出 器 の 温 度 は 320Cに設定した。スプリット比は、 1:100 0. に設定した。そして、飽和画分からは、 ClOから C 3 5の 飽 和 炭 化 水 素 の ピ ークとそのフラグメントイオンを確認した. O. 芳香族画分からは、 r . t . 20. mlnま で に 出 現 し た ピ ー ク に 2から 4員環の芳香族化合物を確認し、側鎖 にアルキル基の付加した物質や硫黄分を含む物質のフラグメントイオン も得られた。. 2 . 3 .炭化水素分解試験 . 0mlは、炭素源に 4 . 0g / l飽和画分、 4 . 0 分解試験に使用した集積培地 5 g/l芳香族画分、 1 0 . 0g/l重油、または飽和画分と芳香族画分を無機塩培地 に 添 加 し て 調 製 し 、 群 集 や 単 離 菌 を 接 種 し て 37Cで 振 と う 培 養 (125 0. strokes/min)し た 。 培 養 液 に 内 部 標 準 物 質 を 加 え て 、 残 存 し て い る 炭 化 水 素を TLC/FID分析で定量して分解率を求めた。 分析試料は、培養液 5 . 0 mlに 内 部 標 準 物 質 と し て ス テ ア リ ル ア ル コ ー. 5 . 0g / l，ナカライテスク株式会社)1mlを加えた後、 n-ヘ キ サ ン : ト ル ル( エン / 6 : 4( v : v) 15ml加 え て 炭 化 水 素 を 抽 出 し 、 減 圧 乾 回 し た 後 、 抽 出 溶 媒. . 0mlにメスアップして調整した。 で5 試 料 は TLC/FID分析(イアトロスキャン MK-6s， IatronMitubishiI n c .，. Tokyo，Japan) で定量した. 1 7 )。 こ の 方 法 は 、 重 油 成 分 を. TLCで 3つ の 画. 分(飽和画分，芳香族画分，レジンとアスファルテン混合画分)に分画し た 後 、 飽 和 画 分 と 芳 香 族 画 分 を FID で 定 量 し 、 コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 培 養液中の残存量を差し引し、た割合を分解率として表示した。 分析試料をクロマロッド8皿(IatronMitubishiI n c . )に 1μlスポットし、 恒湿槽に 10分間保った後、 n-ヘキサンを入れた展開槽内で、 10分 間 ハ ン. 7.
(11) ギングしてから飽和画分を 1 0c m展 開 し た 。 ハ ン ギ ン グ と 展 開 は 40Cの恒 0. 温 槽 内 で 行 っ た 。 展 開 後 、 室 温 で 2分 間 乾 燥 さ せ て 、 溶 媒 を 除 去 し た 。 展. 0分間恒湿槽に保った。次に、 開したロッドを安定化させるため、再び 1 n-ヘキサン:トルエン 1 2 : 8 ( v : v )、 で. 5c m展 開 さ せ 、 芳 香 族 画 分 と 内 部 標 準 を 展. 開した。イアトロスキャンを用いて室温で 2分 間 乾 燥 さ せ た ロ ッ ド を FID 分析した。 FID分析は、水素と空気の流量比を H 2 : a i r / 1 6 0 : 2 0 0 0ml/min に 調整して行った。. 2. 4.GC分 析 に よ る 炭 化 水 素 分 解 の 確 認 2.4.1.飽和画分と芳香族画分の生分解諒験. . 0mlに 、 飽 和 画 分 あ る い は 芳 香 族 画 分 を 4 . 0g / lとなるよう 集積培地 5 に添加したこれらの培地に、重油添加培地で 7 日間前培養した K -3群 培 養 液を 100μl植 菌 し 、 振 と う 培 養 ( 3 7C， 125s t r o k e s / m i n ) した。培養液 0. n -ヘ キ サ ト リ ア コ ン タ ン ( C 3 6 )， 5 . 0g/ l ]1 .0mlを加えた に内部標準物質 [ 後 、 n-ヘ キ サ ン : ト ル エ ン 1 6:4 ( v : v )で、抽出、減圧乾固物を、飽和分は抽 出溶媒で 5 . 0mlに、芳香族分は1.25mlに メ ス ア ッ プ し た も の を 分 析 試 料として、 GC分 析 し た. 1 8 )。. GC分 析 に は GC-14B(Shimadzu，Kyoto，Japan)を使用し、検出には FID を用いた。カラムは DB-1 (3 0mxO . 3 2m m，I .D .0 . 2 5l l m，J&W S c i e n t i f i c ) を使用し、キャリアーガスには窒素 ( 4 8mllmin)を用いた。サンプルは 1μl を注入し、スプリット比は 1 : 1 0 0で 分 析 し た 。 飽 和 画 分 測 定 時 の カ ラ ム オ. 0Cか ら 毎 分 1 2Cで 300Cま で 昇 温 さ せ た ーブン温度は、初期温度 8 0. 0. 0. O. 注. 00Cに 設 定 し た 。 芳 香 族 分 測 定 時 の カ ラ ム オ ー ブ 入口と検出器の温度は 3 0. 0Cから 40C/min で 120Cま で 昇 温 し 、 次 い で 4C/min で ン温度は、 4 0. 0. 0. 0. 300Cま で 昇 温 さ せ た 。 注 入 口 の 温 度 は 300C、 検 出 器 の 温 度 は 320Cに 0. 0. 0. 設定した。. 2. 4. 2 .飽和画分と芳香族画分を共に添加したときの生分解試験 培養液に残存する飽和および芳香族炭化水素を、固相抽出法を用いて分. 8.
(12) 別した。まず、内部標準を添加した培養液を n-ヘキサン:トルエン / 6: 4 ( v : v ) で抽出し、抽出物を石油エーテルで 3 . 0mlに メ ス ア ッ プ し た o 8ep-Pack. (Waters，Milford，M A，U8A) 81の上に CNを 接 続 し た 固 相 に 試 料 溶 液 . 0mlを 固 相 に 流 し て 、 溶 出 液 を を 3mlア プ ラ イ し た 後 、 石 油 エ ー テ ル 8 減圧乾固後、 n-ヘ キ サ ン で 5 . 0mlに メ ス ア ッ プ し た も の を 飽 和 画 分 の 分. 3:l (v : v) 10 . 0 析試料とした。次に、芳香族画分を石油エーテル:ベンゼン/ mlで溶出した。溶出液を乾固し、 n-ヘ キ サ ン : ト ル エ ン / 6:4 ( v : v )で1.25 ml に メ ス ア ッ プ し て 、 芳 香 族 分 の 分 析 試 料 と し た 。 各 試 料 と も 、 濃 縮 乾 回を行う直前に内部標準を加えた。 GC分 析 条 件 は 、 前 述 の 方 法 ( 2. 4. 1 )に 従った。. 2 . 5 .PCR-DGGE解 析 DNA抽出方法は、 Z i i o uら. 19)の 方 法 を 一 部 改 変 し て 、 培 養 液 か ら 多 く. の DNAを抽出できるようにした。 No.22群 継 代 培 養 液 20mlを 遠 心 分 離 し て 、 得 ら れ た 沈 殿 物 は 滅 菌 済 み 超 純 水 (8.P.WJで 2回洗浄後、 675μlの. DNAe x t r a c t i o nb u f f e rに懸濁し、 -30Cで 凍 結 し た 。 融 解 し た サ ン プ ル 0. 0. roteinaseK(Wako)を 7.5μl加えた後、 37Cに保って 5 に 、 10mg/mlの p mln間 隔 で 撹 搾 し な が ら 30minイ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 こ れ に ラ ウ リ ル 硫 odecylsulfate:8D8，200g ， l / Wako)溶 液 75μl添加 酸 ナ ト リ ウ ム (sodiumd した。 64Cに保って 20min間 隔 で 撹 搾 し な が ら 1hインキュベートし、 0. 氷 水 中 で 10min静置後、 -30Cで 30min凍 結 さ せ て か ら 65Cで 15min 0. 0. インキュベートして融解させた。この凍結融解操作を繰り返し、 3度 目 の. l c o h o l / 5 0 : 4 9 :l (v / v ，PCI ) を 375μl 凍 結 時 に Phenol-chloroform-isoamyla 添加してから凍結した。融解したサンプノレを遠心分離 (15000rpm，10min， 室温)した後、上清(水層)を回収した。これに 1m MEDTAを含む 10m M. Tri s -HCl(TE)緩 衝 液 (pH8 . 0 )に フ ェ ノ ー ル を 飽 和 さ せ た 溶 液 700μl添加 し、穏やかに混和した後、遠心分離(15000rpm，10min，室温)した。上清. (Phenol層)を除去した後、 PC1を 同 量 添 加 し て 、 遠 心 分 離 (15000rpm，10 mln，室温)した. O. 上清(水層)を回収した後、 Chloroform. 9. 1soamyl.
(13) alcohol /2 4 : 1 ( v / v ，CIA)を 同 量 添 加 し 、 穏 や か に 混 和 し た 後 、 遠 心 分 離 (15000rpm，10min，室温)した。上清(水層)を回収後、 2-propanolを 0 . 7 倍量添加して静置( 2h あるいは一晩，室温)したサンプルを遠心分離. 0 (15000rpm， 10min， 20C)して、上清を除去した。得られた沈殿物に 70 % ( v / v )エ タ ノ ー ル 1000μIを 添 加 し 、 遠 心 分 離 (12000rpm， 5min， 200 C)して 洗浄後、エタノールを除去して沈殿物を風乾させ、 8.P.W.20μlに溶解し た。得られた溶液は、分光光度計で 260nmにおける吸光度を測定し、 DNA 濃度を求めた。. PCR に は Ampli Taq Gold セ ッ ト ( P e r k i n -Elmer Japan，Applied Biosystems Division，Chiba，Japan)を用い、反応液は、 10X TaqGold . 0 Buffer5μl、25m MMgCb6μl、各デオキシヌクレオシド 3 リン酸(各 2 mM)5μl、各プライマー(各 10μM)1μl、鋳型 DNA(30n g / μ1 )1μ1、Ampli )1μl、そして 8.P.W.30μlからなる全量 50μlの系とした。 TaqGold(5U / μ1 プライマーセットには、 168rRNA遺 伝 子 の V3領 域 の 約 200b p(E. c o l i. No.341・534) を 増 幅 す る よ う に. GC. クランプ ( 5 ' -. CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3')イ寸の GC-341F(5'-GC. クランプ. ρ. CCTACGGGAGGCAGCAG-3') と. ・. 534R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')を用いた. 20)。. y c l e r ( B i o -Rad サ ー マ ル サ イ ク ラ ー に は 、 My CyclerTM Thermal C Laboratories， Hercules， CA， U8A)を 用 い た 。 サ イ ク ル 条 件 は 、 0 0 Pre-run(95C，10min)を 行 っ た 後 、 熱 変 性 ( 9 3C，1min)、 ア ニ ー リ ン グ 0 ( 4 8C，70 s e c )、伸長反応 ( 7 20 C，70 s e c )を 25 サ イ ク ル 行 い 、 最 後 に Post-run(720C，10min)を行った。 PCR で目的配列が増幅されたことを確認するために、アガロースゲ、ル 0 . 0g / lアガロース (Agarose8，Wako)、バッ 電気泳動を行った。ゲルは 2 ファーは 0.5xTAE、 DNAマ ー カ ー に は 100bpDNALadder(TakaraBio. I n c .，8higa，Japan)を用いた。泳動後、 Ethidiumbromideにゲルを 10min 浸潰し、 KodakGel L ogic 200 Imaging 8ystem(Cosmo Bio C o .，L t d .，. Tokyo，Japan)を用いて UVを透過し、検出された DNAバンドを撮影した。 10.
(14) 菌 群 の DNAサ ン プ ル は 4本 分 の PCR産物を増幅して、 QIAEXI IGel. Extraction Kit(QIAGEN，8anta C l a r i t a， CA，U8A)を用いて濃縮した。 PCR産物は、1.5mlエッペンドルフチューブに全量(計 200μ1)移し、 Buffer QX1 600μlを 加 え て 30s e c撹排した。 QIAEX 1Iを 5 μ l加 え 遠 心 分 離 (12500rpm，30s e c，20C)した後、上清を除去した。次に BufferPEを 500 0. 0. e c，20C)を 行 っ て 上 清 を 除 去 μ l加えて洗浄し、遠心分離(12500rpm，30s した。この操作を 2回 繰 り 返 し 行 っ た 。 得 ら れ た 沈 殿 物 は 風 乾 し た 後 、 20. μ lの 8 . P . W .を 加 え て 室 温 で 5min 静 置 し 、 遠 心 分 離 (12500rpm，30s e c， 20C)し た 。 得 ら れ た 上 清 は 新 し い エ ッ ベ ン ド ル フ チ ュ ー ブ に 回 収 し た 。 0. DGGE解析には、 Dcodesystem( B i o -RadLaboratories， In c . )を 使 用 し た。ゲルは、変性剤濃度とアクリルアミドの両方に濃度勾配をつけたダブ ルグラジエントゲルを用いた. 21)。. 変性剤の濃度勾配は、泳動方向に. 20・50 % と な る よ う 調 整 し 、 変 性 剤 濃 度 は 7.0Mの尿素と 40 %(v/v)の 脱 イ オ ン ホ ル ム ア ミ ド を 100 %とした。ポリアクリルアミド(アクリルアミ. 3 7 . 5 :1，B i o -Rad Laboratories，I n c . )には、 6 9% ド:ビスアクリノレミド / ( v / v )の 濃 度 勾 配 を つ け た 。 泳 動 Bufferには、 0.5XTAE Bufferを用い、 60C、 200V で 6h電気泳動を行った。ゲルは、 8YBRgold(Molecular 0. Probes，Eugene，OR，U8A)に 30 min 浸 1 責し、 KodakGel L ogic 200 Imaging 8ystemを 用 い て UVを 透 過 し 、 検 出 さ れ た DNAバ ン ド を 撮 影 した。. DGGE解 析 で 得 ら れ た バ ン ド は 切 り 出 さ れ 、 こ れ を テ ン プ レ ー ト と し て 168 rRNA遺 伝 子 の V3領 域 約 200bpを 増 幅 し た 。 使 用 し た プ ラ イ マ ー や DNAポリメラーゼ、 PCRの条件は、前述の方法にしたがったが、 PCR サ イ ク ル 数 は 25サ イ ク ル か ら 18サイクルに変更した。 PCRを行った後、 電 気 泳 動 で 増 幅 を 確 認 し 、 さ ら に 、 DGGE でバンドの純度を確認した。. DGGEで検出したバンドを再度切り出し、 PCRを 行 い 精 製 後 、 塩 基 配 列 を解析した。. 1 1.
(15) 2 . 6 .菌株の分離 7 日間培養した K-3群 培 養 液 を 滅 菌 生 理 食 塩 水 で 10倍段階希釈した。 0 . 0g / lグ リ セ ロ ー ル 添 加 無 機 塩 培 地 と R2A平 板 培 地 希 釈 液 100μlを 1 ( D i f c oLab.，BectonandDickinsonCompany ，FranklinLakes，NJ，U8A) に塗沫し、 37Cで 1から 2日間培養した。形態の異なるコロニーを選択し、 0. 再 び 10倍 段 階 希 釈 液 を 平 板 に 塗 沫 し 、 コ ロ ニ ー の 均 一 性 を 確 認 し た 。. 2 . 7 .分離株の同定 2 . 7 .1.形態学的、生理・生化学的性状 Nikon)で、観察して、菌の形態と運動性を調べた。 分離株を位相差顕微鏡( グラム染色は常法. 22)に し た が っ て お こ な い 、 そ の 他 の 生 理 ・ 生 化 学 的 性. 状 は Api20E同定キット (Biomerieux，Marcyl ' E t o i l e，France)を 使 用 し た. O. 2 . 7 . 2 .168rRNA遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 解 析 . 0 ml を 集 菌 洗 浄 し た 後 、 40 m M EDTA を 含 む 100 m M 培養液 5. Tri s -HCl(TE)緩 衝 液 (pH8 . 0 )500μlに懸濁した。 100g/ lsodiumd odecyl sulfate(8D8，Wako)溶 液 100μlと Benzylchloride(NakaraiTesqueI n c .， Kyoto，Japan)300μlを 添 加 し 、 よ く 携 枠 後 50Cウ ォ ー タ ー パ ス 中 で 30 0. mlnイ ン キ ュ ベ ー ト し た. 23)。その後、. 3.0M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 (pH5 . 0 ). を 300μl添加し、室温で 15min静置した。遠心分離 ( 15， 000rpm，15min，. 20C) 後 、 回 収 し た 上 清 に 2・Propanolを 1000μ1加 え 、 室 温 で 5min静 0. 置 後 、 遠 心 分 離 (15000rpm，5 min，20C)し て 得 ら れ た 沈 殿 物 を 70 % 0. ( v / v )エ タ ノ ー ル で 2 回 洗 浄 を 行 っ て か ら 乾 燥 さ せ た. O. 得られた沈殿物を、. 8.P.W.50μlに溶解した。 50倍 希 釈 液 の 260nmに お け る 吸 光 度 を 分 光 光 度計で測定し、 DNA濃度を求めた。. PCR には AmpliTaqGoldセットを用い、反応液は、 10xTaqGold Buffer5 μ l、 25mMMgCb6 μ l、 各 デ オ キ シ ヌ ク レ オ シ ド 3 リン酸(各 2 . 0 g / μ1 )1μl、Ampli mM)5μl、各プライマー(各 10μM)1μl、鋳型 DNA(30n. TaqGold(5U / μ1 )1μl、そして 8.P.W.30μIか ら な る 全 量 50μlの系とした。 プライマーセットには、 168rRNA遺 伝 子 の 約 1500bpを 増 幅 す る よ う に. 1 2.
(16) 27f( 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')と 1492r ( 5 ' -AAAGGAGGTGATCCAGCC-3') を用いた。サーマノレサイクラーには、 0 MyCycler™ ThermalCycler を用いた。サイクル条件は、 Pre-run(94C， 0 0 7min)を 行 っ た 後 、 熱 変 性 ( 9 4C，45s e c )、 ア ニ ー リ ン グ ( 5 5C，45s e c )、 伸長反応( 7 20 C，45s e c )を 30サイクル行い、最後に Post-run(720C，10min) を行った o PCRで 目 的 配 列 が 増 幅 さ れ た こ と を 確 認 す る た め に 、 ア ガ ロ ースゲ、ル電気泳動を行った。ゲルは 2 0 . 0 g / 1ア ガ ロ ー ス 、 バ ッ フ ァ ー は. 0 . 5 x T r i s A c e t i cAcid-EDTA(TAE)Buffer(Bio-RadLaboratories， In c . >、 DNAマーカーには、 λEcoT141d i g e s t(TakaraBiol n c . >を 用 い た 。 泳 動 thidiumbromide(Wako)にゲルを 10min浸漬し、 KodakGelLogic 後 、 E 200lmagingSystem(CosmoBioC o .，L t d .，Tokyo，Japan)を 用 い て 紫 外 線 (UV)を 透 過 し 、 検 出 さ れ た DNAバンドを撮影した。. PCR産物を 1 5 . 0g/lアガロースゲルで電気泳動し、検出した目的バンド I をメスで切り出し、1.5mlエッペンドルフチューブに回収した。 QIAEXI Gel Extraction Kitを用いてゲルから DNAを 抽 出 し こ れ を 精 製 DNAサ ンブロルとしてシークエンス解析に用いた。. 2 . 8 . シークエンス解析 ycle Sequencing シークエンス解析は、 DYEnamic ET Terminator C Kit(Amersham Biosciences， Piscat away ， NJ， USA)を 用 い て ダ イ レ ク ト シ ークエンスを行った. 24)。 用 い た シ ー ク エ ン ス プ ラ イ マ ー を T able1に示し. た 。 DNAシークエンサーには、 ABIPRISM3100DNASequencer(Applied. Biosystems)を 用 い た. O. 決 定 さ れ た 塩 基 配 列 は 、 DNAData Bank o f. -. a c .i p )に 登 録 さ れ て い る 塩 基 配 列 に 対 Japan(DDBJ: http://www.ddbi.nie して BLAST検索を行い、相向性の高い菌株を検索した。. 13.
(17) Table1 .Sequencep r i m e r s P r i m e r s D i r e c t i o n P o s i t i o n * 1 6 SrRNAg e n ep r i m e r s. S e q u e n c e s. f 1L. Forward. 9 2 7. デ ーGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '. f 2L. Forward. 5 1 7 5 3 5. デ -CCAGCAGCCGCGGT AATAC-3'. f 3L. Forward. 1 0 9 3 1 1 1 1 デーGTCCCGCAACGAGCGCAAC-3'. rlL. R e v e r s e. ・5 17 535. デ ーGTATTACCGCGGCTGCTGG-3 '. r2L. R e v e r s e. 8 0 4 7 8 5. 5'-GACTACCAGGGTATCTAA TC-3'. r3L. R e v e r s e. 3 ' 1 1 1 0 1 0 9 2 デーTTGCGCTCGTTGCGGGACT-. r4L. Reverse. 1 4 0 5 1 3 8 8 5'-ACGGGCGGTGTGTACAAG-3'. rEIL Reverse DGGEp r i m e r s. 3 4 4 3 2 6. デ ーGTAGGAGTCTGGACCGTGT-3'. 341F. 3 4 1 3 5 8. 5 '・CCTACGGGAGGCAGCAG ・ 3 '. Forward. 534R R e v e r s e 344 ・ 326 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' s a s e do n1 6 SrRNAg e n eo fE.coli(1541bp) 会. 14.
(18) 3 . 実験結果および考察 3 .1.重油生分解能の高い菌群の選出 重 油 を 分 散 ・乳 化 し 、 さ ら に 継 代 培 養 を 繰 り 返 して も 飽 和 画 分 や 芳 香 族 画 分 を 安. 唱. 高い微生物群集として選抜した ( F i g .. 、。 r ， ‘i. 定 し て 分 解 し た K-3 群 を 重 油 生 分 解 能 の. -3culture Control K. K-3群 の 炭 化 水 素 分 解 率 は 、 継 代 20固 ま では不安定であったが、 それ以降安定し、. 32 代 目 の 飽 和 画 分 分 解 率 は 7 日 間 で 40・60 %、芳香族画分分解率は 40・50%に. f the K-3 . Growth o F i g .1 consortiumi namediumwith crudepetroleum.. F i g .2 )。 達した (. K-3群 の よ う に 、 重 油 を 炭 素 源 と し た 培 地 に 集 積 培 養 し て 、 重 油 中 の 炭 化 水 素 を 安 定 し て 高 分 解 す る 群 集 が 確 立 さ れ た 報 告 は 少 な い 。8ugiura ら 25)は. 5g / l重 油 添 加 培 地 に 群 集 8M8 を培養すると 10 日目に飽和画分を. 白as ら 40・53 % 、 芳 香 族 画 分 を 11-18 % 分 解 した と 報 告 している 。 Vi. ている 。. b a. 7-19 % 分 解 し た と 報 告 し. 。﹄聞広三。. に 多 環 芳 香 族 炭 化 水 素 )を. 0000 QO'. 主 34・60 % 、 芳香族画分(. gfs. 群集 l 土 飽和 画分 を. (ヌ)国. 群 集 を 確 立 し 、 これらの. 喝伺﹄凶ω旬。ω a a ω 回同一嗣 冨。右側 一 ah。h. も 、 異 な る 条 件 で 3 つの. 2 6 ). O. 10. 培養条件や、 用 い た 重. 15. 20. 25. 30. Subculture( t i m e s ). 油の性状などが異なるた め 、 単純に比較すること は難しいが 、K-3群 は こ れ までに報告されている群 集より、 重 油 中 の 飽 和 画 分や芳香族画分を共に高. F i g .2 . Degradationo fsaturatedandaromatic hydrocarbons. by. the. K-3. consortium. subcultured ln the enrichment medium 10 g! l ) . supplemented with crude petroleum (. ，degradation. of s a tu ra t ed hydrocarbon;. d e g r a d a t i o no fa r o m a t i ch y d r o c a r b o n.. 1 5. 企，.
(19) い割合で分解できる優れた群集である。 確 立 し た K-3群 を 長 期 間 保 存 す る た め に -80Cで凍結保存し、 1ヶ月後 0. に復元した群集は、重油添加無機塩培地で良好に生育した。また菌叢は、. DGGE解析で変化していないこと確認した。これにより、 K-3群 を 長 期 保 存することが可能となった。また通常の群集の維持は、 7 日間隔で継代培 養 で 行 い 、 現 在 200 代 目 を 超 え て い る が 、 菌 叢 が 変 化 し て い な い こ と を. DGGE解析で確認している。. 3 . 2 .重油から分画した飽和画分と芳香族画分の生分解 K-3群 を 飽 和 画 分 あ る い は 芳 香 族 画 分 を 炭 素 源 と し た 培 地 で 7日間培養 す る と 、 飽 和 画 分 を 40 % 分 解 し た が 、 芳 香 族 画 分 の 生 分 解 率 は 7 日で 2~3. %しかなく、 14日で 8 %、 21 日でも 20%と低かった (Fig.3 )。この. 値は、 Fig. 2 の 重 油 添 加 培 地 で 培 養 し た と き の 芳 香 族 画 分 の 分 解 率 (40~50 % ，. 7日間)に比べると著しく低かった。. gZ宕 ω図。官官﹄国 ω言明国. (♂むな. 80 60 40 20. 。. 14 C u l t u r e( d a y s ). 21. 7. F i g .3 . Degradation of s a t u r a t e d and aromatic hydrocarbons by t h e K-3 c o n s o r t i u m .. ，・. d e g r a d a t i o n of s a t u r a t e d hydrocarbon i nt h e enrichment. ， . . ，_. l ) ; medium supplemented with s a t u r a t e s( 4 g/. hydrocarboni nt h emediumwitha r o m a t i c s( 4g / l ) ;. d e g r a d a t i o n of a r o m a t i c d e g r a d a t i o nofa r o m a t i c. hydrocarbon i nt h e medium with a r o m a t i c s and s a t u r a t e s . ) . expresseda st h emean土 SD(n= 3. 16. R e s u l t sa r e.
(20) そこで、飽和画分と芳香族画分を一緒に添加した培地で培養すると、飽 和 画 分 の 分 解 率 は 40 % と 変 わ ら な か っ た が 、 芳 香 族 画 分 分 解 率 が 7日目 では 20 % に 上 昇 し た ( F i g .3 )。この結果は、 K-3群 が 芳 香 族 画 分 を 分 解 す るときには、飽和画分を要求することを示している。たとえば、芳香族画 分の分解に働く酵素系を合成するため、あるいは芳香族画分分解酵素系が 分 解 反 応 を 触 媒 す る の に 必 要 な ATPや 補 酵 素 な ど を 合 成 す る た め に 飽 和 画分のような利用しやすし，(分解しやすしウ物質が必要であると考えられる。. 1 0 ' ' ' " " 'C 3 5の鎖長をも 重 油 か ら 分 画 し た 飽 和 画 分 を GC分析したところ、 C っ飽和炭化水素のピークを検出することができた ( F i g. 4a ) K-3群 培 養 0. 液 か ら 抽 出 し た 飽 和 画 分 の GCク ロ マ ト グ ラ ム で は 、 各 ピ ー ク が 一 様 に 減. 1 0 " ' " " 'C 3 5の 飽 和 炭 化 水 素 を 均 一 に 分 解 で 少していたことから、 K-3群は、 C きる点に特徴がある ( F i g .4 b ) 飽和炭化水素を生分解できると報告され 0. ている A cinetobacters p .は 、 C7から C20の 飽 和 炭 化 水 素 を よ く 分 解 す る が 、 C3 0以 上 の 炭 化 水 素 分 解 力 は 低 い と 報 告 さ れ て い る. 27)0. K-3群のよう. 。. 、 、vuv. 3 5付 近 ま で の 長 鎖 飽 和 炭 化 水 素 を 分 解 で き る 微 生 物 群 集 は 報 告 が 少 な にC. 一方、芳香族両分を添加した K-3群 培 養 液 か ら は 、 芳 香 族 画 分 の ピ ー ク. F i g .4 -C)が、飽 が明確に減少していることを確認することが出来なかった ( 和 画 分 と 芳 香 族 画 分 を 同 時 添 加 し た 培 地 で 培 養 し た K-3群培養液では、飽. .t .12min 前 和炭化水素のピークは均一に減少し、さらに芳香族画分も r 後の大きなピークが大きく減少していた ( F i g .4 d )。. TLC/FIDと GC分析の結果から、 K-3群 は 芳 香 族 画 分 を 分 解 す る と き に. urkholderiac e p a c i a2A-12 飽和画分を要求することが明らかとなった。 B は、フェナントレンを分解するときに Y easte x t r a c tの よ う な 補 助 基 質 を 添加すると、分解活性が 3倍に高まったと報告されている. 28)。また、. Pseudomonassaccharophila P15は 、 サ リ チ ル 酸 を 含 む 培 地 で 前 培 養 す ると、フェナントレン分解酵素であるジオキシゲナーゼが誘導されること が明らかにされている. 29)。 こ の よ う に 、 補 助 基 質 や 分 解 酵 素 の 誘 導 物 質. となる基質を芳香族炭化水素と共に添加すると、芳香族炭化水素分解活性. 1 7.
(21) が上昇することから、飽和画分の代わりに Yeastextractを 1g / l添加して、. K-3群 の フ ェ ナ ン ト レ ン ( 60mg / l )分 解 率 を 測 定 し た 。そ の 結 果 、 フ ェ ナ ン トレンは 7 日間で 30 % 分 解 さ れ た 。 Yeast extract無 添 加 で 培養したと 、 き 、 ほ と ん ど 分 解 さ れ な か っ た こ と か ら 、 飽 和 画 分 や Yeast extractは. K-3 群 が 芳 香 族 炭 化 水 素 を 分 解 す る と き の 補 助 基 質 と し て 機 能 し て い る と推察される 。. (A). .~ 。 8. 1 6. 2 4. ( E ). (C). ↓ J 伽 1 /. 叫叫. . 1弘 、 Luf・. 。. 43 24 04 8 8 16 2. ( B ). 。. 8 16 2 43 24 04 8. ( 0 ) . 、、ー. ￨ ノ /y 1 . 一-_. _~ムμι以A山岨' . .一 -. 。. ~~../〆4 . J . J ' ....... 仁ー‘-"'-'~. ri. oS I 11 ¥ 空& ' l ? &0 &員 F i g .3 . GCanalysisofextractsfromtheculturesolutionsoft h eK 3consortium 見. 11 ¥. ?&. ・. The K 3 consortium was c u l t u r e di n med i as upplemented w i t ht h es at u r a t e d ・. hydrocarbonf r a c t i o n( B) ，witht h earomatichydrocarbonf r a c t i o n( C ) ， andwitht h e s a t u r a t e dandaromatichydrocarbonf r a c t i o n s(D)a f t e rsevendays. GCa n a l y s i sof t h ee x t r a c t sfromt h emediumw i t ht h es a t u r a t ed(A)andaromatic( E )hydrocarbon f r a c t i o n s(Awast h ec o n t r o la g a i n s tB，andEwast h a ta g a i n s tC ) .. 1 8.
(22) 3 . 3 .PCR-DGGE法による K-3群 の 群 集 構 造 解 析 K-3 群 培 養 液 を DGGE 法で解析した 結果、. 25%. Fig. 5 本の D N Aバ ン ド (A-E)が検出された ( 5 )。 各 バ ン ド の 塩 基 配 列 約 200 bpを決定し、. 相同値の高い属種を検索した結果、バンド A. バ ン ドB は UnculturedA lphaproteobacteria. anthropiAS5 (AM113857)と 100% の 相 同 値 を示した 。 また、バンド C と E は Gamma. p r o t e o b a c t e r i a綱 に 含 ま れ る 菌 と 推 定 し た. u ω ロzs-agm w 白. (AY144193)， バ ン ド D は O chrobactrum. M M g。 由。沼偲﹄包囲山W. は Pseudomonsa eruginosaM02(AY162138)、. (Table 2 )0 5 本 の D N A バンドは、いずれも. Alpha と Gammaprpteobacteria綱に分類さ 守. れた 。. 55%. F i g . 5 . DGGE of 16S 3. 4 .K-3群 培 養 液 か ら コ ロ ニ ー の 単 離 K-3 群 培 養 液 か ら 、 形 態 の 異 な る コ ロ ニ ー. を 6株 選抜した (Fig.6)0 6株を R2A平 板 培. rRNA. gene. bands. o b t a i n e d from t h e K-3 consortium.. 地で培養すると、 5株 (G-1，2，4，H-1，2)で 蛍 光 物 質 の 生 産 が 認 め ら れ た 。 これら 5株 は R2A平板培地で優先的にコロニーを形成し、 G3株 の コ ロ ニ ーは、出現頻度も出現数も少なかった。. Table2 .168rRNAgenes e q u e n c e so ft h emajorDNAbandsd e t e c t e dbyPCR-DGGE . b a n d. P h y l o g e n e t i cg r o u p. C l o s e s ts e q u e n c e( A c c e s s i o nN o . ). A. G a m m a p r o t e o b a c t e r i a Pseudomonasa e r u g i n o s aM02( A Y I 6 2 1 3 8 ). B. A l p h a p r o t e o b a c t e r i a. C. G a m m a p r o t e o b a c t e r i a U n c u l t u r e db a c t e r i u m( A Y 2 1 8 7 4 7 ). D. A l p h a p r o t e o b a c t e r i a. E. G a m m a p r o t e o b a c t e r i a U n c u l t u r e db a c t e r i u m( A Y 2 1 8 7 37 ). U n c u l t u r e dAlphaproteobacterium( A Y 1 4 4 1 9 3 ) Ochrobactruma n t h r o p iA S5( A M I 1 3 8 5 7 ). 1 9. H o m o l o g y( % ) 1 0 0 1 0 0 9 8 1 0 0 9 9.
(23) 3 . 5 .K-3群 か ら 分 離 し た 株 の 同 定 3 . 5 .1.生理・生化学的性状 6株 は い ず れ も グ ラ ム 陰 性 で 運 動 性を有する梓菌であった 。蛍 光 物 質. Gl. G2. G3. G4. Hl. H2. を生産した 5 株は、 Pseudomonas. aeruglnosaの特徴を示したが、詳細 な生理・生化学的特徴の違し、から、 さらに 3 つ の グ ル ー プ (G1 と G2. .S i xs t r a i n si s o ¥ a t e df r o mt h e F i g .6. 株 、 G4 株 、 H1と H2株)に分ける. K-3c o n s o r t i u m .. Table3 )。 ことができた ( また、これら 5株の DNAを抽出し、 DGGE解析すると、 K-3群 培 養 液 から検出された Pseudomonasa eruginosaと同じ位置(バンド A，F i g .5 ) にバンドが出現した 。. G3株 の 性 状 や コ ロ ニ ー 形 態 は Pseudomonas属とは大きく異なってい T a b l e3 )0 G3株 を DGGE解析すると、 K-3群 培 養 液 か ら 検 出 さ れ た た(. OchrobactrumanthropiA85のバンド(バンド D，F i g .5 )と閉じ位置にバ ンドが出現した。 、 G3 これらの結果から、蛍光物質を生産する 5株 は Pseudomonas属 株 は Ochrobactrum属と同定した 。. 3 . 5 . 2168rRNA遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 解 析 単離 6株の DNAから 168rRNA遺伝子を PCR法で増幅した 。この PCR 産 物 を シ ー ケ ン ス し て 全 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 その結果、 Pseudomonas 属 5株のうち、同じ性状を示した Gl株と G2株 、 Hl株と H2株 は 塩 基 配 列が一致したことから同一株と同定した 。決定した塩基配列は、 DDBJに. G1 株， Accession number AB126582;G3 株 ， AB120120 ;G4 株， AB222019;H1株 ， AB222018 として登録した 。 B last検索すると、 G1 株と H1株の塩基配列は、 Pseudomonasa eruginosaAL98(AJ249451)と. 99.9% 、 G4株は、 Pseudomonass p .A3(Y13246)と 99.9% 、 G3株 は 20.
(24) Table3 .Morphologicalandp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fi s o l a t e ds t r a i n s fromtheK-3consortium.. P .aeruginosa. Gl G2 G4 Hl H2 I A R f 1 5 1 4 I Oxidase 8・galactosidase A r g i n i n ed i h y d r o l a s e L y s i n ed e c a r b o x y l a s e e c a r b o x y l a s e O r n i t h i n ed Urease Tryptophandeaminase G e l a t i n a s e U t i l i t yo fc i t r i ca c i d. + +. +. + +. +. + +. +. + +. +. + + + +. + + + +. + + +. + + + +. + +. P r o d u c t i o no fH2S P r o d u c t i o no fi n d o l e P r o d u c t i o no fa c e t o i n r o d u c t i o nf u g a r A c i dp r o ms Glucose l ¥ 置a D n n i t o l I n o s i t o l D S o r b i t o l L Rhamnose S a c c h a r o s e D M e l i b i o s e D-Amygdalin L A r a b i n o s e OFt e s t. G3. + + +. + +. + +. + +. +. 。。。 。 。 O. O. OchrobactrumanthropiLMG3306(U88440)と 99.7%の高い相同値を示 )。 F i g .7 し、系統樹でも同じクラスターを形成した (. 形態学的および生理・生化学的性状と 168rRNA遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 結 果から、 G1、 G2、 Hl、 H2 株 は Pseudomonasa eruginosa、 G4 株 は. Pseudomonass p .、 G3株 は Ochrobactruma nthropiと同定した。その結 果 、 K-3群は、 Pseudomonas属と Ochrobactruma nthropiお よ び 未 分. )で構成されていることを明らかにした。 離の 3株(バンド B，C，E，F i g .5. 2 1.
(25) Rhodococcuss p .NCIMB12038(AY426699) Sphingomonass p .時'IL1(AY026948) Ochrobactruma n t h r o p iLMG3306(U88440) G3(AB120120). Comamonass p .SFCD1(AY134850) Pandoraeas p .G5056(AF247692) B u r k h o l d e r i am u l t i v o r a n sLMG1310(Y18703) E s c h e r i c h i ac o l i( J 0 1 8 5 9 ) Pseudomonass p .Q3(DQ989290) G4(AB222019) Pseudomonass p .A3(Y13246) Pseudomonasa e r u g i n o s aAT2(AB091760). 0 . 1. Pseudomonasa e r u g i n o s aAL98(AJ249451) G1(AB126582) H1(AB222018). F i g .7 .Physiologicalt r e eo fi s o l a t e ds t r a i n sfromtheK-3consortium.. 22.
(26) 3 .1 .1 0 .分離株の重油生分解 分離した 6株を重油 ( 10.0 g l l ) 添加無機塩培地で培養し、重油の形態 変化を観察するとともに、重油中の飽和炭化水素と芳香族炭化水素の生分. uginosaG1 をはじめ Pseudomonas 解 率 を 測 定 し た 。 Pseudomonasaθr 属 と 同 定 さ れ た 培 養 液 (G2、G4、H1、H2株)では良好な生育が認められ、 継代培養しても重油が培養液中に乳化されるなどの形態変化が観察され た ( F i g .8 )。. c o n t r o l. Gl. G2. G3. G4. Hl. H2. F i g .8 .B a c t e r i a lg r o w t ho fi s o l a t e ds t r a i n sf r o mt h eK 3c o n s o r t i u mi nmediumw i t h ・. c r u d ep e t r o l e u m .. そこで、培養液に残存している重油を抽出後、 TLC /FID で 分 析 し 、 生 分解率を求めたところ、 5株 ( Gl、 G2、 G4、 H1、 H2株 ) は 重 油 の 飽 和 " " '50 %分解していたが、生育の認められ 画 分 と 芳 香 族 画 分 を 7 日間で 30. h r o p iG3株 は 、 ほ と ん ど 分 解 し な か っ た ( F i g .9) 。 また なかった 0 .ant 5株 は 、 芳 香 族 画 分 を 唯 一 の 炭 素 源 と す る 培 地 で 培 養 す る と 生 育 し な か っ. た。 しかし、飽和画分と芳香族画分を共に添加して培養すると、重油を炭 素源としたときと同じ分解率を示し、 K3群 と 同 様 に 芳 香 族 画 分 の 分 解 に 飽和分を要求した 。 この結果から、 Pseudomonas属が K-3群 の 優 勢 種 の 1つで、 K-3群の 重油分解に大きな役割を果たしていると考えた。 しかし、重油分解能の低い G3株も、 K-3群の重油を生分解するときに、 何らかの役割を果たしているのではなし、かと考え、 G3株単独と、 G3株と. Gl から H2株 と を 組 み 合 わ せ て 混 合 培 養 し 、 分 解 率 を 測 定 し た 。 その結. 23.
(27) 果、混合培養したときの分解率は、各菌を単独培養したときの生分解率と ほぼ同じ値を示した ( F i g .1 0 )。これらの結果から、 O .anthropiG3株 は 重 油の生分解には直接関与していないことを明らかにすることができた。. 訳 、 ( . 〆. 8 0. 告 相 E60 吾 国 品 畠 E 。 個 悶 4 0 2 0. 。. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. F i g .9 .Degradationofs a t u r a t e danda r o m a t i chydrocarbonsbyt h eK-3consortium andt h ei s o l a t e ds t r a i n si nt h emediumsupplementedwithc r u d epetroleum( 1 0g / l ) . R e s u l t sa r ee x p r e s s e da st h emean土 SD( n= 3 ) . 1 ，s t r a i nGl; 2，s t r a i nG2; 3， s t r a i nG3;4，s t r a i nG4，5，s t r a i nHl;6，s t r a i nH2;7，m i x t u r eofsixi s o l a t e ds t r a i n s ; h e K 3c o n s o r t i u m . White b a r，s a t u r a t e dh y d r o c a r b o n ; Blackb a r，a r o m a t i c 8，t ・. h y d r o c a r b o n .. Komukaiら 30)は、飽和炭化水素と芳香族炭化水素の生分解において、. Pseudomonasputida と Acinetobacters p . を混合培養すると、単独培養 のときよりも飽和炭化水素と芳香族炭化水素の生分解率が上昇したと報. .aeruginosaが 告している。しかし、今回確立した K-3群では、複数の P cinetobacters p .のよ 重油生分解に主要な役割を果たしており、 G3株 は A. . aθruglnosaが うに重油の分解には積極的に関与しているのではなく、 P 分解した分解物を代謝していると推測している。. 24.
(28) 、角. ト. L. 削. 除 通. ω 冨. ω. . C 60. ロ 匂圃. ω. E40. ~. s ao e 暗. 唱. ω. 20. 唱. Gl. G2. G4. Hl. H2. F i g .1 0 .D e g r a d a t i o no fs a t u r a t e da n da r o m a t i c h y d r o c a r b o n s by t h ec o m b i n a t i o no fs t r a i n G3 ando t h e ri s o l a t e ds t r a i n .. 2 5.
(29) 4 . まとめ 秋田県や新潟県の各油田から採取した重油汚染土壌から重油生分解能 の高い微生物群集をスクリーニングした結果、黒川油田から採取した試料. ( K 3 )を 添 加 し た 集 積 培 養 液 に 重 油 の 可 溶 化 と 分 散 が 認 め ら れ 、 継 代 培 養 を繰り返しても重油中の飽和画分と芳香族画分が安定して分解された。 次 に 、 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ ト で 重 油 を 4つの画分に分画した。得ら れた飽和画分と芳香族画分をエネルギー・炭素源とした培地を用いて分解試験を 行ったところ、 K-3群 は 7 日間で飽和画分を 40% 分 解 し た が 、 芳 香 族 画 分 は. 2 ' " " 3% し か 分 解 し な か っ た 。 と こ ろ が 、 芳 香 族 画 分 に 飽 和 画 分 を 添 加. して 7 日 間 培 養 す る と 、 芳 香 族 画 分 の 分 解 率 は 20 % ま で 上 昇 し た. O. 培養液中に残存した炭化水素を GC 分析すると、 K-3 群は C lO ~C35 の飽. 和炭化水素を均一に分解していた。また、 K-3群 を 飽 和 画 分 と 芳 香 族 画 分 添加培地で培養すると、飽和画分のピークだけでなく、芳香族画分のピー クも減少していることを確認することができた。. xtractを添加しても、 K-3群 に よ る 芳 香 族 飽 和 画 分 の 代 わ り に Yeaste 画分の分解率が上昇した。これらの結果から、 K-3群 は 芳 香 族 画 分 を 分 解. x t r a c tの よ う な 補 助 基 質 を 必 要 と す る こ と す る と き 、 飽 和 画 分 や Yeaste を明らかにした。. K-3群 培 養 液 を DGGE解析した結果、 5本のバンドを検出した。また、. R2A寒 天 培 地 を 用 い て 、 形 態 の 異 な る 6個 の コ ロ ニ ー を 分 離 し た 。 分 離 株の. 1 6 8rRNA遺伝子の塩基配列と生理・生化学的性状をもとに、 G1、. G2、 G4、 H1、 H2株 は P .aeruginosa、 G3株 は Ochrobactrumanthropi と同定した。分離株の重油生分解特性から、 P .aeruginosaと同定された 5 株が重油生分解に主要な役割を果たしていると考察した。 本 研 究 で 確 立 し た K-3群 は 、 重 油 中 の 飽 和 炭 化 水 素 や 芳 香 族 炭 化 水 素 を 安定して効率的に生分解することができた。 K-3群 の 分 解 率 は 、 本 研 究 室 で単離してきた単一種の菌と比べると、分解の速さも分解基質の範囲もは るかに優れていた。また、自然界から重油中の飽和および芳香族画分を安 定して高分解率で分解できる微生物群集をスクリーニングする手法や保. 26.
(30) 存方法、群集構成菌の解析など、群集解析に必要な基礎技術を確立するこ とができた。 K-3群 は 、 今 後 の 環 境 浄 化 の 研 究 に 大 き く 貢 献 す る と 期 待 し ている。. 27.
(31) 第二章 芳香族炭化水素画分分解能の高い 微生物群集 No.22の確立と炭素源の変化に伴う優勢種の変動 1.緒言 重油中の飽和炭化水素は、微生物によって比較的容易に分解されるが、 発がん性をもっと言われている芳香族炭化水素は微生物にとっても分解 しにくい物質である。そのため、重油汚染事故が起こると、自然界に長期 間残留する。これまでに芳香族炭化水素を分解できる多数の微生物が単離 され、分解経路や分解酵素の遺伝子について研究がすすめられている. 31)。. これら単離微生物をメタゲノム解析すると、芳香族炭化水素の分解経路 の一部の遺伝子しか保有しないことや、発現していないことが明らかとな ってきた. 32)。 こ れ ら の 結 果 は 、 こ れ か ら の 環 境 浄 化 分 野 で は 、 群 集 内 の. 微生物が果たす役割と微生物聞の相互作用を解明することが必要である ことを示している。さらに、安定した微生物群集を育成し、長期間維持・ 保存する技術や、その系を構成する微生物種を解析する手法を確立するこ とも必要になってくる。 近年、広く用いられているパターン・多様性解析法のひとつである. DGGE法は、対象遺伝子を PCR増幅後、核酸二本鎖変性剤(尿素、ホルム アミド)の濃度勾配を形成させたポリアクリルアミドゲ、ルで、電気泳動する と、配列の異なる DNA 分 子 は 部 分 解 離 す る 変 性 剤 濃 度 が 異 な る た め 、. DNAの 移 動 度 が 異 な り 分 離 す る こ と が で き る. 33)。 こ の 他 に 、 環 境 中 の 微. 生 物 群 集 か ら 抽 出 し た DNAか ら リ ボ ソ ー ム DNAを ク ロ ー ン 化 し 、 複 数 種の混合状態にあった遺伝子を単ーとして取得し、数十から数千のクロー ンのライブラリーを構築するクローンライブラリー法. 34)や 、 特 定 の 菌 種. または菌株に対して特異的なプライマーを設計し、リアルタイム. PCRを. 行 う と 最 初 の DNA量 と 増 幅 回 数 か ら 群 集 中 で 特 定 の 菌 種 や 菌 株 の 相 対 的 な割合を求めることができる. 35)0. S e k i g u c h iら 28. 3 6 )は 、 水 中 に 生 息 す る 微.
(32) 生物群集の構成比率をクローンライブラリー法により明らかにしている。 本章では、芳香族画分を高効率で分解する微生物群集を新たにスクリー. o.22群を確立した。次いで、 PCR-DGGE法 、 ク ロ ー ン ラ イ ニングし、 N ブ ラ リ ー 法 、 そ し て リ ア ル タ イ ム PCR法 を 用 い て No.22群 を 構 成 す る 微 生物の比率を明らかにした。その結果、 No.22群 を 飽 和 炭 化 水 素 画 分 お よ び芳香族炭化水素画分を炭素源とした培地で培養すると優勢種が異なる ことを明らかにした。また、それぞれ優勢種の芳香族炭化水素や飽和炭化 水素に対する分解特性を明らかにして、優勢種が変動した理由の一部を明 らかにした。. 29.
(33) 2 .実 験 材 料 お よ び 実 験 方 法 2 . 1試料および集積培養 2 1試料)と西山油田 芳香族画分分解微生物群は、新潟県にある東山油田 (. ( 3 2試料)から採取した原油汚染土壌 53試 料 か ら 分 離 し た 。 芳 香 族 画 分 を 4 . 0g l l添加した無機塩培地(蒸留水 1000mlあたり、 N H4 Cl，2 . 5g ;KH2P04 ， 1 .0g ;K2HP04，0 . 5g ;MgS04・7H20，0 . 5g ;NaCl，2 . 0g ;ZnCb，0 . 0 1g ;. FeS04・5H2 0，0 . 0 1g ;CaCb，0 . 0 1g，pH7 . 0 )に 試 料 を 加 え 集 積 培 養 ( 3 7C， 0. 125 stroks/min)し た 。 分 解 基 質 の 芳 香 族 画 分 は 、 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム を 用 いて重油から分画した。集積培地には、菌叢の安定化を図るために多孔質. hibata-engeiL t d .，Tokyo，Japan) を 4 0 . 0g / l添 性セラミック (ψ3m m，S 加した。 集 積 培 養 7日 後 、 芳 香 族 画 分 が 可 溶 化 ・ 分 散 し た 培 養 液 を 新 し い 集 積 培 地に継代培養した。継代培養を繰り返しても、芳香族画分が可溶化・分散 し た 培 養 液 に 残 存 し て い る 芳 香 族 画 分 を TLC/FIDで 定 量 し た 。 一 方 、 安 定して高い分解率を示した集積培養液を芳香族画分分解能の高い微生物 群集として選出した。確立した微生物群集は、継代培養を繰り返して維持. ( v / v )グ リ セ ロ ー ル 溶 液 に 懸 濁 し て -80Cで 凍 結 保 存 するとともに、 10 % 0. した。. 3員 環 芳 香 属 炭 化 水 素 の フ ェ ナ ン ト レ ン ( C 1 4 )や ア ン ト ラ セ ン ( C 1 4 )、4員 環 の ピ レ ン (C16)お よ び 芳 香 族 炭 化 水 素 代 謝 中 間 体 と し て 選 出 し た カ テ コ ール、 1 -Hydroxy-2-Naphthoic acid(lH2N)、サリチル酸、. 0・フタル酸、. C1S ， C1S-ム コ ン 酸 、 ゲ ン チ ジ ン 酸 は 、 和 光 純 薬 株 式 会 社 ( Wako，Osaka，. Japan)よ り 購 入 し た 。 飽 和 炭 化 水 素 に は エ イ コ サ ン ( C 2 0，Wako)を使用し た 。. 2 . 2 .炭 化 水 素 の 分 解 試 験 NO.22 群 と 単 離 株 を 芳 香 族 画 分 や 飽 和 画 分 を 単 独 ま た は 混 合 添 加 し て 培養したときの分解率を測定した。測定方法は、第一章と同様の方法で行. . 0mlに フ ェ ナ ン ト レ ン 、 ア ン ト ラ セ ン 、 ピ レ った。また、無機塩培地 5 3 0.
(34) ンをそれぞれ 60 mg/l単独添加した培地と、 0.12g / lの芳香族画分と共に 添 加 し た 培 地 に 7 日間前培養した No.22群 培 養 液 を 500μI移種し、 37 o C で 振 と う 培 養 (125strokes/min)した。 GC分析の試料は、培養 0，7，14，. 21 日目の培養液に、内部標準物質として 0 . 6g / lの n-ヘキサトリアコンタ 6 : 4 ( v : v )15mlで 残 存 し て い る 炭 ンを1.0ml添加し、 n-ヘキサン:トルエン / 化水素を抽出し、減圧乾固後、抽出溶媒で 5 . 0 mlに メ ス ア ッ プ し て 調 整 した。. 2 . 3 . ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー (GC)分 析 飽 和 お よ び 芳 香 族 画 分 の GC分析は、第一章の方法に従って行った。ア ントラセン，フェナントレン，ピレンを分析するときは、カラムオーブン 0 0 0 o 温 度 を 初 期 温 度 40Cから 40C/minで 120Cまで昇温し、続いて 8C/min 0. で 300Cま で 昇 温 さ せ た 。 注 入 口 の 温 度 は 300C、 検 出 器 の 温 度 は 320C 0. 0. に設定した。. 2. 4 .No.22群 構 成 菌 の 分 離. 2.4.1.芳香族画分の乳化 ク ロ ロ ホ ル ム に 溶 解 し た 芳 香 族 画 分 を 5 %(v/v)PlysurfA-210G 溶 液. (Dai-ichi-KogyoSeiyakuCo.，Ltd.，Kyoto，Japan)に添加し、ホモジナイ ザ ー で 激 し く 撹 祥 (10000rpm，30s e c )して乳化した。乳化液を漏過した後、 0. 80Cに 保 っ て ク ロ ロ ホ ル ム を 除 去 し た 。 得 ら れ た 溶 液 は 1 %(w/v)芳 香 族 0. 画分乳化液として、 4Cで保存した。. 2. 4. 2 .分 離 培 地 と 純 粋 分 離 NO.22群培養液からコロニーを分離するために、 1%(w/v)芳 香 族 画 分 乳 . 3%(v/v)と な る よ う に 添 加 し た 無 機 塩 ア ガ ロ ー ス 平 化液を芳香族画分が 0 板培地を作成した。アガロースは1.5%(w/v)アガロース S(Wako)を使用し た 。 No.22群 培 養 液 を 生 理 食 塩 水 で 10倍 段 階 希 釈 し て 平 板 培 地 に 50μl 0. 塗抹し、 37Cで 7 日以上培養した。そして、形態の異なるコロニーを選抜 した。分離したコロニーが均ーであることを確認した後、供試株とした。. 3 1.
(35) 2 . 5分 離 株 の 同 定 分 離株 は 、 形 態 学 的 、 生 理 ・生化学的性状と 168rRNA遺 伝 子 の 塩 基 配 列 か ら 同 定 し た 。 分 離 株 の う ち Y1 と Y4株 は 、 第 1章 に 記 述 し た 方 法 で 同定し、 Y3株は一部追加試験を行った。. 2 . 5 .1 .Y3株 の 形 態 学 的 及 び 生 理 ・ 生 化 学 的 特 徴 Y3株 ( Hyphomicrobiumf a c i l e )を供試株として、 C1化 合 物 の 資 化 性 を 検 討 し た o C1 化合物には、メタノーノレ (CH30H)、 メ チ ル ア ミ ン 塩 酸 塩. (CH3NH2・ HCl)、メタンスルホン酸 (CH3 803H)を 用 い 、 無 機 塩 平 板 培 地 に 塗 布 し た 。 そ し て 、 芳 香 族 画 分 添 加 無 機 塩 平 板 培 地 で 前 培 養 し た Y3株 を 植菌し、 37. o cで培養後、生育を確認した。また、. Api20や Api50CH キ. ' E t o i 1 e，France)を用いて生理・生化学的特徴や ット (Biomerieux，Marcyl 炭水化物の資化性を検討した。 Y3 株 の 形 態 学 的 特 徴 や 運 動 性 は 、 位 相 差 顕 微 鏡 (Nikon， Tokyo，Japan)と 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 ( 8-900， Hitachi. High-TechnologiesC o .T o k y o，Ja p a n )で、観察した。. 2 . 6 . クローンライブラリー法 NO.22群 培 養 液 か ら 抽 出 し た 全 DNAから、 168rRNA遺 伝 子 を PCRで 増 幅 し た 。 増 幅 し た DNAの ベ ク タ ー へ の ラ イ ゲ ー シ ョ ン 、 大 腸 菌 へ の 形. n c .，S a n t aC l a r i t a，CA， 質転換は、 QIAGENPCRCLONINGKIT(QuiagenI USA)を 用 い て 行 い 、 操 作 は キ ッ ト に 記 述 さ れ て い る 方 法 に 従 っ た 。 クローニングにより得られた組み換え大腸菌コロニーを 50~100 個選抜. し 、 201 11の 8 . P . W .を含むエッペンドルフチューブ(1. 5ml)に懸濁し、 94C 0. で 5min加 熱 し た も の を DGGE解 析 に 使 用 す る 粗 DNA試料とした。. PCR に は Amp1i Taq Go1d セ ッ ト ( P e r k i n -E1mer Japan，App1ied BiosystemsDivision，Chiba，Japan)を用い、反応液には、 10xTaqGo1d Bufferを1.51 1 1、 25m MMgCbを 1 . 51 1 1、 各 デ オ キ シ ヌ ク レ オ シ ド 3 リ ン酸(各 2 . 0mM)を1.51 1 1、各プライマー(各 101 1 M )を 0 . 31 1 1、 粗 DNAを. 0 . 51 1 1、Amp1iTaqGo1d(5U / μ1 ) を 0 . 1 1 11 、そして 8 . P . W .を 8 . 91 1 1添 加 し て 32.
(36) 全量. 15 p l の系とした。プライマーセットには、. (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'). と. M13f M13r. ( 5 ' -AACAGCTATGACCATG-3')を用いた。 サ ー マ ル サ イ ク ラ ー に は 、 My Cycler™ Thermal C y c l e r ( B i o -Rad. Laboratories，Hercules， CA，U8A)を 用 い た 。 サ イ ク ル 条 件 は 、 0 0 Pr ・ e-run(94C，7 min)を 行 っ た 後 、 熱 変 性 ( 9 4C，30 s e c )、 ア ニ ー リ ン グ ( 5 00 C，30 s e c )、 伸 長 反 応 ( 7 20 C，1 min)を 30 サ イ ク ル 行 い 、 最 後 に Post-run(720C，5min)を行った。 PCR で 目 的 配 列 が 増 幅 さ れ た こ と を 確 認 す る た め に 、 ア ガ ロ ー ス ゲ 、 ル 0 . 0g/lアガロース (Agarose8 )、バッファーは 電気泳動を行った。ゲルは 1 0.5xTAE、DNAマ ー カ ー に は λEcoT141d i g e s t(TakaraBioI n c .，8higa， Japan)を用いた。泳動後、 Ethidiumbromideにゲ、ルを 10min浸漬し、 Kodak Gel Logic 200 Imaging 8ystem (Cosmo Bio C o .，L t d .，Tokyo， Japan)を 用 い て UVを 透 過 し 、 増 幅 さ れ た DNAバ ン ド を 確 認 し た 。 得 ら れ た 増 幅 産 物 を テ ン プ レ ー ト と し て 、 V3領 域 を PCRで 増 幅 し DGGE解 析した。そして、 22群 の DNAバ ン ド と 出 現 す る 位 置 を 比 較 し 、 各 バ ン ド の 出 現 割 合 を 求 め た 。 そ し て 、 同 じ 位 置 に DNAバ ン ド を 示 す ク ロ ー ン の 配列をシーケンス解析した. O. 選出したクローンは、カナマイシンを含む. Luria Bertani (LB)培 地 で 18h培 養 し 、 組 み 換 え 大 腸 菌 の プ ラ ス ミ ド を FastplasmidMiniKit(eppendorfAG， hamburg，Germany)を 用 い て 抽 出 し、挿入配列をシーケンスした。. 2 . 7 . 定 量 リ ア ル タ イ ム PCR解 析 NO.22群 を 構 成 す る Y1や Y4株 の 168rDNAの シ ー ケ ン ス と 、 ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー で 得 ら れ た ク ロ ー ン F株 の 挿 入 配 列 か ら 、 そ れ ぞ れ に 特 異. T a b l e4 ) 3 7，3 8 )。 的なプライマーを設計した ( まず、 Y1 と Y4株 の ゲ ノ ム DNAを 抽 出 し 、 設 計 し た プ ラ イ マ ー が 特 異 的 に 働 い て い る こ と を 確 認 す る た め 、 得 ら れ た 全 ク ロ ー ン の 168rRNA配 列と Y3株 の ゲ ノ ム DNAに 対 し て 、 リ ア ル タ イ ム 定 量 PCRを行い、 Y1. 33.
(37) と Y4株 以 外 の DNAでは、全く増幅されないことを確認した。次に、 Y1 と Y4株 の ゲ ノ ム DNA濃 度 を 測 定 し 、 テ ン プ レ ー ト DNA濃度 10ngで リアルタイム PCRを 行 い 、 添 加 DNA濃 度 と 増 幅 回 数 で ス タ ン ダ ー ド カ ー ブ を 描 い た 。 ま た 、 コ ロ ニ ー を 分 離 で き な か っ た バ ン ド F も、設計した プライマーの特異性を確認した後、 Y1 お よ び Y4株と比較するために、 バ ン ド Fの 168rRNA遺 伝 子 が 挿 入 さ れ た プ ラ ス ミ ド DNAを テ ン プ レ ー トとして、 PCRで増幅し、増幅産物の濃度と増幅断片の平均分子量から、 増幅された断片の数をコピー数として算出した。 Y1 と Y4株についても、 同じ方法でコピー数を求めた。そして、コピー数 108copys/ngでリアルタ イム PCRを行い、添加した 168rDNA量 と 増 幅 回 数 で ス タ ン ダ ー ド カ ー ブを描いた。. T a b l e4 .P r i m e r su s e df o rq u a n t i t a t i v er e a l t i m ePCRi nt h i ss t u d y . Primer. Sequence( 5 ' 3 ' ). E .c o / ip o s i t i o n. YI-2F YI-2R Y4-1F Y4-1R DF-IF DF-IR. ACCTACCCTTGACATGTAC CATGCAGCACCTGTGTTA ACATCGGAACATGTCCTG CCATCGGCCAACCCTAT CATTCGATACTGGCTCGC AGTGTTGGTCCAGGAAG. 9 8 2 1 0 0 1 1 0 5 5 1 0 3 8 1 2 1 1 3 8 2 3 8 2 2 2 6 3 3 6 5 0 7 5 0 7 3 4. 飽 和 お よ び 芳 香 族 炭 化 水 素 画 分 を 炭 素 源 と し て 培 養 し た No.22 群 の 培 養液から DNAを抽出し、 10ngに 調 整 し た も の を テ ン プ レ ー ト と し て 定. LightCycler，RocheDiagnostics，Tokyo，Japan)、 で 量 リ ア ル タ イ ム PCR( -Fast8tartDNAMaster8YBRGreen1を 測 定 し た 。 試 薬 は LightCycler ightCycler-Fast8tart DNAMaster 8YBR 使用した。反応液の組成は L {RocheD iagnostics)を 21 1 1、 25m MMgCbを 2. 41 1 1、 10pmo1/μl GreenI プ ラ イ マ ー を 各 11 1 1、そして d i s t i l l e dwaterを添加して 181 1 1とした。. 1 1添 加 し た 。 バ ン ド Fの時だけ 25m MMgCbを 3 . 21 1 1 最後に DNAを 21 添加した。. 34.
(38) 0. リアルタイム定量 PCRの条件は、最初 95Cで 10min変性させたあと、 0. 1サ イ ク ル を 95Cで 15s e c、 68Cで 6s e c、 72Cで 20s e cの 条 件 で 35サ 0. 0. イクル行った。蛍光強度は、各サイクルの後に測定した。温度 t r a n s i t i o n は 20C/secで 、 ア ニ ー リ ン グ は 2C/secで行った。 PCR産 物 が 特 異 的 に 0. 0. 増幅されていることを確認するために、 meltingcurve を解析した。 95C 0. 0. で変性後、 70Cで 15s e cアニーリングし、 0 . 1C/secの 温 度 勾 配 で 95Cま 0. 0. で温度を上げながら、蛍光強度を測定した。. 2 . 8 .単離株の芳香族炭化水素分解経路の推定 2 . 8 . 1資化性試験 単離株の資化性は、フェナントレン分解経路中間体を唯一の炭素源とし て 添 加 し た 無 機 塩 培 地 で 培 養 し て 生 育 を 確 認 し た 。 供 試 株 に は Y1 と Y4 株を用い、基質には、カテコール、 1H2N(2 %[ v / v ]エタノールに溶解)、 サリチル酸、. 0・フタル酸、. ClS タC l S -ム コ ン 酸 、 ゲ ン チ ジ ン 酸 を. 0 . 1m Mにな. るように添加した。前培養は、芳香族画分 ( 2g /l)添加改良 R2A培地で、 37C 0. で振とう培養 ( 1 8 h，125 strokes/min)し た 。 得 ら れ た 菌 体 を 50 m M. Tri s -HC1buffer(pH7 . 5 )で 2回 洗 浄 し 、 同 b u f f e rで1.5m1に懸濁した。 1 1植 菌 し 37o Cで振とう 本培養は、各基質を添加した無機塩培地に、 1001 2 4h，125strokes/min)して生育を観察した。 培養 ( 2 . 8 . 2 .HPLCに よ る 代 謝 産 物 の 測 定 供試株と基質の調製、前培養は資化性試験( 2 . 8 .1)に従った。本培養は、. Yeast e x t r a c t ( 0 . 5 g/l)を加えた無機塩培地に各基質を分注した後、 Y1 と Y4株 を 1001 1 1植菌し、 37Cで 0，1，2 日間振とう培養 (125strokes/min) 0. し た 。 ま ず 、 酢 酸 エ チ ル 5m1で培養液を抽出し、次いで、 1N HC1で培 養 液 を pH2 . 0に調整した後、再度酢酸エチルで、抽出し、減圧乾固した。 こ れ を メ タ ノ ー ル 5m1に溶解し、 HPLCサ ン プ ル と し た. 39)。. HPLC 分 析 に は 逆 相 C18 カラム (COSMOSIL5C18・ AR-I I、 Nakarai TesqueI n c .，Kyoto， Japan)を用いた。移動相には 0 . 2% ( v / v )酢酸水とメタ ( v / v )になるよう ノールを用い、 40minで メ タ ノ ー ル 量 が 10%から 90% 35.
(39) にグラジエントをかけ、その後 10min間 メ タ ノ ー ル 100% ( v / v )で、流した。. ( v / v )に な る よ う に グ ラ ジ エ ン ト を さらに 10 min間 で メ タ ノ ー ル が 10 % /min、溶出物は UV254nmで検出した。 HPLCは 、 かけた。流速は1.0ml. l i t eLaChromを用いた 株式会社目立ハイテクノロジーズの E. O. 2 . 8 . 3 .酸素消費量の測定 供試株と前培養は資化性試験( 2 . 8 . 1 )に 従 っ た 。 基 質 は カ テ コ ー ル と. 1H2Nを 用 い た 。 酸 素 消 費 量 は HansatechOxygraph(KyokkoTrading c o .， l t d，Tokyo，Japan)を用いて測定した。本培養は、芳香族画分 ( 4 . 0g /l ) 添 加 改 良 R2A培 地 を 振 と う 培 養 フ ラ ス コ 4本に 50ml添 加 し 、 前 培 養 し た 8h，125 供試株懸濁液を1.0ml植菌した後、 37Cで 振 と う 培 養 ( 0. strokes/min)し た 。 対 数 増 殖 後 期 の 培 養 液 50mlを集菌 (3000rpm， 15 、 50m MTris-HClbuffer(pH7 . 5 )で 2回洗浄した後、 3mlの Buffer min)し で 懸 濁 し た 。 こ の 懸 濁 液 の OD61Oを測定した後、飢餓培養 ( 2h、 37C )を 0. 行った。菌懸濁液1.5mlを反応容器に加え、 35Cでプレインキュベート 0. し て 溶 存 酸 素 濃 度 が 安 定 し て い る こ と を 確 認 し た 。 こ れ に 10m Mの 基 質 を 15p l添加して、酸素消費量を記録した。. 2 . 8.4.粗酵素活性の測定 Y1 と Y4株の分解酵素活性は、生成物の色調の変化や、基質の減少、 補酵素の増減を吸光度で測定した。菌体は、芳香族画分添加無機塩培地で 培 養 、 集 菌 洗 浄 し て PBS緩 衝 液 に 懸 濁 し た 。 粗 酵 素 溶 液 は 、 菌 体 懸 濁 液. 4C，1min，5c y c l e s20kHz)し、遠心分離(15000rpm，4C， を超音波処理( 0. 0. 30min)して上清を回収した。 . 9mlに各基質を 0 . 1ml添加し、 37Cで 30 各分解酵素は、粗酵素溶液 2 0. mln反応させた後、反応液の吸光度を測定して酵素活性の有無を確認した。 測 定 し た 酵 素 と 基 質 、 測 定 波 長 を Table5にまとめた. 40-47)。. Naphthalene dioxygenaseと Catechol2， 3-dioxygenaseは 、 基 質 を 添 加した平板培地で培養して、コロニ一周辺の色調の変化を観察した. O. Naphthalene dioxygenase は 、 1m M の イ ン ド ー ル を 添 加 し た 1 .0 g / l Yeast e x t r a c t添加無機塩平板培地で培養した。インドールが. 36.
図
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