ま 25

自 ー

自 自

. 

。

0.1  0.2  0.3  0.4  0.5 

。

0.1  0.2  0.3  0.4  0.5  added (ml)  added (ml) 

Fig.  25.  The  cell‑surface  hydrophobicity  of Pandoraea  sp.  Yl  (a)  and  B.  multivorans Y 4 (b)  was measured by adherence to  hydrocarbons， n‑hexadecane  (0)， n‑octane (ム)and xylene (口).

3.10.単 離 株 に よ る 芳 香 族 画 分 の 分 解 と 分 解 経 路 の 推 定 3.10.1.芳香族画分の分解

No.22群 か ら 分 離 し た Y1 と Y4株 は 、 芳 香 族 画 分 を 17‑18 %分解した。しかし、

こ れ ら の 値 は No.22群 の 分 解 率 よ り 低 か っ た 。 ま た Y3 株 は 、 芳 香 族 画 分 を ほ と ん

ど 分 解 し な か っ た(Fig.26)。 また、 Y1とY4株 は 、 フ

ぷ (、・

4

60 

対

。^圃

。

No.22  Yl  Y3  Y4  ェ ナ ン ト レ ン(60mg/l)を唯 Fig. 26. Efficiency of degradation by the NO.22  ー の 炭 素 源 と す る 無 機 塩 培 consortium  and  the  isolated  strains  in  the  地 で 培 養 す る と 、 ほ と ん ど medium with the aromatic hydrocarbon fraction  分 解 し な か っ た 。 と こ ろ が (4  g/l).  Results are  expressed as  the mean^土 補 助 基 質 と し て 1 ^g /1 の SD (n ⁼ 3). 

Yeast extractや 0.12g/lの 芳 香 族 画 分 添 加 し て 7日間培養すると、 No.22 群 と 同 じ よ う に GC分析検出限界レベルまで分解した。

これらの結果は、 Y1と Y4株 の 芳 香 族 画 分 分 解 に は 補 助 基 質 を 要 求 す

るものの、分解能力は同程度で、 No.22群 の 芳 香 族 炭 化 水 素 の 分 解 に 2株 が大きな役割を果たしていることを示している。また、 Y3株はメチロト

ローフ細菌で、芳香族画分をほとんど分解しなかったことから、芳香族炭 化水素の分解には直接関与していないことを明らかにした。

Burkholderia属 は 、 芳 香 族 炭 化 水 素 や ダ イ オ キ シ ン 類 な ど を 分 解 す る 微 生 物 と し て 環 境 中 か ら 多 数 単 離 さ れ て い る o Burkholderia  cepacia  VUN 10001は、フェナントレンやピレン(100mg/l)を唯一の炭素源とし、

7日 間 で 検 出 限 界 レ ベ ル ま で 分 解 で き る 高 い 能 力 を 示 し た 57)。Pandoraea 属は、 γ ‑hexachlorocyclohexane Oindane)や endosulfanなど、ダイオ キ シ ン 類 を 分 解 す る 微 生 物 と し て 報 告 さ れ て い る 58，59)が、芳香族炭化水素 を分解するという報告や、群集から分離され分解活性を測定した報告はな い 。 芳 香 族 炭 化 水 素 を 基 質 と し て 培 養 し た 培 養 液 を

DGGE

解 析 し 、 出 現 したDNAバンドが Pandoraea属 と 近 縁 で あ っ た と い う 報 告 し か な か っ た

60)。また、 Hyphomicrobium属 が 芳 香 族 炭 化 水 素 を 分 解 し た 報 告 は な か った。

3.10.2.資 化 性 試 験

3員環芳香族炭化水素であるフェナントレンの代謝経路は、大きく 4つ の経路が報告されている 31)。まず、芳香環の 1位と 2位 の 炭 素 が ジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ に よ っ て 酸 化 さ れ る こ と か ら 分 解 が 始 ま る O そして、

1‑hydroxy‑2‑naphthoate (lH2N)まで分解されると、 0・フタル酸を経てプ ロトカテキュ酸へと分解されるフタル酸経路と、サリチル酸へと分解され る経路に分かれる。サリチル酸からは、さらにゲンチジン酸へと分解され る経路と、カテコールへと分解される 2つの経路に分かれ、カテコールか らもメタ開裂、オルト開裂により分解経路が分かれる 31)(Fig.27)。例外と して、 A分hingomonas属では、フェナントレンの 3位と 4位 の 炭 素 が 酸 化 される代謝経路が報告されている 61)。本研究では、 Y1や Y4株 で Fig.27 に示した 4つ の 経 路 の 存 在 を 代 謝 中 間 体 の 資 化 性 と 酵 素 活 性 か ら 検 討 し た。

55 

最初に、それぞれの代謝中間物質を唯一の 炭 素 源 と し て 添 加 し た 無 機 塩 培 地 に お け る 生 育 を 検 討 し た。1H2Nは水に難溶であるため、エタノール に溶解して資化性を検討した。Y1株 は 1H2Nを炭素源とする培地に生育 したが、コントロールのエタノール添加培地にも生育し、培養液の濁度は ほぼ同じだった。その他の供試中間体は資化することができなかった。一 方、 Y4株 は い ず れ の 代 謝 経 路 中 間 体 も 資 化 で き ず 、 エ タ ノ ー ル も 資 化 で

きなかった。

No.22群 や Y1、Y4株は、芳香族画分(0.12g/l)や YeastExtract (1.0 g/l)  を培地に添加するとフェナントレンを分解することができた。

acetyl‑CoA 

Fig. 27. Proposed catabolic pathway of phenanthrene and naphthalene degradation  in general. 

そ こ で 無 機 塩 培 地 に Yeastextractを 0.5g/l加えて培養したところ、 Y1 とY4株共に生育した。次に、 Yeastextractと 代 謝 中 間 体 を 添 加 し た 無 機 塩 培 地 に Y1とY4株を培養し、 HPLCを 用 い て 代 謝 中 間 体 の ピ ー ク の 減 少を調べた。その結果、 Y1株 は 培 養 1日で、サリチル酸と 0・フタル酸、

ゲ ン チ ジ ン 酸 の ピ ー ク を 検 出 限 界 ま で 減 少 さ せ た が 、 カ テ コ ー ル や

Cl瓦C1S‑ム コ ン 酸 は ほ と ん ど 減 少 し な か っ た(Table7)。また、 Y4株 で は 培 養 1日後に、カテコール、サリチル酸、 C1S，C1S‑ムコン酸、ゲンチジン酸の ピークが減少していた。 1H2Nの ピ ー ク は 、 今 回 の 分 析 条 件 で は 確 認 す る こ と が で き な か っ たo 0‑フタル酸のピークは、 Y1株 で 減 少 し た が(Fig. 28‑b)、Y4株 で は 減 少 し な か っ た(Fig.28‑c)。カテコールは、 Y1株 を 1日 培養すると r.t.13.44 minに 新 た な ピ ー ク が 出 現 し た が(Fig.29・b)、Y4株 で は カ テ コ ー ル の ピ ー ク が 消 失 し て い た(Fig.29‑c)。

これらの結果から、 Y1株はフェナントレンを、フタノレ酸とゲンチジン 酸およびカテコールを経る経路で分解することが、一方、 Y4株はカテコ ー ル と ゲ ン チ ジ ン 酸 を 経 る 分 解 経 路 で 分 解 す る こ と が 示 唆 さ れ(Fig. 31)、 両株のフェナントレン分解経路は一部異なることを示した。

Table 7. Substrate degradation pa erns of bacterial isolates by HPLC. 

substrate 

strain  catechol  lH2N※  salicylates  ^C1S，C1S ‑

。

^{‑phthalicacid muconic acid} 

Pandoraea sp. Yl 

+ 

^NT 

+  + 

B. Multivorans Y 4 

+ 

^NT 

+ 

+

，

  decreased a peak of substrate，一not decreased a peak substrate ; NT， not tested 

※1・Hydroxy‑2・Naphthoicacid 

57 

+ 

+ 

gentisic acid 

+ 

+ 

S 20

「

^(a)

、E・d

20 

r 

(b)  ²⁰ 

r 

^(c) 

4a‑= e a 

10ト 10ト 10 

‑自由!:: 

'

"

 

。

明白a 

。

uョ

。

10  20  30 

。

10  20  30 

。

10  20  30  Retention time (min) 

Fig. 28. HPLC analysis of extracts from the culture solutions of strain Yl (b)， and  strain  Y4 (c)， and the control  (a). The  isolates  were  cultured  in  medium  supplemented with the o‑phthalic acid for one day.  The medium was used as the  control. 

c"'  10 

~

‑ I 

(a)  .c 

:  5 

!0 : 

同 調

~ 0 

uョ

。

10 

5 

。

10  20  30 

。

10  (b)  (c) 

5 

' ^F 

。

10  20  30 

。

10  20  30  Retention time (min) 

Fig. 29. HPLC analysis of extracts from the culture solutions of strain Yl (b)， and  strain  Y4 (c)， and the control (a). The isolates were  cultured in  medium  supplemented with the catechol for  one day.  The medium was used as the  control. 

3.10.3.酸 素 消 費 量 の 測 定

フェナントレンが lH2Nやカテコールを経て代謝されるとき、 lH2Nジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ や カ テ コ ー ル ジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ な ど の 酵 素 が 働 い て、酸素 を消費することが報告されている 46，62)。そこで、 Ylや Y4株 懸 濁 液 に lH2Nや カ テ コ ー ル を 添 加 し て 、 酸 素 が 消 費 さ れ る か 検 討 し た。

Y1株 は 1H2Nを基質としたとき、酸素を消費したが、1H2Nを溶解し ているエタノールを添加したときも、閉じ傾きで酸素を消費した。これよ り、 Yl株 は lH2Nではなくエタノールを分解して酸素を消費していると 考えた。

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•

•

•

•

•

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•

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•

•

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•

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•

•

白HO

a o  

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100 

︒自

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岡

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︒

カ テ コ ー ル を 基 質 と し 次に、

たとき、Y4株 の み で 顕 著 な 酸 素 dry  nmol/min/mg  消 費 (11.2

子

、ーー

cells)が 認 め ら れ た(Fig.30)。

400  (sec)  consumption  III 

300  200 

Time  100 

。

カ テ コ ー ル 添 加 培 地 の結果は、

で Y4株 を 培 養 す る と ピ ー ク が

the  Oxygen 

30.  Fig.  減 少 し た 資 化 性 試 験 の 結 果 を 支

Yl  with  the  catechol  by  strain  suspenslOn 

持した。一方、 Y1株 で は 酸 素 消

Ata  point  indicated  an  arrow， the  catechol  was  (dashed line) and strain Y4 (solid line). 

費を確認できなかったが、 資化 性 試 験 で カ テ コ ー ル の ピ ー ク が

減 少 し 新 た な ピ ー ク が 出 現 し た こ と か ら 、 酸 化 反 応 と は 異 な る 反 応 で カ テ コールを分解していることが示唆された。

3.10.4.酵素活性試験

Y1や Y4株 の 菌 体 破 砕 液 上 清 を 粗 酵 素 溶 代謝中間体分解酵素活性は、

液 と し て 用 い 、 資 化 性 試 験 で 示 唆 さ れ た 結 果 を 酵 素 活 性 で 確 認 し た 。 酵 素 活 性 は 、 基 質 や 生 成 物 、 補 酵 素 の 増 減 を 各 波 長 で 測 定 し 、 増 減 を 確 認 し た (Table 5)。

Salicylate hydroxylase活 性 は Y1とY4株ともに認められたことから、

サ リ チ ル 酸 か ら カ テ コ ー ル へ 分 解 す る 経 路 の 存 在 を 確 認 す る こ と が で き た。カテコールを基質として Catechol 1，2 ‑dioxygenaseの 活 性 を 測 定 し た とき、 Y4株で吸光度が顕著に上昇し、活性を確認できたが、 Y1株 で は 吸 カ テ コ ー ル 経 路 の 光度が安定しなかった。 Catechol 1，2 ‑dioxygenaseは、

カ テ コ ー ル の メ タ 開 裂 を 行 う 方オ ル ト 開 裂 に 関 わ る 酵 素 で あ る 。

カ 一 ア

両株とも変化がなく、

Catecho12，3‑dioxygenaseの 375nmの値は、

も て 培 養 し

を 両 株 て

し 平 板 培 地 に 塗 抹

ノレ を

ごZ

に由来する黄色を呈しなかった。 以 上 2 ‑hydroxym uconic‑semialdehyde 

Y1  オ Y4株はカテコールをオルト開裂で分解する経路をもち、

株 は HPLCでカテコールから新たなピークが出現していることから、

59  の結果から、

ル ト や メ タ 開 裂 以 外 の 経 路 で カ テ コ ー ル を 分 解 し て い る こ と を 明 ら か に した。この結果は、資化性試験や酸素消費試験の結果とも一致 し て い た。

また、ナフタレン分解の最初に働く naphthalenedioxygenase活 性 の 有 無は、インドールを塗抹した平板培地で培養した菌体が青色を呈すること で判定した。

Y1

と

Y4

株を培養すると

Y1

株でのみ青色を呈したことから、

Y1

株 は naphthalenedioxygenaseをもつことを明らかにした。両株は異 な る フ ェ ナ ン ト レ ン お よ び ナ フ タ レ ン 分 解 経 路 を も つ こ と が 示 唆 さ れ た。

これら以外の酵素活性は、活性が弱く明確な結果を得ることはできなか った。今後は、遺伝子やタンパク質レベルで、検討する必要がある。

以上の結果から、既知のフェンナントレンやナフタレン分解経路を参考 に、

Y1

と

Y4

株 の 芳 香 族 炭 化 水 素 分 解 経 路 を 示 し た

( F i g . 3 1 )

。

protocatechuic acid 

Fig. 31. Proposed catabolic pathway of phenanthrene and naphthalene degradation in  genera1.  Presumed pathway of strain  Y 1 and Y 4 was showed as  the red arrow  (strain Yl)， blue arrow (strain Y4)， and striped arrow (strain Yl and Y4). 

4.まとめ

重 油 中 の 芳 香 族 炭 化 水 素 を 安 定 し て 、 高 効 率 で 分 解 で き る 微 生 物 群 集 を 新 た に ス ク リ ー ニ ン グ し て No.22群を確立した。 NO.22群は、芳香族画分 を 7日間で 30% 分 解 し た 。 難 分 解 性 の 芳 香 族 炭 化 水 素 と 無 機 塩 を 含 む 培 地で良好に生育し、分解できる No.22群 を 確 立 で き た こ と は 、 汚 染 重 油 を 生 分 解 す る 実 用 的 な 研 究 へ 発 展 さ せ る た め に も 重 要 な 成 果 と 言 え るO

No.22群 培 養 液 を PCR‑DGGE解析すると、 14本の DNAバ ン ド が 検 出 さ れ たo DNAバ ン ド を 解 析 す る と 全 て グ ラ ム 陰 性 菌 で 、 Alphaや Gammaproteobacteria 以 外 に 、 K‑3 群 で は 検 出 さ れ な か っ た Betaproteobacteriaの存在が確認され、多様な菌種で構成されていること

を明らかにした。しかし、 NO.22群 か ら は 構 成 菌 3株(Pandoraeasp. Y1、 Hyphomicrobium facile Y3、Burkholderiamu1tivorans Y4)しか分離で きなかったことから、 NO.22群には分離の難しし、(難培養性)微生物がまだ 多数存在している。

No.22群 の 芳 香 族 画 分 や 飽 和 画 分 の 分 解 率 を 測 定 す る な か で 、 芳 香 族 画 分 添 加 培 養 液 を 飽 和 画 分 培 地 に 移 植 す る と 、 飽 和 画 分 分 解 活 性 に lagtime  が出現することに着目した。この lagtime中に群集内で菌叢(優勢種)が変 動しているという仮説をたて、 PCR‑DGGE解 析 す る と 、 飽 和 画 分 で 強 く

出現する DNAバンドと逆に消滅していく DNAバ ン ド が 観 察 さ れ 、 バ ン ドパターンがはっきりと異なっていた。

さ ら に ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー 法 で 優 勢 種 の 変 化 を 定 量 的 に 調 べ る と 、 芳 香 族 画 分 で は Pandoraea属 と Brachymonas属 、 飽 和 画 分 で は Burkholderia属 の 割 合 が 高 ま っ て い た こ と か ら 、 こ れ ら の 菌 が 分 解 に 強 く関わっていることが示唆された。さらに、これら 3株 の 変 動 を 定 量 リ ア ル タ イ ム PCRで 解 析 す る と 、 ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー で 得 ら れ た 結 果 と 同 じ傾向が認められた。特に、 B.multivorans Y 4は 飽 和 画 分 で 68%と極め て高い割合で存在し、芳香族画分でも 15~30 %の比率を占めていたO一方、

Pandoraea sp. Y1の構成比率は、芳香族画分で 3%、飽和画分では 0.07% 

と非常に低かった。 Brachymonas属 は コ ロ ニ ー と し て 分 離 で き な か っ た

61 

ため、 DNAコピー数で比較した結果、 Pandoraeasp. Ylと同じ変動を示 し た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 飽 和 画 分 の 分 解 に は B.multivoransY4が、芳 香 族 画 分 で は B. multivorans Y 4 に加えて、 Pandoraeasp. Ylや Brachymonas sp. Fが重要な役割を果たしていることを明らかにした。

こ の 菌 叢 変 化 を 引 き 起 こ す 原 因 の 1つが、 Ylや Y4株 の 飽 和 炭 化 水 素 分 解 特 性 の 違 い で あ る こ と を 見 出 し た 。 飽 和 画 分 培 地 に Y4株 を 培 養 し て GC解析すると、飽和炭化水素は均一に減少したが、 Yl株 を 培 養 す る と ほ と ん ど 減 少 し な か っ た 。 ま た 、 無 機 塩 培 地 に エ イ コ サ ン(C20)を 1g/l添加 して分解率を測定しても、 Y4株はほぼ完全に分解したが、 Yl株 は ほ と ん ど分解できなかった。さらに、 Y4株 は オ ク タ ン や ヘ キ サ デ カ ン に 高 い 親 和性を示して炭化水素層に菌体が移動して、菌懸濁液の濁度が 20~50 %  減少したが、 Yl株 は 飽 和 炭 化 水 素 に 親 和 性 を 示 さ な か っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 飽 和 炭 化 水 素 に 対 す る 親 和 性 と 分 解 能 力 の 違 い が 、 飽 和 画 分 培 地 で菌叢変化を引き起こしている原因であることを明らかにした。

さらに、 Ylと Y4株 の 芳 香 族 炭 化 水 素 分 解 経 路 が 異 な っ て い る こ と を 明らかにした。 Ylと Y4株 は 、 飽 和 炭 化 水 素 に 対 す る 親 和 性 や 分 解 経 路 など異なっている点もあるが、 2株 は 群 集 内 で 互 い に 補 い な が ら 芳 香 族 炭 化水素を分解していると推察している。

本 章 で は 、 分 子 生 物 学 的 手 法 を 活 用 し て 、 群 集 を 構 成 す る 菌 種 の 同 定 、 さらに異なった環境下におかれると No.22群 は 優 勢 種 を 変 動 し て 環 境 変 化に対応していることを明らかにした。

芳 香 族 炭 化 水 素 を 分 解 す る と き 、 株 と 株 の 機 能 的 な 補 完 作 用 を よ り 詳 細 に 解 明 す る た め に は 、 構 成 菌 を よ り 多 く 単 離 す る こ と が 重 要 と 考 え て い るO

No.22群から 3株 の 構 成 菌 し か 単 離 で き な か っ た 。 菌 群 に よ る 分 解 メ カ ニ ズ ム を 深 く 理 解 す る た め に は 、 難 培 養 性 微 生 物 を 含 め て 各 菌 種 の よ り 詳 し い情報が必要である。

ドキュメント内 重油生分解能の高い微生物群集の確立と生態機能解析 (ページ 59-105)