) K C S Z g ω
図︒ 右側 一喝 偲﹄
ω国
旬︒ 何回
No.22群 は 重 油 中 の 芳 香 族画分を効率的に分解した。
重 油 中 の 芳 香 族 炭 化 水 素 混 フ ェ ナ ン ト レ ピレン ンやアントラセン、
合物以外に、
21 14
Culture (days)
。
な ど 単 一 種 の 芳 香 族 炭 化 水 素を分解できるか実験した。
( 0 ，) phenanthrene
of Degradation 17.
Fig. 芳 香 族 画 分 を 炭 素 源 と し
anthracene (ム)， and pyrene (口)， in the enrichment た継代培養液と比べると、
medium supplemented with aromatic hydrocarbon 単 一 種 の 芳 香 族 炭 化 水 素 添
mgl1) by the No.22 consortium. fractions (120
加培地における No.22群の
aromatic with
culture showed the
lines Solid
立口
tT
J
また、
生育は弱かった。
hydrocarbon fractions， and dashed lines showed the 養21日後に残存している芳
culture without aromatic hydrocarbon fractions. GC分析し
香 族 炭 化 水 素 を
添 加 し た 芳 香 族 たところ、
ピーク面積もコントロー 炭 化 水 素 の ピ ー ク は r.t. 10""""17 minに残存し、
No.22群 は 単 一 種 の 供 試 芳 このことカ瓦ら、
ル と ほ ぼ 同 じ だ っ た(Fig.17)。
菌群の生育も弱いことを見出した。
香族炭化水素をほとんど分解できず、
そ こ で こ れ ら の 培 地 に 芳 香 族 画 分 を 少 量(0.12g/l)添加して培養すると、
供 試 し た 芳 香 族 炭 化 水 素 の ピ ー ク が 減 少 し 、 分 解 率 も フ ェ ナ ン ト レ ン は 7 ピレ ア ン ト ラ セ ン は 14日間で 90%(53 m g/l)、 日間で 100%(60 mg/l)、
ンも 14日間で 50%(30 mg/l)と高い値を示した(Fig.17)。
サ リ チ ル 酸 を 含 む 培 地 で 前 培 養 Pseudomonas saccharophila P15は、
すると、フェナントレン分解酵素のジオキシゲナーゼが誘導生産されると 報告されている 29)0No.22群 も 、 芳 香 族 画 分 の 添 加 に よ り 供 試 し た 芳 香 族
また 炭 化 水 素 を 分 解 す る 酵 素 系 が 誘 導 生 産 さ れ た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
3種 類 の 芳 香 族 炭 化 水 素 の ピ ー ク は 培 養 と 共 に 減 少 No.22群 は 供 新たなピーク(代謝副産物)は出現しなかったことから、
GC分析の結果から、
し、
試 し た 3種類の芳香族炭化水素を完全分解していると考えた。
また、 Burkholderiacepacia 2A ‑12がフェナントレンを分解するとき、
Yeast extractの よ う な 補 助 基 質 を 添 加 す る と 、 分 解 活 性 が 3倍 に 高 ま る と報告されている 28)。 そ こ で No.22群 で も 補 助 基 質 の 添 加 が 芳 香 族 炭 化 水素の分解に与える効果を検討した。 60mg/lの フ ェ ナ ン ト レ ン と 共 に 芳 香 族 画 分(40，120 mg/l)あるいは飽和画分(120 mg/l)、 Yeast extract(0.5
g/l)を補助基質として無機塩培地に添加した。その結果、フェナントレン 分 解 率 は ど の 補 助 基 質 を 添 加 し て も 上 昇 し た 。 ま た 、 芳 香 族 画 分 で は 濃 度 依存性が認められ、 40mg/mlでは分解速度が低下した。
3.6. No.22群 に よ る 飽 和 圏 分 と 芳 香 族 画 分 の 分 解
芳 香 族 画 分 添 加 培 地 で 継 代 培 養 し た No.22群 の 芳 香 族 画 分 分 解 率 を 経 時 的 に 測 定 し た と こ ろ 、 培 養 7日目で 26%、 14日目以降で約 66 %(2.6 g/l)の安定した分解率を示し(Fig.18)、GC分析でも均一にピークが減少し、
特に r.t.10‑20 min付 近 の ピ ー ク が 大 き く 減 少 し て い た(Fig. 19)。また、
飽和画分と芳香族画分を共に添加した培地で培養しても、 7日間で芳香族
p話血、、‑
、 80
・4
寄 =
砂通60
国 40
20
。
7 14 21 Culture (days)Fig. 18. Degradation of saturated and aromatic hydrocarbons by the NO.22 consortium.
‑
，
degradation of saturated hydrocarbon in the enrichment medium supplemented with saturates (4 g/l);企， degradation of aromatic hydrocarbon in the medium with aromatics (4 g/l);
.，
degradation of aromatic hydrocarbon in the medium with aromatics and saturates. Results are expressed as the mean土SD(n = 3).45
幽分を 35%(1.4 g/l)分 解 し た。 一方、芳 香 族 画 分 で 継 代 培 養 し た No.22 群を飽和画分添加培地に移植したところ、 7日目で 7
%
(0.28 g/l)しか飽和 画 分 を 分 解 で き な か っ た。 しかし、14日目には 69%
(2.76 g/l)ま で 分 解 率 が 上 昇 し た(Fig.18)。このように、芳 香 族 画 分 添 加 培 地 で 継 代 培 養 し て い た NO.22群 を 飽 和 国 分 添 加 培 地 に 移 植 す る と 、飽 和 画 分 分 解 率 に lagtimeが 現 れ た の は、炭 素 源 の 変化に対応して、優 勢 種 も 変化 し た と い う 仮 説 を 立 て た。
優 勢 種 の 変 化 に よ っ て 発 酵 や 分 解 過 程 が 進 行 す る 現 象 は、伝 統 的 な 発 酵 食 品 の 製 造 や、コ ン ポ ス ト の 発 酵 段 階 で 起 っ て い る こ と が よ く 知 ら れ て い るし2)。た と え ば、Pedroら2，55)は 、 コ ン ポ ス ト 化 過 程 に 注 目 し、温 度 や pH 、水 分 含 量 の 変化 に よ り コ ン ポ ス ト 中 の 優 勢 種 が 変 化 す る こ と を
PCR‑DGGE
法とリアノレタイムPCR
法 で 明 ら か に し て い る。No.22群 も 炭 素 源 の 種 類 が 変 わ る と 優 勢 種 を 変化 さ せ て 新 た な 炭 素 源 を分解している。す な わ ち NO.22群 は、群 集 構 成 菌 の 構 成 比 率 を 変 え て 周
の 環 境 変 化 に 対 応 し、群 集 と し て 機 能 的 に 働 い て い る と 予 想 し た。
(A) (B)
o
8 16 24 32 40 48 0 8 16 24 32 40 48Retention time (min)
Fig. 19. GC analysis of extracts from the culture solutions of the NO.22 consortium. The NO.22 consortium was cultured in media supplemented with the aromatic hydrocarbon fraction (A) after seven days. GC analysis of the extracts from the medium with the aromatic hydrocarbon fractions (B).
3 . 7 .
飽 和 画 分 や 芳 香 族 画 分 で 培 養 し た と き の 菌 叢 変 化3 . 7 .
1.PCR‑DGGE
解 析芳 香 族 画 分 で 継 代 培 養 し た 培 養 液 と 、 継 代 培 養 液 か ら 飽 和 画 分 あ る い は 芳 香 族 画 分 、 さ ら に 飽 和 画 分 と 芳 香 族 画 分 を 共 に 添 加 し た 培 地 に 移 植 し 、
2 1
日 間 培 養 し な が ら 経 時 的 に 培 養 液 を サ ン プ リ ン グ し てDGGE
解 析 し た。 炭素源を変えるとDNA
バ ン ド の 出 現 や 消 失 が 認 め ら れDNA
バンド、パ タ ー ン が 変 化 し た(Fig.20)。飽 和 画 分 や 混 合 培 地 で 培 養 す る と 、バ ン ドA、 B、C、E、Jや Nは 、 明 る さ が 増 し 強 く 検 出 さ れ た。一方、バンド D、F H、KとMは、薄くなった。こ れ は 、 飽 和 画 分 を 分 解 で き る 微 生 物 が 優 勢 に な っ た こ と を 示 し て お り 、 前 述 の 飽 和 画 分 分 解 率 の 急 激 な 上 昇 を 支 持 し ている。また、飽 和 画 分 添 加 培 地 で 継 代 培 養 し た と き 消 失 し た
DNA
バンドも、 再 び 芳 香 族 画 分 添 加 培 地 で 培 養 す る と 、 バ ン ド が 出 現 し て き た こ と か ら 、 炭 素 源 の 変 化 に 伴 っ て 優 勢 種 が 変 化 し て も 、 構 成 菌 種 は 保 持 さ れ て い る こ とを明らかにした。この結果から、N O . 2 2
群 は 飽 和 炭 化 水 素 か ら 芳 香 族 炭 化 水 素 ま で 広 い 分 解 スペク トノレを有していることを明らかにした。3 . 7 . 2 .
ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー 解 析NO . 2 2
群を異なる炭素源で培養すると、DNA
バンド、パターンが変化す ることをPCR‑DGGE
解 析 で 明 ら か に し た。こ の 結 果 は 、 菌 叢 の 変 化 を 定 性 的 に 示 し て い る が 、 優 勢 種 の 定 量 的 な 変 化 を 示 す こ と は で き な い。そこ で 、 飽 和 画 分 や 芳 香 族 画 分 を 炭 素 源 と す る 培 地 で 培 養 し た と き のNO . 2 2
群 の 優 勢 種 を 定 量 的 に 示 す た め に 、 ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー 解 析 を 行 っ た。 解 析 に は 3種 類 の 培 養 液 を 用 い た。芳香族画分に継代培養した培養液、
そ こ か ら 飽 和 画 分 に 移 植 し た 培 養 液 、 こ の 培 養 液 を 再 び 芳 香 族 画 分 に 移 植 した培養液である。継 代 培 養 液 か ら は 76個 、 飽 和 画 分 培 養 液 か ら は 42 個、芳香族画分培養液から
7 0
個のクローンを獲得し、これらの1 6 8rRNA
遺伝子を
DGGE
解 析 し てN o . 2 2
群のDNA
バ ン ド に 帰 属 し た。47
3 . 7 .
飽 和 画 分 や 芳 香 族 画 分 で 措 養 し た と き の 薗 叢 変 化3 . 7 .
1.PCR‑DGGE
解 析芳香族画分で継代培養した培養液と、継代培養液から飽和画分あるいは 芳香族画分、さらに飽和画分と芳香族画分を共に添加した培地に移植し、
2 1
日間培養しながら経時的に培養液をサンプリングしてDGGE
解析した。炭素源を変えると
DNA
バ ン ド の 出 現 や 消 失 が 認 め ら れDNA
バ ン ド パ ターンが変化した(Fig.20)。飽和画分や混合培地で培養すると、バンドA、 B、C、E、Jや Nは、明るさが増し強く検出された。一方、バンド D、F、 H、KとMは、薄くなった。これは、飽和画分を分解できる微生物が優勢 になったことを示しており、前述の飽和画分分解率の急激な上昇を支持し ている。ま た 、 飽 和 画 分 添 加 培 地 で 継 代 培 養 し た と き 消 失 し た
DNA
バンドも、再び芳香族画分添加培地で培養すると、バンドが出現してきたことから、
炭素源の変化に伴って優勢種が変化しでも、構成菌種は保持されているこ とを明らかにした。この結果から、
N O . 2 2
群 は 飽 和 炭 化 水 素 か ら 芳 香 族 炭 化水素まで広い分解スベクトルを有していることを明らかにした。3 . 7 . 2 .
ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー 解 析N O . 2 2
群を異なる炭素源で培養すると、DNA
バ ン ド パ タ ー ン が 変 化 す ることをPCR‑DGGE
解 析 で 明 ら か に し た 。 こ の 結 果 は 、 菌 叢 の 変 化 を 定 性的に示しているが、優勢種の定量的な変化を示すことはできない。そこで 、 飽 和 画 分 や 芳 香 族 画 分 を 炭 素 源 と す る 培 地 で 培 養 し た と き の
N o . 2 2
群の優勢種を定量的に示すために、クローンライブラリー解析を行った。
解 析 に は 3種類の培養液を用いた。芳香族画分に継代培養した培養液、
そ こ か ら 飽 和 画 分 に 移 植 し た 培 養 液 、 こ の 培 養 液 を 再 び 芳 香 族 画 分 に 移 植 した培養液である。継代培養液からは 76個 、 飽 和 画 分 培 養 液 か ら は 42 個、芳香族画分培養液から
7 0
個のクローンを獲得し、これらの1 6 8rRNA
遺伝子を
DGGE
解析してN o . 2 2
群のDNA
バンドに帰属した。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
時 晴
︑
d
﹂﹃
G H I J K
︑
hF
﹂﹃
3
A B C D E
L ‑今
M ... N時
7 14 21 7 14 21 7 14 Mixed
2t(days) Aromatics Saturates
(Subculture)
Aromatics
Fig. 20. DGGE patterns of consortium NO.22 in the saturated culture (lane 2・4)，the aromatic culture (1ane 5・7)，or a mixed culture containing both hydrocarbons (1ane 8・10). Lane 1 was the subculture on the aromatics as the seed culture. Lanes 2 to 4， 5 to 7， and 8 to 10 were the subculture on the same medium at seven day intervals.
まず、継代培養液をクローン解析すると、 Burkholderia属が 42%、
Pandoraea属が 24%、 DGGEバンド Fのクローンが 11%を占め、これ ら 3株 が 優 勢 種 で あ っ た 。 継 代 培 養 液 を 飽 和 画 分 で 培 養 す る と 、
Burkholderia属は 42%から 72%に増加したが、 Pandoraea属は 24%
から 5 %に減少した。そして、再び芳香族画分で培養すると、 Pandoraea
属の割合が 40%に増加した(Fig.21)。
48
これらの結果から、No.22群を飽和画分で培養すると、Burkholderia属 が 優 勢 種 と な り 、 飽 和 画 分 の 分 解 に Burkholderia属 が 積 極 的 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 芳 香 族 画 分 の 分 解 に は Burkholderia属の 他に Pandoraea属 も 一 定 の 割 合 で 存 在 し 、 さ ら に 最 後 の 芳 香 族 画 分 培 地 で 30%まで増加した DNAバ ン ド Fに 帰 属 で き る 微 生 物 も 分 解 に 関 与 し ていると考えられた。バンド Fに 帰 属 し た 構 成 菌 は 、 今 回 行 っ た 方 法 で は コロニーを形成しなかったため、得られたクローンの挿入配列を解析した。
近 縁 種 を Blast検 索 す る と 、 Brachymonaspetroleovorans CHX56)
(AY275432)と 最 も 高 い 92% の 相 同 値 を 示 し た こ と か ら 、 バ ン ド F は Brachymonas sp. F と仮同定した。
‑
80‑
，・々
、、ω 4
詰60 a
唱
冨
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宕40
ω 診
. . . 号
20出
。
Aromatics (Subculture)
Saturates Aromatics
Fig. 21. Community profiles of the clone libraries composed by the DNA bands of DGGE in the subculture on aromatics (seed culture)， the saturated culture， and the aromatic culture. The consortium was cultured for 7 days on each medium.
The numbers of total clones in the library from the aromatics， the saturated， and the aromatic culture were 76， 42， and 70 clones， respectively. White bar， Burkholderia sp.; Striped bar， Pandoraea sp.; Dotted bar， Brachymonas sp. F; Black bar， others bands. Relative abundance was calculated by the following equation. Relative abundance (%) {(number of categorized clones)/(total number of selected clones)}x 100.
これらの結果から、NO.22群 を 飽 和 画 分 で 培 養 す る と 、BurkhoJderia属 が 優 勢 種 と な り 、 飽 和 画 分 の 分 解 に BurkhoJderia属 が 積 極 的 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た。また、芳 香 族 画 分 の 分解には BurkhoJderia属の 他に Pandoraea属も一定 の 割 合 で 存 在 し、さ ら に 最 後 の 芳 香 族 画 分 培地 で 30%まで増加した DNAバ ン ド Fに 帰 属 で き る 微 生 物 も 分 解 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ た。バ ン ド Fに 帰 属 し た 構 成 菌 は、今 回 行 っ た 方 法 で は コ ロ ニ ー を 形 成 し な か っ た た め、得 ら れ た ク ロ ー ン の 挿入配 列 を 解 析 し た。 近 縁 種 を Blast 検 索 す る と 、BrachymonaspetroJeovorans CHX56)
(AY275432)と 最 も 高 い 92% の 相 同 値 を 示 し た こ と か ら 、バ ン ド F は Brachymonas sp. Fと仮同定した。
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Aromatics (Subculture)
Saturates Aromatics
Fig. 21. Community profiles of the clone libraries composed by the DNA bands of DGGE in the subculture on aromatics (seed culture)， the saturated culture， and the aromatic culture. The consortium was cultured for 7 days on each medium The numbers of total clones in the library from the aromatics， the saturated， and the aromatic culture were 76， 42， and 70 c1ones， respectively. White bar
Burkholderia sp.; Striped bar， Pandoraea sp.; Dotted bar， Brachymonas sp. F; Black bar， others bands. Relative abundance was calculated by the fol1owing equation. Relative abundance (%) {(number of categorized clones)/(total number of selected clones)}x 100.
49