博 士 （ 医 学 ） 別 役 徹 生 学位論文題名
高 血 圧 性 肥 大 心 に お け る 心 筋 細 胞 微 小 管 に 関 す る 研 究 ―自然発症高血圧ラット(SHR ）における組織学的検討一
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
緒 言
心臓に 負荷 が加わ ると心 筋は肥 大し て心機 能を保 持する ように 代償 機構か 働く。サミュエルら は，゛ 大動脈 に狭 窄を作 り，急 性に肥 大心を作製した場合，一過性に微小管が増加する細胞がある ことを 組織学 的手 法で指 摘し， 微小管 が筋新 生に 関与す る可能 性を報 告し た。しかし，臨床的に 最も多 く見ら れる 本態性 高血圧 症は， 漸増的 な血 圧の上 昇であ り，彼 らの 結果を本態性高血圧症 の際の 微小管 動態 にあて はめる ことは できな い。 そこで 本研究 では， 漸増 的な血圧上昇による心 肥大形 成過程 にお ける微 小管の 変化を 明らか にし ，その 役割を 検討す るこ とを目的として，本態 性高 血 圧 の 動 物 モデ ル と な る 自然 発 症 高 血 圧ラ ッ ト(SHR） を 用 い 経時 的 に微 小管を 観察し ， 併せて 急性圧 負荷 モデル を作成 し，微 小管動 態を 比較検 討した 。
方 法
1． 実 験 動 物1）SHR:4，6，10，16週 令 のSHR各5例 ず つ 計20例 を 用 い ， 対 照 は 同 週 令 のWistar−Kyotoラ ッ ト （WKY） 各 週 令5例 ず つ 計20例 を 用 い た 。2） 急 性 圧 負 荷 モ デ ル ：6週 令 のWKYの 腎 動 脈 よ り 中 枢 側 の 腹 部 大 動 脈 に 内 腔 が23G針 の 太さ の 狭 窄 を 作成 し ， 1週 間 の 急 性 圧 負 荷 を 加 え た4例 を 用 い た 。 ま たSham一Operationを 行 っ た3例 を対 照 と し た 。3）コ ル ヒ チ ン 前処 置 例 ： WKY10週令 の 潅 流 固 定3時 間 前 に ，微 小 管 脱 重合剤 である コル ヒ チ ン2．4mg7kgと8mg/kgを 腹 腔 内 投 与 し た 各1例 を 用 い ，1） で 使 用 し たWKY10週 令 を対 照と した 。
2． 組 織 学 的 観 察 ラ ッ ト の 血 圧を 尾 カ フ 法 で測 定 し ， 体 重測 定 後 ， 左 心 室よ りPLP固 定 液 で潅 流固 定した 。引続 き，左 室重量 を測 定し， 左心室 心基部 心筋 の水平 断面を 全周性に採取し，
同 固 定 液で 浸 漬 固 定 した 。 続 い て4％ パ ラ ホ ル ム アル デヒ ド固定 液で浸 漬固 定し， 厚さ2〃mの 凍 結 切 片を 作成し た。切 片は， 抗B―チュ ブリ ンマウ スモノ ク口ー ン抗体 と反 応後， フルオ レセ
イ ン 結 合 抗 マウ スIgGと 反 応 さ せ ，次 に ロ ー ダミ ン― ファロ イジン と反応 させた 。そ の後， 落 射 螢光顕 微鏡あ るい は，共 焦点レ ーザ一 走査 顕微鏡 で観察 した。 共焦点 レーザ一走査顕微鏡の光 学 的 断 層 面 は， 約700nmと し た 。2） 定 量 法 ：核 を 含 む 筋 細胞 横 断 面 で，点 状に見 える微 小管 の 相対的 総量を 求め ，また 各周囲の微小管をのぞいた細胞質中の微小管の総量を細胞質の面積（細 胞 横断面 と核の 面積 の差） で除し 密度を 求め た。
3． 工ポ ン 切 片 の 光学 顕 微 鏡 と 透過 電 子 顕 微 鏡 によ る 観 察PLP固 定 液で潅 流固定 後，3．5％ グ ル タ ー ル アル デ ヒ ド ―2％パラ ホルム アル デヒド 混合液 で浸漬 し，続 いて1％オ スミ ウム酸 で 浸 漬 し ， 型 通ル エ タ ノ ―ル系 列で 脱水し ，工ポ ン包埋 した。 その 後試料 より厚 さ2 Umの 準超薄 切 片を作 ルトル イジ ンブル 一染色 し光学 顕微 鏡で観 察を行 った。 さらに 超薄切片を作り，クエン 酸 訛とウ ラニル 酢酸 で二重 染色し ，透過 型電 子顕微 鏡で観 察した 。
4． 統計 学 的 処 理 得ら れ た 測 定 数値 は 平 均 値 土 標準 誤 差 で 表 した 。 有意差 検定に は，Stu ‑ dent st‑ testを 用い，5％ 未満の 危険 率を有 意と判 定した 。
結 果
1， 血 圧 収 縮 期 血 圧 は ，WKY4週 令 で55土5mmHgに 対 し てSHR4週 令 で68土5mmHg と 軽 度 上 昇 し て い た が 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。SHR6週 令 で は ，147土9mmHgで あ り，
4週 令 か ら6週 令 に か け てSIiRで は 血 圧 の 上 昇 が 見 ら れ ，WKY（104土4mmHg） と 比 べ て 有 意 （pくO． 01） で あ っ た 。WKYで は10週 令 で 血 圧の 平 衡 状 態 に達 し た が ，SHRで は10週 令 から16週 令にか けて さらに 上昇し た。
2． 左 室 重 量 ／ 体 重 （ 左 室 重 量比 ） は ，4週令 で はWKY2.9土0．2mg/g，SHR3．O土O．Img/
gと 有 意 差 は 認め ら れ な か った が，6週令 ではそ れぞれ2．7土O．Img/g，3．0土O，Img/gと なり SHRで 有 意に 大 き か っ た 。（pく0．05)。 また 腹部大 動脈狭 窄群の 左室 重量比 は3．9土O．5mg/g で，非 狭窄群2．7土O， Img7gに比 べ有意 に大き かった （pく0．05)。
3． 心 筋 細 胞 横 断 面 積 心 筋 細 胞 横 断 面 積 は ，4週 令 で はWKY242土10肛 而 ，SHR245土10 H而 と 両 群 に 差 は 認 め ら れ な か っ た が ，6週 令 で はWKY293土20ロ ボ で あ る のに 対 しSHR320 土13H而と有 意に大 きかっ た。 （pくO．01）。 一方核 の面積 は両群内でも各週令間でも有意差は見 られな かった 。また 大動 脈狭窄 群の心 筋細胞 横断面 積は440土18〃而で非狭窄群276土20肛nキと比 べ有意 に大き かった 。(pく0．01)。
4． 準 超薄 切 片 の 光 学 顕微 鏡 で の 観 察心 筋 細 胞 の中 央部に 楕円 形の核 が存在 し，細 胞質内 に は豊 富 な 筋 原 線維 と ミ ト コ ンド リ ア が ， 整 然と 配 列し ていた 。SHR16週令 では， 対照 と比べ 細
胞 横 断 面 積 が 大 き く ， 筋 原 線 維 束 も 肥厚 し て い た 。ま たSHR16週 令 で はWKYと 異 なり ， ミ ト コンド リアが 細胞膜 直下 に大量 に集積 してい る細 胞が認 められ た。
5． 透 過 型電 子 顕 微 鏡 での 観 察SHR16週 令 では ミ ト コ ン ドリ ア 分 布 の 不均 一像が より明 らか に観察 でき， さらに ミト コンド リアに は大小 不同 が認め られた 。心筋 細胞横 断切片では，微小管 は各 周 囲 部 ， 筋原 線 維 間 ， 細胞膜 直下， ミト コンド ルア近 傍など に外 径25nmの管 状構 造とし て 認めら れた。
6． 螢 光 抗体 法 に よ る 微小 管 の 観 察1） 落 射 蛍 光 顕微 鏡 に よ る 観察 ： 微 小管は ，心 筋細胞 内 で細胞 質中を 主に縦 走し ，核の 周囲で は特に 密な 走行を 示した 。また 長楕円 形を示す核の両極の 細胞質 内に集 積する 傾向 があっ た。な お，急 に方 向を変 え横走 する微 小管も わずかに見られた。
横断 面 を低 倍率で 観察す ると同 一心 筋では 微小管 の分布 は比 較的均 一であ った。2） 共焦点 レー ザこ走 査顕微 鏡によ る観 察：ア クチン と微小 管の 二重染 色を画 像処理 で重ね 合わせることによっ て，微 小管は 細胞質 中で 筋原線 維間を 走行し ，ア ク．チ ンの中央近傍っまりZ腺の近傍で横方向に 向きを かえる ことが 明ら かにな った。 またコ ルヒ チン2． 4mg/kg前投 与で は，束状の微小管は滅 少し8 mg/kgの 前投 与では ，さら に減少 するこ とが 確認さ れた。 しかし ，完 全には 消失せ ず，比 較的安 定な微 小管も 存在 した。
7． 微 小 管 の 相 対 的 総 量 ， 密 度 ， 分 布 ： 微 小 管 の 相 対 的 総 量に はSHRとWKYの 両群 間 で ， 有 意 差 は 見 ら れ な か っ た 。 細 胞 質 内 の 微 小 管 の 密 度 はWKYと 比 ベSHRで は 各 週 令 で有 意 に 少なか った。 しかし 各群 内で週 令に伴 う密度 の変 化は認 められ ず，漸 増する 血圧の上昇に伴う微 小管密 度の大 きな変 化は 見られ なかった。また，微小管分布にも大きな変化は認められなかった。
一方， 腹部大 動脈狭 窄に よる急 性圧負 荷群で は， 一見し て明ら かに微 小管の 量が増加している細 胞が約16％に 見られ た。
考 案
1． 共 焦 点 レー ザ 一 走 査 顕微 鏡 の 有 用 性 共 焦 点レー ザ一走 査顕微 鏡では ，レ ーザー 光を光 源と するの で，光 束は非 常に小 さな スポッ トに収 束し， この スポッ ト内の 螢光物質のみ，光を射 出す る。さ らに， この螢 光は共 焦点 面に焦 点を結 ぷので 共焦 点面に ピンホ ールを置き迷光を排除 し， 高解像 度，高 コント ラスト で光 軸の方 向の分 解能を 高め た像が 得られ る。このため本研究で は ， 微 小 管 が 密 に 走 行 し て い る 部 分 の 観 察 が 従 来 よ り 正 確 に 行 う こ と が で き た 。 2． 肥 大 心 に お け る 微 細 構造 の 変 化 SHRの 肥 大心 で は ， 心 筋細 胞 の 再 構 築と し て 筋 原 線 維の 肥厚が 認めら れた。 また， ミト コンド リアの 分布お よび 形態の 変化が 認められたが，その意
義付けは不明であった。
3．心筋細胞微小管とコルヒチン： コルヒチン前投与により，微小管を脱重合させた場合，
対照と比べて螢光標識された束状の微小管は激減しており，遊離ロ―チュブリンの状態では可視 化できないことが確認され，本法では正しく微小管が観察されていることが証明された。本研究 のコルヒチンを用いた実験は微小管の重合，脱重合の周期が比較的早いこと，しかし中には安定 な微小管もあることをも確認した。
4．肥大心における微小管 一般に血圧の上昇に伴い心筋細胞にかかる張カは増えるので，
形態維持のために細胞骨格である微小管は，その密度の増加を伴うことが考えられた。また肥大 形成時には，蛋白合成亢進があるため，細胞内の物質輸送を担当する微小管はその密度を増加さ せるとも予想された。本研究の急性圧負荷モデルでは16％の細胞に微小管の増加が見られ，急性 圧負荷に対する微小管の代償的役割が示された。しかし，SHRを用いた慢性圧負荷モデルでは，
微小管の密度は，血圧の上昇過程や心肥大の形成過程でも大きな変化は見られず，微小管の相対 的総量 はWKYと有意差がなかった。 すなわち，本研究の慢性圧負荷モデルにおける微小管の 動態および分布は安定であり漸増的な圧負荷は微小管動態を変える刺激とはなりえなかった。
学位論文審査の要旨
心臓に負荷が加わると心筋は肥大して心機能を保持するように代償機構が働く。サミュエルら は，大動脈に狭窄を作り，急性に肥大心を作製した場合，一過性に微小管が増加する細胞がある ことを組織学的手法で指摘し，微小管が筋新生に関与する可能性を報告した。しかし，臨床的に 最も多く見られる本態性高血圧症は，漸増的な血圧の上昇であり，彼らの結果を本態性高血圧症 の際の微小管動態にあてはめることはできない。そこで本研究では，漸増的な血圧上昇による心 肥大形成過程における微小管の変化を明らかにし，その役割を検討することを目的として，本態 性 高血圧の動物モデルとなる 自然発症高血圧ラット(SHR)を用い経時的に微小管を観察し，
併せて急性圧負荷モデルを作成し，微小管動態を比較検討した。
顕厚 康 和富 畠部 山 北阿 小 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
方 法 は ，4，6，10，16週 令 のSHR各5例 と ， 同 週 令 のWistar―Kyotoラ ッ ト （WKY) 各 週 令5例 ，2）6週 令 のWKYの 腎 動 脈 よ り 中 枢 側 の 大 動 脈 に 狭 窄 を 作 成 し ，1週 間 の 急 性 圧 負 荷 を 加 え た4例 とShamーOperationを 行 っ た3例 ，3）WKY 10週 令 の 潅 流 固 定3時 間 前に ， 微 小 管 脱重 合 剤 で あ る コル ヒ チ ン2． 4mg/kgと8mg/kgを 腹腔内 投与 した各1例 を用い ， まず， ラット の血圧 を尾 カフ法 で測定 し，体 重測 定後， 左心室 より潅 流固定 した 。その 後，左重 量を測 定し， 左心室 心基 部心筋 の水平 断面を 全周性に採取し，浸漬固定し，凍結切片を作成した。
切片fま ， 抗 ロ亠 チ ュ ブ リ ンマ ウ ス モ ノ ク 口ー ン 抗 体 と 反応 後 ，フル オレセ イン結 合抗 マウス IgGと 反 応 させ ， 次 に 口 ーダ ミ ン ― フ ァロ イ ジ ン と 反応 さ せ た。 その後 共焦 点レー ザ一走 査顕 微鏡で 観察し ，核を 含む 心筋細 胞横断 面で， 点状 に見え る微小 管の相 対的総 量を 求め， また核周 囲の微 小管を のぞい た細 胞質中 の微小 管の総 量を 細胞質 の面積 （細胞 横断面 積と 核の面 積の差）
で 除 し 密 度 を 求 め た 。 ま た ，SHRとWKYは 固 定後 工 ポ ン 処 理し ， 準 超 薄 切片 を 作 り 光 学顕 微 鏡で観 察した 。さら に超 薄切片 を作り ，透過 電子 顕微鏡 で観察 した。
そ の 結 果 ，収 縮 期血圧 ，左室 重量／ 体重 （左室 重量比 ）は，4週 令で両 群間 に有意 差は認 めら れナ ょ か っ た が6週 令 で はSHRで 有 意 に高 値であ った。 また， 腹部大 動脈 挟窄群 の左室 重量比 は 非狭 窄 群 に 比 べ有 意 に 高 値 を 示し た 。 光 学 顕微 鏡 で の 観 察でSHR16週令 では， 対照と 比べ細 胞 横断面 積が大 きく， 筋原 線維束 も肥厚 してお り， また対 照には 見られ ないミ トコ ンドリ アが細胞 膜直 下 に 大 量 に集 積 し て い る 細胞 が 認 められ た。透 過電 子顕微 鏡での 観察でSHR16週令でtま ミ トコン ドリア 分布の 不均 一像が より明 らかに 観察 でき， さらに ミトコ ンドリ アに は大小 不同が認 められ た。
共焦点 レー ザ一走 査顕微 鏡によ る観察 では ，アク チンと 微小管 の二 重染色 を画像 処理で 重ね合 わせ る こ と に よっ て， 微小管 は細胞 室中で 筋原 線維間 を走行 し，ア クチン の中 央近傍 っまりZ腺 の近傍 で横方 向に向 きを かえる ことが 明らか にな った。 またコ ルヒチ ン2． 4mg/kg前投 与では，
束状 の 微 小 管 は滅 少し ，8 mg/kgの前 投与で は，さ らに減 少す ること が確認 された 。しか し， 完 全には 消失せ ず，比 較的 安定な 微小管 も存在 した 。
微 小 管 の 相 対 的 総 量 はSHRとWKYの 両 群 間 で ， 有 意 差 は 見 ら れ な か っ た 。 細 胞 質 の 微 小 管 の 密 度 はWKYと 比 べSHRで は 各 週 令 で 有 意 に 低 値 を 示 し た 。 し か し 各 群 内 で 週 令 に 伴 う 密度の 変化は 認めら れず ，漸増 する血 圧の上 昇に伴う微小管密度の大きな変化は見られなかった。
また， 微小管 分布に も大 きな変 化は認 められ なか った。 一方， 腹部大 動脈狭 窄に よる急 性圧負荷 群では ，一見 して明 らか に微小 管の量 が増加 して いる細 胞が16％ に見 られた 。すな わち， 本研究 に お け る 漸 増 的 な 圧 負 荷 は 微 小 管 動 態 を 変 え る 刺 激 と は 成 り 得 な か っ た 。
口頭発表の審査会において，第3解剖阿部教授より，凍結切片の厚さにっいて，微小管の分布 から予想される機能にっいて，特に急性圧負荷モデルで横に走行する微小管が増えている意味に っいて，筋原線維の中を走行する微小管の有無にっいて，筋原線維と比べたときの微小管の細胞 の骨組みという役割の重要度にっいて，急性圧負荷モデルで微小管のもっと早い時期の反応の有 無にっいての質問がなされた。また，小山教授より，SHR16週令でミトコンドリアの不均一な 集積が起こる意義にっいて，また使用した顕微鏡など方法にっいて，急性圧負荷モデルでのミト コンドリアにっいての質問がなされた。川上教授より心臓で微小管を調べる意義にっいての質問 がなされた。これらに対し，申請者は概ね妥当な回答を行った。その後行われた阿部，小山両審 査教授との試問においても，概ね妥当な回答がなされた。
本研究ぼ慢性圧負荷と急性圧負荷による心肥大の際の微小管動態の違いを明らかにし，その役 割 を 考 察 し た も の で あ り ， 有 意 義 な 研 究 と 考 え ら れ ， 学 位 授 与 に 値 す る 。
