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Title Human monocarboxylate transporter 1, 4 (hMCT1, 4) の基質選択性の違いを決定する分子メカニズムに関する研 究 [論文内容及び審査の要旨]
Author(s) 二木, 悠哉
Citation 北海道大学. 博士(臨床薬学) 甲第13970号
Issue Date 2020-03-25
Doc URL http://hdl.handle.net/2115/77834
Rights(URL) https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Type theses (doctoral - abstract and summary of review)
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File Information Yuya̲FUTAGI̲abstract.pdf (論文内容の要旨)
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
博士の専攻分野の名称 博士 (臨床薬学) 氏 名 二 木 悠 哉
学 位 論 文 題 名
Human monocarboxylate transporter 1, 4 (hMCT1, 4) の 基質選択性の違いを決定する分子メカニズムに関する研究
(Molecular determinants of substrate selectivity in human monocarboxylate transporters 1 (hMCT1) and 4 (hMCT4))
Human monocarboxylate transporters (hMCTs) は種々のモノカルボン酸化合物の輸送を担う、膜タ ンパク質の一群である。hMCTsのうち、hMCT1とhMCT4は種々の細胞に発現し、L-乳酸を共通 の基質としてpH依存的に輸送する。hMCT1, 4の生理学的な役割を明らかにするためには、それ ぞれのトランスポーターに対する選択的なリガンドが必須である。これまでの研究で、いくつか のhMCT1の選択的阻害剤が創製された。また筆者らは、L-5-oxoproline (L-OPro) がhMCT1の選 択的基質であることを明らかにしている。その一方で、hMCT4選択的リガンドはこれまで同定さ れていなかった。hMCT4選択的リガンドの創製を困難にしている要因として、hMCT1と比して
hMCT4の基質に対する親和性が低いことが挙げられる。筆者はこのhMCT1, 4の基質親和性およ
び選択性の違いを決定する部位の同定を行うため、hMCT1, 4の構造と機能に関する検証を行って きた。特に、第3細胞内ループ (TM6/7loop) がhMCT1, 4の親和性を調節する部位として機能す ることを見出している。その一方で、TM6/7loop は基質選択性には関与しなかったため、他の部
位がhMCT1, 4の基質選択性を決定づけているものと考えられていた。そこで本研究ではhMCT1,
4の基質選択性の違いを決定する分子メカニズムを解明することを目的とした。
hMCT1, 4のリガンド選択性の差異を評価するため、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用い
て基質類縁体のhMCT1, 4介在性L-乳酸輸送に対する阻害効果について検証した。種々の化合物 による阻害実験により、hMCT1選択的な阻害効果を示す骨格を見出した。また、hMCT4選択的 な阻害効果を示す骨格を見出すことはできなかったが、hMCT1, 4の両方に阻害効果を示す有用な 骨格を見出した。hMCT4に対して選択的な阻害活性を示す化合物を探索するにあたり、これらの 有用な骨格を有する既存の医薬品を用いることとした。我々は、イソ酪酸骨格を有するフィブラ ートに着目し、hMCT1, 4に対する阻害効果を検証した。その結果、fenofibrate anion, bezafibrateお
よびclinofibrateがhMCT4選択的な阻害効果を示した。さらに、ベンジルインダゾール骨格とイ
ソ酪酸がリンカーで結合した構造を有するbindaritはフィブラートよりもhMCT4選択的かつ強力 な阻害効果 (Ki ≈ 30 μM) を示すことが明らかとなった。
次なる検証として、hMCT1, 4間の基質選択性の違いを説明するため、ホモロジーモデリング法 およびドメイン解析を用いてhMCT1, 4の基質輸送経路の差異に着目することとした。Phyre2を
利用して hMCT1, 4 の 3 次元ホモロジーモデルを構築し、それぞれ 51 アミノ酸残基からなる
hMCT1, 4の基質輸送経路を推定した。hMCT1, 4の基質選択性に関与するアミノ酸残基を同定す
るため、推定基質輸送経路を構成するhMCT1, 4間で保存されていない残基に着目した。その結 果、それぞれ20個の残基が抽出された。そこで、これらの残基を置換した変異体を作製し、その 基質選択性が変動するか検証した。作製した変異体のうちhMCT1-M69L, -F367Y変異体において、
そのL-OPro輸送活性がL-乳酸と比較して低下したため、M69, F367残基が基質選択性において重 要であることが示された。単一変異導入の結果に基づき、hMCT1-M69L/F367Y変異体を構築し、
その基質輸送活性を評価した。この変異体のL-乳酸輸送活性はhMCT1-WTと比較しておよそ50％
残存したのに対し、L-OPro輸送活性は完全に消失した。この結果は、単一変異導入の結果と一致
している。hMCT1のM69, F367残基への変異導入がその阻害特性に与える影響について検証する ため、これらの変異体を介したL-[14C]乳酸輸送に対するL-乳酸およびL-OProの阻害能を評価した。
基質選択性の変動の指標として阻害定数比 (Ki, L-OPro/Ki, L-Lactate) および輸送サイクル比 (kcat,
L-OPro/kcat, L-Lactate) を算出したところ、F367Y変異体の阻害定数比はhMCT1-WTと比較して増大し、
M69L変異体の輸送サイクル比はhMCT1-WTと比較して低下した。さらにM69L/F367Yについて は阻害定数比の増大と輸送サイクル比の低下が認められたことから、単一変異導入で得られてい たデータとの整合性が得られた。この結果から、hMCT1の基質選択性が輸送サイクル (M69) お よび基質親和性 (F367) に関与する残基によって調節されていることが示された。hMCT1とその リガンド間の相互作用に与えるM69L, F367Y変異の影響について検証するため、hMCT1とL-OPro 類縁体との結合親和性について評価した。L-OCPCおよび L-OProのKi値の比較により、L-OPro の 1位のN原子がリガンド認識に与える影響について評価した。このN原子のC原子への置換によ
り、M69L, F367Y変異体のリガンドへの親和性が増大することが示された。この結果から、M69,
F367残基がL-OProの –NH– 構造の認識に関与していることが示唆された。M69, F367残基のど のような物理化学的性質が hMCT1 の基質選択性に影響を与えるのか検証するために、これらの 残基に飽和変異 (M69XおよびF367X) を導入しその基質輸送活性を評価した。M69X変異体につ いては一部に輸送活性が認められたものの、そのL-OPro輸送能はL-乳酸輸送能と比較して減少し た。この結果から、L-OProの効率的な輸送にはMet側鎖の疎水的かつ長い直線構造が必要である ことが示された。また、F367X 変異体については活性が残存した全ての変異体において、その
L-OPro輸送能がL-乳酸輸送能と比較して低下したものの、F367L変異体はその影響が比較的小さ
かった。これらの結果から、L-OProの効率的な輸送にはF367残基の占める位置にγ位で分岐し た側鎖構造が必要であることが示された。
本研究では、「hMCT1, 4間の基質選択性の違いをそのTM6/7loop配列の違いで説明できなかった」
という筆者らの先行研究の結果を受け、hMCT1, 4の基質選択性の違いを決定する分子メカニズム を解明することを目的とした。hMCT1, 4 の基質構造とタンパク質分子構造に着目し、Xenopus oocyte異種発現系やin silicoの手法を用いて種々の検証を行うことで、強力なhMCT4選択的非競 合阻害剤であるbindaritおよびhMCT1選択的なL-OPro輸送に関わる2つのアミノ酸残基M69, F367残基を同定した。
