原 著 〔東女医大誌 第63巻 第3号頁239∼246平成5年3月〕
培養角膜内皮細胞に対する圧力負荷の影響
東京女子医科大学 眼科学教室（主任二小暮美津子教授） アラ キ ヒロ コ荒 木 博 子
（受付 平成4年11月10日） The E丘ect of Pressure Elevation on Cultured Comeal Endothelial Ce皿s Hiroko ARAm Department of Ophthalmology， Tokyo Women’s Medical College The effect of elevated pressure on cultured bovine corneal endothelial cells was studied using pkase contrast microscopy and scanning electron microscopy． The culture flask was connected to a reservoir filled with tissue culture medium and the pressure of the experimental setup was maintained at 80 mmHg． The cultured endothelia量cells exposed to high pressure for 6 to 120 hours showed formation changes in the microv童11i， unevenness of the cellular surface and disruption of the cytoplasm． However， excaryocytosis and cell loss， previously reported endothe監ial changes found to occur in glaucoma， were not observed． There were no differences in oxygen tension and concentration of electrolytes in the culture medium between each sample． The morphological changes observed in this study may be caused by the effect of the high pressure． The results suggest， therefore， that high IOP directly causes dysfunction of the corneal endothelium in patients with glaucoma， 緒 言 角膜内皮細胞は角膜の最も前房側に位置し，そ の物理的なバリアー機能と能動輸送機能により角 膜含水量を一定に保ち，角膜の透明性を維持する ために重要な機能を果たす一層の細胞層を構成し ている1）∼3）． 近年，スペキュラーマイクロスコープの発達に ともない角膜；内皮のin vivoでの観察が容易とな り4），緑内障眼における角膜内皮の変化について 様々な知見が得られている．これらの報告による と，一般的に角膜内皮は，開放隅角緑内障のよう に比較的緩徐な眼圧上昇には抵抗性があり形態変 化を来さない5団．しかし閉塞隅角緑内障におけ る急性発作のように急激な高度の眼圧上昇では， 細胞面積の拡大や細胞密度の減少がみられるとさ れている81∼11）． 一方，動物実験による実験的緑内障眼では，高 眼圧に一定時間以上維持された場合，角膜内皮に 細胞の平坦化，細胞表面の水胞化（blebbing）， microvilliやciliaの減少，細胞の断裂，空胞形成 （vacuolization），細胞核の脱落（excaryocytosis） および内皮細胞の脱落が起こることが報告されて いる12）13）． このように，高度の眼圧上昇を来した緑内障眼 では，角膜内皮細胞に形態変化が生ずることは明 らかである．しかし緑内障眼では眼圧上昇の他に， 薬物治療の有無，手術の既往，罹病期間など，角 膜内皮細胞に影響を及ぼすと考えられる因子が多 数存在する．したがって内皮細胞の変化が眼圧上 昇の直接的な影響か，あるいは他の因子による影 響なのか，原因を特定することができない．また 眼圧上昇時に生ずると考えられる二次的な前房水 の組成変化や，眼球の伸展による物理的な変化も 角膜内皮細胞に影響を及ぼす因子として無視する ことはできない． 培養角膜内皮細胞は生体内における角膜内皮三らの相互作用による影響を受けないため，角膜内 皮細胞自体の機能を知るのに有用である14）15＞．ま た，培養細胞を用いた実験は，細胞と培養液とい う整理された実験系であり，生体内のように様々 な環境変化に影響されることがない．以上のこと から，ある特定の環境あるいは物質による細胞ゐ
変化を検討するのに適した実験系と考えられ
る16）． 現在までに，緑内障眼における角膜内皮細胞の 形態変化について，in vitroのモデルで培養細胞 を用いて検討した報告はない．そこで今回は，角 膜内皮細胞に対する眼圧の直接的な影響を明らか にする目的で培養角膜内皮細胞を用いて圧力負荷 を行い，その微細構造におよぼす変化について観 察した． 方 法 1．細胞培養 新鮮ウシ摘出眼球を入手し，外眼筋，脂肪組織 などの眼球周囲組織を除いた後，0．05％グルコン 酸クロルヘキシジンで眼球表面を洗浄し，虹彩， 強膜を含まないように注意深く直径約2cmの角 膜片を二刀で切り取った．内皮面を上向きにして， 0．1％トリプシン溶液を満たし37℃で15分間反応 させた後，先端をガスバーナーで熱して丸くした パスツールピペットを用いて角膜内皮面を擦過し，内皮細胞を収集した．2mlのphosphate
buffered saline（PBS）を力口え，1，000rpm，5分間遠心し，細胞を回収した．10％牛胎児血清
（FBS）およびペニシリン，ストレプトマイシン， アンホテリシンを含むEagle’s minimum essen− tial medium（10丁目BS添加， Eagle’s MEM）を 加えて細胞浮遊液を作製し，Linbro社製12穴マル チウェルプレートに播種し，37℃，5％CO2イン キュベーター内で培養した．培養液は2日に一度 交換した．約1週間後，conHuentに達した細胞を0．1％トリプシンで処理し，8mm×50mmのカ
バーガラス上に継代した．カバーガラス上に
connuentとなった時点で，以下に述べる実験系に 供した． 110cm カバーガラス上の培養細胞 図1 実験装置 2．実験装置 実験装置は，組織培養フラスコ￠・rning三二 25cm2）とreservoirをカニュ「レで連結させたも のである・（図1）．内部は10％FBS添加Eagle’s MEMで満たしてあり，reservoirの高さを調節す ることにより，内部にかかる圧力を調節できる仕 組みになっている．カバーガラス上に増殖した細 胞を組織培養フラスコ内に静置し，reservoirの高さを約110cmとし，装置内に約80mmHgの圧力
がかかるように設定した．また，全く圧力負荷を 行わない培養角膜内皮細胞をコントロールとし， 圧力が負荷されている検体と共に，再度37℃，5％ CO2インキュベーター内で培養を継続した． 3．形態学的検討 コントロール（実験開始後120時間経過した培養 角膜内皮細胞）および圧力負荷開始後6，12，24， 48，72，120時間経過した培養角膜内皮細胞の細胞 形態について，位相差顕微鏡および走査型電子顕 微鏡による観察を行った． 走査型電子顕微鏡用の試料作製は以下の方法で 行った．培養細胞を実験装置より取り出し，0．1M カコジル酸緩衝液で細胞表面を洗浄後，2％グル タールアルデヒドにて2時間固定した．アルコr ル系列で脱水したのち，酢酸イソアミルで置換し， その後臨界点乾燥を行い，金蒸着後，走査型電子 顕微鏡（日本電子JSM−35C，加速電圧15KV）で 観察した．罎． 舘 ：蚕 糞． 図2 培養角膜内皮細胞の位相差顕微鏡所見（×370） a：コントロール．核，核小体，細胞境界が鮮明に識 別できる一層の細胞層が認められる．b：圧力負荷 6時間後．細胞から分泌された代謝産物と思われる 球状物質（→）が所々に観察される．c：12時間後． 圧力負荷6時間後と同様に，細胞からの代謝産物が 認められる（→）．d：24時間後．細胞は密に結合し ており，細胞境界は明瞭に識別できる．e：48時間後． 核，核小体，細胞境界がやや不鮮明である．f：72時 間後。圧力負荷48時間後と比較し，細胞境界の識別 が困難である。g：120時間後．空胞変性を生じた細 胞（→）が認められる．
c蚕 露塵餐 懸濁 簑．誓誕 灘」買履 ．．．ｲ 緒． 図3 培養角膜内皮細胞の走査型電子顕微鏡所見 （bar＝10μm） a：コントロール．密に結合した多角形の内皮細胞 がシート状に認められる．所々にmicrovilli（→）が 観察される．b：圧力負荷6時間後．核および細胞境 界付近の細胞質に小さい裂隙を示す変性巣と環状の 構造（→）が認められる．c：12時間後．細胞表面は 凹凸不整を示し，圧力負荷6時間後と同様の環状の 構造を認める．d：24時間後．細胞質の小裂隙と細胞 表面の凹凸不整が観察される，環状の構造は認めら れない。e：48時間後．圧力負荷24時間後とほぼ同程 度の細胞質と小裂隙と細胞表面の凹凸不整を認め る．f：72時間後．核，細胞境界付近の細胞質に多数 の裂隙が認められる．g：120時間後．細胞表面に高 度の凹凸不整が認められる．
4．培養液中の酸素分圧，Na＋， K＋， Ca2＋濃度測 定 コントロールおよび圧力負荷6，12，24，48， 72，120時間後の培養角膜内皮細胞，合計7検体に つき，圧力負荷実験終了時に実験装置内の培養液 について酸素分圧，Na＋， K＋， Ca2＋濃度を血液ガ ス電解質分析装置（ノバ社スタットプロファイル 5）により測定した． 結 果 1．位相差顕微鏡所見 図2a∼gにコントロールと圧力負荷6，12，24， 48，72，120時間後の培養角膜内皮細胞の位相差顕 微鏡所見を示す． コントロニル却よび6∼24時間後の培養角膜内 皮細胞は核，核小体，細胞境界が明瞭で，細胞が
密に結合した一層のシート状を呈した（図2a
∼d）． 一方，圧力負荷48，72時間後の角膜内皮細胞は 核，核小体，細胞境界が不鮮明であった（図2e， f）． 圧力負荷120時間後では同様の変化がより高度 に認められ，さらに所々空胞変性を生じた細胞が 認められた（図2g）．全検体に共通して培養細胞よ り分泌された代謝産物と思われる，球状物質が 所々に認められた． なお，圧力負荷120時間経過した培養細胞につい てトリパンブルー染色を行ったところ細胞は青染 されず，生細胞であることが確認された．また同 細胞を5×104個／mlの細胞密度で培養フラスコに 継代したところ4日後にconfluentに達した． 2．走査型電子顕微鏡所見 図3a∼gにコントロールと圧力負荷6，12，24， 48．72，120時間後の培養角膜内皮細胞の走査型電 子顕微鏡像を示す． コントロールでは，直径約30∼40μmの多角形， 一部六角形を示す内皮細胞が互いに密に結合し， 細胞境界は細かく入り組んで，指状陥合を示して いた．細胞の核は約10μmで卵型を示し，細胞の周 辺に偏在しており，核に一致して細胞表面に平坦 な隆起を認めた．細胞表面は比較的平滑であった が，所々にmicrovilliと思われる約0．3μm径の小 突起が散在していた（図3a）． 圧力負荷6，12時問後の培養角膜内皮細胞では， 細胞および核の形態，大きさに関してコントロー ルと比較して差はなかった．細胞表面はやや凹凸 不整を示し，核および細胞境界付近の細胞質に小 さい裂隙を示す変性巣が認められた．またmi− crovilliと思われる小突起は，．ﾗ胞1個あたりの
数はコントロールと差はないものの，長さは約 1∼2μmとやや長いものが多く認められた．さら に核に隣接する変性巣の表面には，直径約1∼2 μmで細胞表面に付着する環状の構造が多数観察 された（図3b， c）． 圧力負荷24，48時間後の培養角膜内皮細胞でも 細胞，核および細胞境界の形態はコントロールと 比較して門門はなかった．細胞表面の凹凸不整， 核付近の細胞質の小裂隙に関しては圧力負荷6 ∼12時間後の角膜内皮とほぼ同程度の変化を示し た．しかし前述した環状の構造はほとんど認めら れなかった（図3d， e）． 圧力負荷72，120時間後では，核，細胞境界付近 の細胞質の裂隙が著明であったが，細胞境界は正 常な形態を示した．核はやや不鮮明で，核に一致 して認められる細胞表面の隆起も平坦であった （図3f）．また，圧力負荷120時間後の検体では細胞 表面の凹凸不整が顕著な細胞を所々に認めた（図 39）． 3．培養液中の酸素分圧，電解質組成 各検体の圧力負荷実験終了時の装置内に残存す る培養液について，酸素分圧，Na＋， K＋， Ca2＋を 測定したが各検体間に差は認めなかった（図4）． 考 察 今回の実験では，角膜内皮細胞に対する眼圧上 昇の直接的な影響を検：肥するため，培養角膜内皮 細胞を用いて圧力負荷実験を行った．生体内での 眼圧上昇と培養フラスコ内での圧力負荷とでは圧 力の性状が異なることが予想されるが，本法の利 点は，眼圧上昇に伴う眼球の伸展や血流の影響に よる前房水の性状変化など生体内で生ずる種々の 要素を除外できる点にある．負荷する圧力は，閉 塞隅角緑内障の急性発作を想定し充分に高い圧力 で，かつ緑内障動物実験12＞13）17）において用いられ肇… 違
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Cont l2 24 48 72 （用moL／L）1 距か翼一翼一翼一躍 蟹5。 度O
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度 120 （hour） 0 48 72 120 （hour） Cont 12 24 匝／ｫ
一一鵠 冨 鴇什1 度 48 72 120 （hour） 図4 度 翼。L＿＿＿＿＿
Cont l 2 24 48 72 120 （hour） 圧力負荷終了時の培養液の酸素分圧，電解質持 ている圧力負荷値を参考に，その平均的な値とし て80mmHgに設定した．圧力負荷の結果，位相差 顕微鏡では圧力負荷48時間後から核や細胞境界の 不鮮明化が認められ，走査型電子顕微鏡では圧力 負荷6時間後からmicrovilliの形態変化，細胞表 面の凹凸不整，細胞質の小裂隙などの細胞表面の 微細構造の変化が認められた． 圧力負荷終了時の培養液の酸素分圧，電解質濃 度は各検体間で大きな差を認めなかった．した がって今回認められた形態変化は培養液の生化学 的な変化による影響ではなく，圧力負荷の直接的 な影響で生じた可能性が大きいと考えられる． さて，細胞にはアクチンフィラメント，微小管， 中間径フィラメントの3種類の繊維が細胞質全体 に存在し，細胞骨格を形成している．特にアクチ ンフィラメントは，アクチン結合タンパクである ミオシンと，時に協同しあるいは競合し細胞膜直 下に密な網目構造であるterminal webを構成し ている．term圭nal webは細胞側壁に存在する接着 帯に付着し，細胞に機械的な強度を与え，その細 胞の運動性や形態を制御統合していると考えられ ている18》∼21）．本実験で認められた細胞表面の環状 の構造物は，細胞表面のblebあるいはvacuoleが 破れてcrater状になったものと考えられる．これ 不整や細胞質の裂隙は，圧力負荷による物理的な 力により，細胞骨格に変化を生じた培養角膜内皮 細胞が正常形態を保持できなくなった結果出現し たものと考えられる． Svedbergはvervet monkeyの前房にreser− voirを接続し， reservoirの高さを調節すること により模擬的に眼圧を上昇させ，実験的緑内障眼 を作製した．Svedbergはこの実験系において眼 圧を33∼44mmHgに3∼7時間維持したところ， 角膜内皮に，細胞の平坦化，細胞表面の水胞化 （blebbing），細胞質の空胞化，核の脱落および内皮 細胞の脱落を観察している12）．またMelamedら は白兎の毛様体偏平部から硝子体にreservoirを 接続し，Svedbergと同様の方法により実験的緑 内障眼を作製した．この実験系において，60∼70mmHgの眼圧に15分∼4時間維持した眼球の角
膜内皮に，Svedbergの実験と同様の変化を認め， さらにmicrovilli， ciliaの減少，細胞表面の凹凸不 整，細胞質の裂隙が生じたと報告している13）．今回 の実験では，SvedbergやMelamedらの実験と比 較して，80mmHgという高い圧力を，長時間負荷 したにもかかわらず，核の脱落や細胞の脱落は認 められなかった．これは，緑内障眼における角膜 内皮細胞の形態変化が，眼圧上昇の直接的な影響 のみによって生ずるものではないことを示唆して いると思われる．Mortensenらは緑内障眼におけ る角膜内皮障害の原因として，眼圧上昇による前 房水の組成変化，毒性代謝産物の発生や低酸素状 態など二次的な環境因子の変化の影響を指摘して いる17＞．おそらくはこのような環境因子の変化が， 角膜内皮細胞のミトコンドリアのATP産生や細 胞内小器官の代謝を障害し，その結果細胞死を来 して細胞核や細胞が脱落するものと考えられた． 現在までの報告によると，閉塞隅角緑内障急性 発作時の角膜内皮障害の原因として，眼圧上昇そ のものによる影響より，眼圧上昇に伴う前房水の 性状変化をあげているものが多い6）∼8）u）．しかし， 緑内障眼の前房水性状や毒性代謝産物を直接分析 した報告はなく，どのような代謝産物が角膜内皮 細胞に悪影響を及ぼしているのか不明である．またいずれもが．in vivoでの検討であるため》眼圧 上昇に伴う二次的な要素を除いた，角膜内皮細胞 に対する眼圧上昇の直接的な影響についてぽ明ら か．にされていない．本実験で培養角膜内皮細胞に 圧力負荷を行った結果，その表面微細構造に変化 が認められたことより，緑内障眼においても同様 の機序から，眼圧上昇が角膜内皮の形態変化の原 因として直接的な影響を及ぼしている可能性があ ると考えられた． 今後，緑内障における角膜内皮障害の原因をよ り明らかにするためには，緑内障眼の前房水組成 や酸素分圧の測定，毒性代謝産物の解明とともに， これらの眼圧以外の因子の角膜内皮細胞に対する 影響を各々検討する必要があると考えられる． 結 語 1）緑内障眼における角膜内皮細胞に対する眼 圧の直接的な影響を推察するひとつのモデルとし て，．培養角膜内皮細胞を用いて圧力負荷（80 mmHg）を行い，位相差顕微鏡および走査半電子 顕微鏡を用いてその組織学的な変化について検討． した． 2）圧力負荷の結果，培養角膜内皮細胞の表面微 細構造に，microvilliの形態変化，細胞表面の凹凸 不整，細胞質の小裂隙などの変化が認められた． 3）緑内障眼における角膜内皮細胞の形態変化 の原因として，眼圧上昇が直接的な影響を及ぼす 一因である可能性が示唆された． 稿を終えるにあたり御校閲賜り．ました小暮美津子 教授に深甚なる謝意を表します．また直接御指導，御 校閲賜りました内田幸男名誉教授，中川 尚講師に心 より謝意を表します． 電子顕微鏡写真作製において御指導いただぎまし． た慶鷹義塾大学電子顕微鏡教室藤原達司先生に深謝 いたします． 文 献 1）三島済一：角膜内皮細胞層の生理と病理．日眼会 誌 77：1736−1759， 1973 2）Warning GO， Bourne WM， Edelhauser HF et a旦：The corneal endothelium． Normal and pathologic structure and function， Ophthalrnol・ ogy 89：531−590， 1982 3）Tuft SJ， Coster DJ： The． corneal endoth・ ehum． Eye 4二389−424，1990 4）Koester CJ， Roberts CW，・Donn A et al： Wide且eld specular microscopy． Ophthalmol− ogy 87：849−860， 1980 5）安田典子，清水 透，後藤田佳克ほか：緑内障限 における角膜内皮細胞の形態．第1報．原発性開 放隅角緑内障の角膜内皮細胞形態．臨眼43： 549−552， 1989 6）藤沢久美子，福田 薫，大久保潔：生体で眼圧上 昇が角膜内皮に与える影響．あたらしい眼科 6： 1709−1711， 1989 7）目谷風聡，中村昌弘，小原喜隆：緑内障眼の角膜 内皮障害の検討．西紀 43二306−310，1992 8）Bigar E Witmer R：Corneal endothelial changes in primary acute angle・closure glau− coma． Ophthalmology 89：596−599，1982 9） Set削a K： Corneal endothelial cell density after an attack of acte glaucoma， Acta Ophth− a11no157二1004−1G13， 1979 10）Malaise−Sta豊s J， Co璽lignon−Bmch J， Week6rs J： Corneal endothelial cell density in acute angle．closure glaucoma． Ophthalmologica 189：104−109， 1984 11）清水 透，安藤典子：急性原発閉塞隅角緑内障に おける角膜内皮障害．眼臨 84：493−496，1990 12）Svedberg B：Effects of arti丘cial intraocular pressure elevation on the corneal endotheliurn in vervet monkey． Acta Ophthalmol 53： 839−835， 1975 13）Melamed S， Ben・Sim I， Ben」Shaul Y：Cor・ neal endothelia璽 changes under induced intraocular pressure elevation． A scanning and transmission electron microscopic study in rab− bits． Br J Ophthalmol 64：164−169，1980 14）盛隆興，荻田洋二，中辻玲子：培養角膜内皮細 胞に対する薬物の影響．風紀 37：503−507，1986 15）Carter C， Easty DI∠： Corneal cell culture．1％ External Eye Disease（Easty EL ed）pp1−32， Butterworth， London（1985） 16）日本組織培養学会編：組織培養の技術．pp1−5， 朝倉出版，東京（1982） 17）Mortensen A， Spering S：Human corneal endothelial cell density after an in vitro im・ mitation of elevated intraocular pressure． Acta Ophthalmol 60：475−479，1982 18）Alberts B， Brau I）， Lewis J：細胞骨格．「細胞 の分子生物学 第2版」（中村桂子監修）pp613 −680，教育社，東京（1990） 19）Svedberg B， Bill A：Scanning electron micro． scopic studies of the corneal endothelium in man and monkeys． Acta Ophthalmol 50：
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